Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling In Vivo Ve In Vitro Tahliller

Bu prosedürün genel amacı, E 13 veya E 18 timik çökeltici progenitörler tarafından üretilen T hücrelerinin üretim ve sayılarının fenotip kinetiğini analiz etmektir. Bu, ilk olarak timik lobların E 13, E 14 ve E 18 fare embriyolarından izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, E 14 timik loblar ışınlanır ve daha sonra asılı bir damla içinde 48 saat boyunca akışla sıralanmış E 13 veya E 18 hücreleri ile kolonize edilir.

Son adımda, kolonize loblar, yetişkin CD üç nakavt faresinin böbrek kapsülü altına aşılanır. Sonuç olarak, akış sitometrisi, kimerik hayvanların kanında E 13 ve E 18 timik çökeltici progenitör soyunun varlığını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin, ine so hücreleri üzerinde in vitro T hücre kültürü gibi mevcut yöntemlerimizden en büyük avantajı, bu tekniğin, tanımlanmış progenitörlerden üç boyutlu bir tahlilde tam T hücresi olgunlaşmasına izin veren yöntemleri, sağlam alıcı farelerde timik organ organ kültürlerinin aşılanması ile birleştirmesi ve timik slik progenitörlerin ve döllerin farklılaşmasının ve fonksiyonunun değerlendirilmesine izin vermesidir.

Kemirgen cerrahisi uzmanlığına sahip bir araştırma mühendisi olarak, laminer akış başlığında aşılama deneyinden iki gün önce, hamile bir dişi farenin karnına %70 etanol ile ne olduğunu ve orta hatta deride uzunlamasına bir kesi yapacağını, kesiyi açmak için cildi ayıracağını ve ardından sindirim sistemine dokunmadan peritonu açmak için forseps ve makas kullanacağını göstereceğim. Ardından, bifid uterusu dışarı çekin ve vajinadan ayırmak için makas kullanın. Daha sonra uterusu 40 ila 50 mililitre DPBS içeren 90 x 15 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve her embriyonun desiduası arasında enine olarak kesin.

Her bir embriyoyu çıkarmak için plasenta ile yumurta sarısı kesesi arasındaki uterus kas zarını çıkarmak için bir çift ince uçlu makas ve ince forseps kullanın. Daha sonra embriyoları tutan amniyo çıkarın ve embriyoları HBSS artı% 1 FCS içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin. Timusu izole etmek için, embriyoları birer birer dürbün büyüteç merceğinin altına sırtüstü pozisyonda yerleştirin.

Daha sonra sternumun kıkırdağı boyunca uzunlamasına bir forseps yerleştirin ve kavisli forseps kullanarak torasik ızgarayı sıkıştırın ve açın. Trakeanın her iki tarafındaki timik lobları görselleştirmek için göğüs duvarını bir kenara çekin. Daha sonra, her bir lobu dikkatlice çıkarmak için timusun altına ince bir forseps ile sıkıştırın ve bunları bir mililitre HBSS ve% 1 FCS içeren bir Petri kabına yerleştirin.

Ardından, loblara zarar vermeden çevredeki bağ dokusunu çıkarmak için iki ince forseps kullanın. Daha sonra, fetal timik organ kültürü ışınlamasına başlamak için kırmızı kan hücrelerini ortadan kaldırmak için lobları üç mililitre HBSS artı% 1 FCS içinde yıkayın. E 14 timik lob, az önce gösterildiği gibi CD 45.2 embriyolarından izole edilmiştir.

Lobları yaklaşık üç saat dinlendirin. Daha sonra taze sıralanmış E 13 veya E 18 timik çökeltme progenitörlerini döndürün. Peletleri kültür ortamında, 35 mikrolitre ortam başına 500 hücrelik bir nihai konsantrasyona kadar yeniden askıya alın.

Daha sonra, 60 kuyulu bir terasaki plakasının diğer her bir oyuğuna 35 mikrolitrelik bir hücre süspansiyonu damlası yerleştirin ve her damlanın yüzeyine bir ışınlanmış lob yerleştirin. Plakayı kapatın ve hücrelerin yerçekimi ile damlanın apikal kutbuna ulaşmasını sağlamak için ters çevirin, lobları damlanın apikal kenarına kaymaya zorlamak için ters çevrilmiş plakanın üst tarafına hafifçe vurun. Daha sonra ters çevrilmiş plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 48 saat inkübe edin.

Timik loblar kolonize edildikten sonra, refleks yanıtı eksikliği ile alıcı hayvanın anestezi seviyesini doğrulayın. Daha sonra her göze bir damla göz merhemi sürün ve fareyi laminer akış başlığının altına sağ tarafına yerleştirin. Daha sonra arka bacak ekleminin hemen üzerindeki cerrahi alanı tıraş edin.

Daha sonra, bir çift steril eldiven yapın ve cerrahi alanı% 70 etanol ve% 10 IOD DY DER çözeltisi ile sterilize edin. Cilt dokusundan 1,5 santimetrelik bir kesi yapmak için bir neşter kullanın, ardından kas dokusundan bir kesi yapın. Şimdi böbreği karın boşluğundan dışarı çıkarmak için insizyonun her iki tarafına hafif bir baskı uygulayın ve böbreği tuzlu su çözeltisi ile nemli tutun.

Böbreği retroperitoneal boşluğun dışında bir pamuklu çubukla koruyun ve kapsülde iki ila üç milimetrelik bir delik açmak için iki ince forseps kullanın. Daha sonra kapsülün duvarını açık tutarak, böbrek direğinin kenarına doğru altı adede kadar timik lob greftini dikkatlice kaydırın ve böbreği retroperitoneal boşluğa geri yerleştirin. Kasın dikilmesi, bir nevroz ve ardından bireysel cerrah düğümleri ile cilt sütürü.

Daha sonra yarayı% 10 iyodür povidon çözeltisi ile ıslatın ve fareyi 37 santigrat derecelik bir ısıtma yastığına yerleştirin, kolonize progenitörlerin gelişimi için endojen timositleri tüketmek için en iyi yöntemi belirlemek için her ikisi de tamamen iyileşene kadar hayvan ve cerrahi yarayı izleyin. Bu deneyde, bir radyasyon veya beş günlük bir deoksi guine tedavisinden sonra kolonize bir timik lobdaki T hücresi sulandırma seviyeleri karşılaştırıldı. Kültürün dokuzuncu gününde kolonize lenfositlerin sayısında bir fark görülmezken, ışınlanmış loblar, 12. günde deoksi guine ile tedavi edilenlerden daha fazla T hücresi içeriyordu, bu da ışınlamayı timik kolonizasyondan sonra T hücresi gelişimini kolaylaştırmak için tercih edilen tedavi haline getirdi E 13 ve E 18 timik çökeltme progenitörlerinin gelişimsel potansiyelini incelemek için, E 14 ışınlanmış timik loblar, gözlemlendiği gibi iki tip progenitörden eşit sayıda ile kolonize edildi, E 13 timik çökeltme progenitörleri, E 18 timik çökeltme progenitörlerinden daha az timosit ve çift pozitif T hücresine yol açtı.

Bununla birlikte, olgun CD üç pozitif hücrelerin sıklığı arttırıldı ve dendritik epitelyal T hücrelerinin üretimi, E 13 ve E 18 timik çökeltme progenitörlerinin in vivo potansiyelini analiz etmek için sadece E 13 timik çökeltme progenitörlerinin döllerinde tespit edildi, her tip progenitör ile kolonize edilen timik loblar, CD üç nakavt alıcısının böbrek kapsülü altına aşılandı. Beklendiği gibi gösterildi. E 13 timik çökeltici progenitörler, E 18 progenitörlerinden daha hızlı bir şekilde T hücrelerine yol açtı, ancak dolaşımdaki T hücrelerinin sayısı genel olarak E 13 timik çökelen progenitör kolonize hayvanlarda önemli ölçüde daha düşüktü Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, gelişimsel immünoloji alanındaki araştırmacıların T hücresi alt kümesinin özelliklerini keşfetmesinin yolunu açtı, Bazıları bir memeli modelinde katı embriyonik kökenlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, Timex'in atalarını ve soylarını doğal bir ortamda, hatta rekabet koşullarında yerleştiren diferansiyel ve işlevsel yolların nasıl izleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.