Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling

Bu prosedürün genel amacı, E 13 veya E 18 timik yerleşim progenitorleri tarafından üretilen T hücrelerinin sayılarını ve fenotip kinetiğini analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle E 13, E 14 ve E 18 fare embriyolarından timik lobların izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, E 14 timik lobları ışınlanır ve ardından asılı damla yönteminde 48 saat boyunca akış sitometrisi ile ayrıştırılmış E 13 veya E 18 hücreleri ile kolonize edilir.

Son adımda, kolonize olmuş loblar yetişkin CD3 nakavt farelerin böbrek kapsülü altına greftlenir. Nihayetinde, kimera hayvanların kanında E 13 ve E 18 timik yerleşme progenitör progeny'lerinin varlığını değerlendirmek için akış sitometrisi kullanılabilir. Bu tekniğin, ine so hücreleri üzerinde in vitro T hücresi kültürü gibi mevcut yöntemlerimize göre temel avantajı; tanımlanmış progenitörlerden üç boyutlu bir analizde tam T hücresi olgunlaşmasına izin veren yöntemleri, timik organ kültürlerinin sağlam alıcı farelere greftlenmesiyle birleştirerek, timik dilim progenitörlerinin ve progeny'lerinin farklılaşmasının ve fonksiyonunun değerlendirilmesine olanak sağlamasıdır.

Kemirgen cerrahisi konusunda uzman bir araştırma mühendisi olarak, greftleme deneyinden iki gün önce laminer akışlı kabinde gerçekleştirilecek prosedürü göstereceğim; gebe bir dişi farenin karnını %70 ethanol ile temizleyin ve orta hattaki deride boyuna bir insizyon yapın, insizyonu açmak için deriyi kenara çekin ve ardından sindirim sistemine dokunmadan peritonu açmak için pens ve makas kullanın. Ardından, bifid uterusu dışarı çıkarın ve vajinadan ayırmak için makas kullanın. Daha sonra uterusu 40 ila 50 mililitre DPBS içeren 90 x 15 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve her embriyonun decidua bölgesi arasından transvers olarak kesin.

Plasenta ile vitellus kesesi arasından keserek her bir embriyoyu çıkarmak için ince uçlu bir makas ve ince pens kullanılarak uterusun kas membranı uzaklaştırılır. Ardından, embriyoları muhafaza ederek amniyon kaldırılır ve embriyolar %1 FCS içeren HBSS bulunan yeni bir Petri kabına yerleştirilir. Timusu izole etmek için embriyolar, binoküler büyüteç altında tek tek sırt üstü pozisyona getirilir.

Ardından, sternum kıkırdağı boyunca boylamsal olarak bir pens yerleştirin ve eğri pens kullanarak torasik kafesi sıkıştırıp açın. Trakeanın her iki yanındaki timus loblarını görüntülemek için göğüs duvarını yana çekin. Daha sonra, her bir lobu dikkatlice çıkarmak için timusun alt kısmını ince bir pens ile sıkıştırın ve lobları 1 mL HBSS artı %1 FCS içeren bir Petri kabına yerleştirin.

Ardından, loblara zarar vermeden çevre bağ dokusunu temizlemek için iki adet ince pens kullanın. Daha sonra, fetal timik organ kültürü ışınlamasına başlamak üzere, eritrositleri uzaklaştırmak için lobları 3 mL HBSS artı %1 FCS içerisinde yıkayın. E 14 timik lobları, az önce gösterildiği gibi CD 45.2 embriyolarından izole edilmiştir.

Lobları yaklaşık üç saat boyunca dinlendirin. Ardından, yeni ayrıştırılmış E 13 veya E 18 timik yerleşim öncüllerini santrifüjleyin. Peleti, 35 microliter ortam başına 500 hücrelik bir nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde kültür ortamında yeniden süspande edin.

Ardından, 60 kuyucuklu bir terasaki plakanın her iki kuyucuğuna 35 µL hücre süspansiyonu damlası yerleştirin ve her damlanın yüzeyine bir adet ışınlanmış lob ekleyin. Plakayı kapatın ve hücrelerin yerçekimi yardımıyla damlanın apikal kutbuna ulaşmasını sağlamak için ters çevirin; lobların damlanın apikal kenarına kaymasını zorlamak için ters çevrilmiş plakanın üst kısmına hafifçe vurun. Daha sonra ters çevrilmiş plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 48 saat boyunca 37 °C ve %5 CO2 koşullarında inkübe edin.

Timus lobları kolonize edildikten sonra, alıcı hayvanın anestezi seviyesini refleks yanıtının yokluğuyla doğrulayın. Ardından, her göze bir damla göz pomadı sürün ve fareyi laminer akışlı kabin altında sağ yanına yatırın. Daha sonra, arka bacak ekleminin hemen üzerindeki cerrahi alanı tıraş edin.

Ardından, bir çift steril eldiven giyin ve cerrahi alanı %70 etanol ve %10 povidon iyot çözeltisi ile sterilize edin. Kutanöz doku boyunca 1,5 santimetrelik bir insizyon yapmak için bir skalpel kullanın ve bunu kas dokusu boyunca yapılan bir insizyonla takip edin. Şimdi, böbreği abdominal kaviteden dışarı çıkarmak için insizyonun her iki yanına hafif bir basınç uygulayın ve böbreği salin çözeltisi ile nemli tutun.

Böbreği, retroperitoneal boşluğun dışında bir pamuklu çubukla sabit tutun ve kapsülde iki ila üç milimetrelik bir delik açmak için iki adet ince pens kullanın. Ardından, kapsül duvarını açık tutarak altı adede kadar timik lop greftini dikkatlice böbrek pol kenarına doğru kaydırın ve böbreği tekrar retroperitoneal boşluğa yerleştirin. Kasları tek tek cerrahi düğümlerle dikin ve ardından deri dikişini gerçekleştirin.

Ardından yarayı %10 povidone iyodür çözeltisi ile ıslatın ve fareyi 37 °C sıcaklıktaki bir ısıtma pedine yerleştirerek, kolonize olan progenitörlerin gelişimi için endojen timositlerin tüketilmesindeki en iyi yöntemi belirlemek amacıyla hayvan ve cerrahi yara tamamen iyileşene kadar izleyin. Bu deneyde, radyasyon veya beş günlük deoxy guine tedavisi sonrası kolonize edilmiş bir timik lobdaki T hücresi yeniden oluşum düzeyleri karşılaştırılmıştır. Kültürün dokuzuncu gününde kolonize olan lenfosit sayısında herhangi bir fark görülmezken, 12. günde ışınlanmış lobların deoxy guine ile tedavi edilenlere göre daha fazla T hücresi içerdiği saptanmış ve bu durum, timik kolonizasyon sonrası T hücresi gelişimini kolaylaştırmak için radyasyonun tercih edilen tedavi olmasını sağlamıştır; burada E 13 ve E 18 timik yerleşim progenitörlerinin gelişim potansiyelini incelemek için, E 14 ışınlanmış timik loblar gözlemlendiği üzere her iki progenitör tipinden eşit sayıda ile kolonize edilmiş ve E 13 timik yerleşim progenitörlerinin, E 18 timik yerleşim progenitörlerine kıyasla daha az timosit ve çift pozitif T hücresi oluşturtuğu görülmüştür.

Ancak, olgun CD3 pozitif hücrelerin frekansı artmıştı ve dendritik epitelyal T hücrelerinin üretimi sadece E 13 timik yerleşim progenitörlerinin soyunda tespit edildi; E 13 ve E 18 timik yerleşim progenitörlerinin in vivo potansiyelini analiz etmek için, her bir progenitör tipiyle kolonize edilmiş timik loblar, CD3 nakavt alıcıların böbrek kapsülü altına greftlendi. Az önce gösterildiği gibi, beklendiği üzere, E 13 timik yerleşim progenitörleri T hücrelerini E 18 progenitörlerinden daha hızlı oluşturdu, ancak dolaşımdaki T hücrelerinin sayısı genel olarak E 13 timik yerleşim progenitörü ile kolonize edilmiş hayvanlarda önemli ölçüde daha düşüktü. Gelişiminin ardından bu teknik, gelişimsel immünoloji alanındaki araştırmacıların, bazıları kesin olarak embriyonik kökenli olan T hücresi alt kümelerinin özelliklerini bir memeli modelinde keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, Timex çökelme progenitörlerinin ve bunların progenilerinin diferansiyel ve fonksiyonel yolaklarının hem doğal bir ortamda hem de rekabetçi koşullar altında nasıl izleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.