Sıçan Başkanı Branchiomeric Kaslar gelen İzolasyon ve Uydu Hücrelerinin Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, hücre dışı matris jel noktaları üzerinde kültüre edilmek üzere birinci, ikinci ve dördüncü brakiyal arklardan köken alan temsilci kaslardan uydu hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle genç yetişkin bir sıçanın masseter, digastrik ve levator veli palatini kaslarının diseksiyonu ile gerçekleştirilir.

İkinci adımda, her bir kas örneğindeki uydu hücreler enzimatik sindirim ve belirli bir süre ile izole edilir. Hücreler daha sonra hücre dışı matris jelleri üzerinde kültüre edilir. Son olarak, uydu hücre kültürlerinin miyogenezinin dinamik durumu, ilgili kas belirteçlerine yönelik boyama yoluyla takip edilebilir.

Dudak ve damak yarığı, insanlarda en yaygın görülen kraniofasiyal malformasyonlardan biridir. Bir yarık mevcut olduğunda, defekti kapatmak ve normal konuşma gelişimine olanak sağlamak için cerrahi onarım gereklidir; ancak fibroz ve kusurlu kas rejenerasyonu, yumuşak damak kaslarının fonksiyonel iyileşmesini engelleyebilir. Damak yarığı onarımı sonrası, sadece milimetre boyutundaki hücre dışı matris jel nokta kaplamalarını kullanarak, taze izole edilmiş satelit hücrelerin kültürü için yenilikçi bir yöntemi demonstre edebilirsiniz.

Bu, genişletme gereksinimini ortadan kaldırır. İzolasyondan bir gün önce, sekiz kuyucuklu oda slaytlarını 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve kabı soğuk bir yüzeye aktarın. 10 dakika sonra, önceden doldurulmuş bir mikro pipet kullanarak her bir kuyucuğa tek bir 10 µL hücre dışı matriks jeli damlası damlatın.

Slaytları yedi dakika daha soğuttuktan sonra kalan jeli tamamen temizleyin ve kuyucukları ertesi güne kadar gece boyunca 37 °C'de kurutun. Masseter kasını diseke etmek için, dokuz haftalık bir sıçanın başındaki deriyi kaldırın ve başı yan tarafına sabitlemek için hipodermik iğneler kullanın. Bir silikon ped üzerinde, parotis bezini ve fasiyal siniri izole edin ve bezi çıkarın.

Ardından, 15 numaralı bir bistüri ucu kullanarak fasiyal siniri dikkatlice uzaklaştırın. Masseter kasının yüzeysel başını tanımlayın. Daha sonra, düz bir penset kullanarak tendonu zigomatik proçesteki başlangıç noktasından ayırın ve ardından tendonu diseksiyon makasıyla dikkatlice kesin.

Skarpel kullanarak, masseter kasının yüzeysel başını, mandibula ramusunun açısında ve lateral yüzeyinin alt yarısındaki yapışma noktasına kadar diseke edin. Digastrik kasın posterior karnını diseke etmek için başı iğnelerle supin pozisyonda sabitleyin ve hem sublingual hem de submandibular bezlerin üzerindeki deri altı yağ dokusunu temizleyin. Anterior ve posterior digastrik kas karnlarını açığa çıkarın; ardından posterior karnın anterior tendonunu düz bir pensle tutarak, tendonun tympanic buller'daki başlangıç noktasına kadar dikkatlice diseke ederek kesin.

Levator veli palatini kasını diseke etmek için, stylohyoideus kasını lokalize edin. Kası lateral olarak çekin ve kas dokusunu dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, tympanic bulla'ya insert eden levator veli palatini tendonunu lokalize edin ve dikkatlice diseke edin.

Ardından özofagusu trakeanın arkasından kaldırın. Yumuşak damağın levator veli palatini kasının yerleştiği bölgeyi belirleyin ve kası kesin. Daha sonra kası %70 ethanol içine daldırın ve antibiyotiklerle desteklenmiş buz gibi soğuk PBS'ye aktarın.

Uydu hücreleri izole etmek için, her bir kası altı kuyucuklu bir plakadaki ayrı kuyucuklara aktarın ve dokuları iki milimetrelik küçük parçalara bölün. Kasları çok fazla parçalamamaya dikkat edin. Ardından, doku parçalarını her kuyucukta 2,5 ml 0,1% pronaz çözeltisi içinde, 37 °C'de, her 20 dakikada bir hafifçe çalkalayarak 60 dakika boyunca inkübe edin.

Lif demetleri gevşemiş bir görünüm sergilediğinde, her kuyucuğa at horseserumu ve antibiyotiklerle desteklenmiş 2.5 milliliters DMEM ekleyin ve sindirilmiş dokuları ayrı 15 milliliter konik tüplere aktarın. Doku bulamalarını santrifüjleyerek çöktürün ve süpernatantları dökün. Ardından, her tüpe beş milliliters besiyeri ekleyin ve dokuyu 10 milliliter plastik pipetle homojenize edin.

Dokuları tekrar santrifüjleyin ve süpernatantları yeni 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Ardından tüplere beş mililitre daha besiyeri ekleyin ve parçalar pipetten kolayca geçene kadar doku parçalarını tekrar trite edin. Bir başka santrifüj işleminin ardından süpernatantları uygun karşılık gelen tüplere çekin ve hücre süspansiyonlarını 40 mikrometrelik süzgeçler aracılığıyla ayrı 50 mililitrelik tüplere filtreleyin.

Maksimum hücre geri kazanımı için süzgeçleri 1 mL DMEM ile yıkayın. Ardından hücreleri santrifüjleyerek çöktürün, pelletleri taze besiyerinde yeniden süspande edin ve izole edilen satelit hücreleri kültüre etmek için hücre sayımı yapın. Sonrasında, hücre süspansiyonlarını 10 µL kültür besiyeri başına 1,5 × 10³ hücre olacak şekilde seyreltin.

Ardından, önceden hazırlanmış her bir hücre dışı matriks jel noktasına 10 µL hücre ekleyin ve jelleri 37 °C'de altı saat inkübe edin. Her bir jel noktasına dikkatlice 400 µL kültür medyumu ekleyin ve lamları inkübatöre geri yerleştirin. Üç gün sonra, izolasyonun hemen ardından uygun kültür medyumunu ekleyerek hücrelerin farklılaşmasını başlatın.

Taze izole edilen uydu hücrelerinin %90'ından fazlası Pax7 eksprese eder. Dördüncü güne gelindiğinde, tüm kas gruplarından alınan uydu hücreleri tarafından Pax7 ve MyoD eksprese edilir. Myogenin, yedinci günde tüm kas gruplarında yüksek düzeyde eksprese edilir. Ekstraselüler matriks jel noktalarına ekimden dört gün sonra, prolifere olan hücreler birleşmeye başlar ve yedinci ile onuncu günlerde miyozin ağır zincir eksprese eden küçük çok çekirdekli miyotüpler oluşturur.

10. güne gelindiğinde uzun ve iyi organize olmuş miyotüpler belirginleşir. Miyotüp seyirmeleri de gözlemlenebilir. Bu protokol, beyin baş kaslarından köken alan uydu hücrelerin incelenmesine olanak tanır ve yarık damak hastalarının tedavisi için yeni olasılıklar sunar.