Name: Sıçan Başkanı Branchiomeric Kaslar gelen İzolasyon ve Uydu Hücrelerinin Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Öğrenin sıçan baş kaslarından uydu hücre izolasyonu ve ekstraselüler matris jel üzerinde kültürleme yöntemini. Bu protokol miyogenez ve kas rejenerasyonu mekanizmalarını incelemek için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nden (NWO) bir Mozaik hibesi (017.009.009) ve AO Vakfı'ndan genç araştırmacılar için bir Start hibesi (S-13-167C) ile finanse edilmiştir. ZYR, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmektedir (hibe # AG021566, AG035377, NS090051).

Burada tarif Bütün deneyler Hollandalı yasa ve yönetmeliklere (RU-Aralık 2013-205) uyarınca Radboud Üniversitesi Nijmegen Hayvan Deneyleri Yerel Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Ekstrasellüler Matriks Jel Spotlar <ol><li> Izolasyon önce aşağıdaki adımları bir gün gerçekleştirin: <ol><li> En az 1.5 saat için 4 ° C&#39;de bir kısım hücre dışı matris jel (100 ul) çözülme. Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı içinde 1:10 seyreltilir; 4500 mg / L glikoz, 4 mM L-glutamin ve 110 mg / ml sodyum piruvat (DMEM) ile. Her zaman, 4 ° C &#39;de hücre dışı matris jel tutun. Not: ani ısı değişimleri homojen olmayan kaplama ve kristal oluşumu ile sonuçlanacaktır. </li><li> 15 dakika boyunca buz üzerinde seyreltilmiş hücre dışı matris jel çözeltisi tutun. </li><li> 10 dakika boyunca 20 ul mikropipet önceden soğuk. </li><li> 100 mm Petri kabı içine 8 oyuklu odasının slaytlar koyun ve 10 dakika boyunca soğuk bir yüzey (örneğin, bir dondurucu paket) üzerine yemek aktarın.</li><li> Her bir 10 ul hücre dışı matriks jeli bir damla koymak önceden soğutulmuş mikropipet kullanın. En az bir 7 dakika (Şekil 1A) soğuk bir yüzey üzerinde Petri tutun. </li><li> Tamamen geri kalan hücre dışı matris jel (Şekil 1B) kaldırmak ve bir gece boyunca 37 ° C&#39;de kuyu kurutun. </li></ol></li></ol> 2. Diseksiyon Başkanı kasları (Masseter, Digastrik ve levator Veli Palatini) <ol><li> Diseksiyon önce, fosfat tamponlu tuz çözeltisi,% 2 Penisilin-Streptomisin (P / S) ile desteklenmiş (PBS), 50 ml hazırlar. Buz üzerinde tutun. </li><li> CO 2 / O 2 ile bir genç erişkin sıçan (9 hafta) ötanazi sonra, başını başını kesmek ve kafa deri kaldırmak. Buz soğukluğunda PBS kafa aktarın 50 ml&#39;lik bir tüp içinde% 2, P / S ile takviye edilmiştir. </li><li> (1 brankial kemer türetilmiş) masseter kas <ol><li> Bir silikon pad üzerinde bir tarafı yukarı ile baş koyun ve derialtı n düzeltmekeedles (Şekil 2A). </li><li> Parotis bezi ve fasial sinir (Şekil 2A) tanımlayın. Bezi kapsayan derin fasya Açığa. Fasya kesin ve diseksiyon makas kullanılarak bezini çıkarın. Dış kulak yoluna tanımlayın. Stylomastoid foramenden yüz siniri Trace ve dikkatli bir neşter bıçağı sayılı 15, zamansal elmacık ve yanak dalları çıkarın. </li><li> Fasya kaldırarak masseter kas yüzeysel kafasını boşaltın. Masseter kas yüzeysel ve derin hem de kafaları tanımlayın. Maksilla elmacık sürecinde takılı kalın tendon aponeurosis kadar yüzeysel kafa Trace. </li><li> Düz forseps ile elmacık sürecinde kökeninden gelen tendon ayırın. Bir neşter bıçak sayılı 15 veya diseksiyon makas ve dikkatlice hayatın o (Şekil 2B) ile kesin. </li><li> Kendi açıyla yerleştirilmesi ve t alt yarısına kadar masseter yüzeysel kafa teşriho bir neşter bıçağı sayılı 15 (Şekil 2C) ile mandibulanın ramus yüzeyini yanal. Şimdi tamamen kas çıkarın. </li></ol></li><li> (2. brankiyal kemer türetilmiş) digastricus&#39;un arka göbek <ol><li> Silikon pad üzerinde yatar pozisyonda başını yerleştirin ve derialtı iğneler (Şekil 3A) ile sabitleyin. </li><li> Dilaltı ve submandibular bezlerin hem örten cilt altı yağ çıkarın. Sonraki yüzeysel fasya ve diseksiyon makas kullanılarak bezleri kaldırın. Digastrik kas (anterior ve posterior karın) Açığa. </li><li> Düz bir forseps ile arka karın ön tendonu tutun kesti ve timpanik bulla (Şekil 3B) aslına kadar dikkatlice incelemek. Karşı tarafta aynı yapın. </li></ol></li><li> (4th brankial kemer türetilmiş) levator veli palatini kas <ol><li> Digastricus&#39;un arka göbek diseksiyonu sonrasıYanal çekin, Stylohyoid kas lokalize ve dikkatle (Şekil 4A) çıkarın. </li><li> Timpanik bulla (Şekil 4A) de ekler levator veli palatini tendon yerelleştirilmesine. Dikkatle inceleyin ve her iki tarafta kesti. </li><li> Trakea ve arkasında çalışan yemek borusu arayın. Özofagus kaldırın ve yutak, gırtlak ve yumuşak damak maruz kalmaktadır. </li><li> Levator veli palatini takıldığında yumuşak damak alanını lokalize ve gevşek (Şekil 4B) kesti. Not: Doğrudan diseksiyonu sonrası, dikkatlice stereo mikroskop altında her kas tendon ve bağ doku kaldırmak. Etanol% 70 hızlı bir şekilde tüm örnekler daldırın ve buz gibi soğuk PBS aktarmak bir 15 ml tüp içinde% 2, P / S ilave. </li></ol></li></ol> Uydu Hücreleri 3. İzolasyon <ol><li> Kas 3 gruba SC izolasyonu için aşağıdaki hazırlık adımları gerçekleştirin: <ol><li>DMEM içinde% 0.1 Pronaz 7.5 ml hazırlayın. 0.22 um&#39;lik bir filtre ile solüsyon filtre. Izolasyondan önce, 10 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;da, çözelti önceden ısıtın. </li><li> Hazırlama% 10 at serumu (HS) ve% 1 P / S ile takviye edilmiş DMEM içinde 35 mi. Ayrıca ön-sıcak 37 ° C&#39;de bir su banyosu içinde. </li><li> % 20 fetal sığır serumu (FBS), 10% HS,% 1 P / S ve% 1 tavuk embriyo ekstraktı (CEE) ile desteklenmiş DMEM oluşur 15 ml kültür ortamı hazırlayın. Bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de sıcak bir ön. </li><li> Ön kaplama altı plastik pipetler kullanımdan önce en az 10 dakika boyunca HS ile (10 mi) ve kuru. </li></ol></li><li> Kültür kaput, 6-çukurlu plaka içinde bir kuyu içine, her kas aktarın. Diseksiyon makas kullanılarak, yaklaşık 2 mm küçük parçalar halinde kas kesti. Doku çok kıyma için dikkatli olun. </li><li> Dikkatli bir şekilde her kuyuya% 0.1 Pronaz çözeltisi 2.5 ml ilave edilir ve 60 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Yavaşça 20, 40 ve 60 dakika sonra plaka sallayın. Not: Tam duratioİnkübasyondan n hayvanların yaş ve gerginlik gibi faktörlere bağlıdır. </li><li> Mikroskop altında izleyin. Kas parçaları kontrol edin ve lifler demetleri bir gevşek görünüm (Şekil 5) olsun enzimatik sindirim durdurun. </li><li> DMEM 2.5 mi,% 10 HS ve% 1 P / S ilave ekleyin. 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de 15 ml&#39;lik bir tüp ve santrifüj tüpleri aktarın. Dekantasyon yoluyla süpernatant atın. </li><li> % 10 HS ve% 1 P / S ile desteklenmiş 5 ml DMEM ekleyin. Doku homojenize için yukarı ve aşağı bir 10 ml plastik pipet (öğütüldükten) ile en az 20 kez çözüm pipetle. </li><li> 4 dakika boyunca 200 x g&#39;de tüpler santrifüjleyin. Süpernatan toplamak ve 15 ml&#39;lik bir tüp içine aktarılır. </li><li> % 10 HS ve% 1 P / S ile desteklenmiş 5 ml DMEM ekleyin. Pipet tekrar doku parçaları kadar 10 ml plastik pipet pipet aracılığıyla kolayca geçer. </li><li> 4 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj tüpleri ve 15 ml bir tüp içinde supernatant toplamak. </li><li> P50 ml&#39;lik bir tüp üzerine hücre süzgeç (40 mikron) ut ve filtre üzerine ayrışmış hücreleri içeren süpernatant aktarın. Maksimal hücre kurtarma için 1 ml DMEM ile yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de tüpler Santrifüj ve bir pipet ile süpernatant atın. </li><li> 300 ul kültür ortamı içinde pelet yeniden süspanse edin ve bir hemositometrede hücreleri sayın. </li></ol> Ekstrasellüler Matriks Jel Spotlar Uydu Hücreleri 4. Farklılaşma <ol><li> Kültür ortamında 10 ml içinde 1.5 x 10 3 hücreleri elde etmek için bir hücre süspansiyonu ile seyreltilir. </li><li> Bantla odaları slaytlar kapakları Güvenli ve nesne camın alt tarafında siyah bir işaretleyici ile noktalar işaretleyin. </li><li> Bir mikropipet kullanarak, hücre dışı matris jel nokta üzerine 10 ul hücre süspansiyonu bir damla koydu. Hücre süspansiyonu damla yerinde doğru yerleştirilmiş olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin. 37 ° C&#39;de altı saat boyunca inkübe edin. </li><li> Dikkatlily kültür ortamında (% 20 FBS ile takviye edilmiş DMEM,% 10 HS,% 1 P / S ve% 1 OA) 400 ul ve 37 ° C&#39;de üç gün süre ile inkübe edilir. Not: Bu noktada, taze izole SC kitlesel travma (enzimatik sindirimi ve sert triturasyondan) tabi ve kurtarmak için ihtiyacı vardır. Ilk üç gün 37. Sonraki boyunca hücrelerin rahatsız etme, kültür ortamı, deney tipine bağlı olarak değiştirilebilir. hücre dışı matris jel lekeleri farklılaşma deneyinde yüksek bir hücre yoğunluğuna (1.5-2.5 x 10 3/20 ul) ile tohumlanır edilebilir. Kültür ortamı (DMEM% 20 FBS,% 10 HS,% 1 P / S ve% 1 tavuk embriyo ekstresi ile takviye edilmiş), her üç günde bir ikame edilmiş olabilir. </li><li> Genişleme ve geçen isteniyorsa Alternatif olarak, bir sonraki adımları izleyin: <ol><li> En az 1.5 saat için 4 ° C&#39;de bir kısım hücre dışı matris jel (500 ul) çözülme. DMEM 01:10 seyreltin ve nokta 1.1.1 önerileri uygulayın. </li><li> 4 ve 10 dakika boyunca 10 ml&#39;lik bir pipet önceden soğuk# 176; C. </li><li> 10 dakika boyunca soğuk bir yüzey (örneğin, bir dondurucu paket) üzerine üç adet T75 balonlarına aktarın. </li><li> Her balona 1 ml hücre dışı matriks jel koymak önceden soğutulmuş pipet kullanın. Yüzeyi tamamen kapalı olup olmadığını kontrol edin. En azından başka 7 dk (Şekil 1A) için soğuk yüzey üzerinde şişeler tutun. </li><li> Tamamen 10 ml pipet kalan hücre dışı matris jel kaldırmak ve 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de kuyu kurutun. </li><li> Sayılmasından sonra, kültür ortamı önceden kaplanmış T75 şişelerinde tohum (% 20 FBS,% 10 HS,% 1 P / S ve% 1 tavuk embriyo ekstresi ile takviye edilmiş DMEM), 10 ml taze izole edilmiş SC&#39;ler yeniden süspanse edin. </li><li> Üç gün sonra,% 80 izdiham kadar orta (ve her üçüncü gün) değiştirebilirsiniz ulaşılır. Geçirilmesi için PBS ile T75 balonlarına üç kez yıkayın. Sonraki 1 mL% 0.25 tripsin solüsyonu ekleyin ve 37 ° C&#39;de üç dakika boyunca inkübe edin. Kültür ortamının 9 ml içinde süspanse edin (DMEM,% 10 HS,% 1 P / S,% 20 FBS ile takviye edilmişve% 1 tavuk embriyo özü) ve 5 dakika 200 x g&#39;de santrifüje tabi tutun. Süpernatantı atın. Sayılmasından sonra, kültür ortamı 1000 ul içinde 1 x 10 6 hücre tekrar süspansiyon ve hücreler dondurma. </li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak çatışan çıkarları yoktur.

Farklı branchiomeric kafa kaslardan SC&#39;ler önce genişleme ve Pasajlanması olmadan tek 9 haftalık Wistar sıçan ve hücre dışı matris jel noktalar doğrudan kültüre izole edilmiştir. İzolasyondan sonra, hücreler sayılmış ve aynı hücre yoğunluğunda tohumlanır. Üç farklı kas paralel izolasyonu için, bu yöntem, yaklaşık 4 saat sürer. Kültür kirlenmesini önlemek için, kritik bir adımdır kasların diseksiyonu sonrası alkol% 70 hızlı yıkama olduğunu. SC izolasyonu sırasında küçük parçalar halinde kas dokusu (yaklaşık 2 mm) kesilmiş fakat bu, bir hücre hasarı küçük hücreli verimle sonuçlanacak şekilde çok Kıyma önlemek için önemlidir. Ayrıca, enzimatik sindirim süresi daha fazla zarar görmesini önlemek için mikroskop altında dikkatlice kontrol edilmelidir. sindirim amacı myofibers ayırmak olduğunu. İzole hücrelerin% 90&#39;ından fazlası Pax7 ifade için, başka bir saflaştırma (Şekil 6-8) gereklidir.Bu tür Percoll 39,40 üzerinde kaplanmamış yemekleri 14,37,38 öncesi kaplama, fraksiyon gibi diğer yöntemlerle ekstra arıtma adımlarını önler, fluorescent- veya manyetik veya hücre 41,43 sıralama. Toz haline için, bu SC&#39;ler mekanik serbest bırakılmasına izin doku parçaları ve pipet ucu açıklığı arasında kesme yaratmaması için gereklidir. (İç çapı: 1 mm), 10 ml bir pipet ile toz haline getirme durumunda zor, (İç çapı: 2 mm) 5 ml&#39;lik bir pipetten, ilk kullanılabilir. Seçenek olarak ise, bir cam Pasteur pipet arzu edilen çapta kesilebilir ve kullanılabilir. Bu yöntem, etkili basit ve farklı kas örnekleri SC eş zamanlı izolasyonu sağlar. SC&#39;ler için kültür plakaları da jelatin ya da kolajen ile kaplanmış olabilir, ama daha önceki çalışmalar, hücre dışı matris jel kollajen 38 daha miyojenik potansiyelinin korunması için çok daha iyi olduğunu göstermektedir. hücre dışı matriks jel noktalarmilimetre boyutu (10 ul / Ø 2 mm veya 20 ul / Ø 4 mm) çoğalması ve hücrelerin sınırlı sayıda olan SC&#39;ler farklılaşma çalışma sağlar. Farklılaşma deneyi için yaklaşık 8-20 kat daha az hücre, bir 24 oyuklu plaka (çap 15,6 mm) ile karşılaştırıldığında gereklidir ve daha az yaklaşık 80-200 kat 35 mm Petri kapları (çap: 35 mm) 14,38 ile karşılaştırıldığında. Hücre dışı matris jel pahalı olduğundan, bu yöntem aynı zamanda daha maliyet-etkin olduğunu. Buna ek olarak, bölmeli lamlar plastik örtü ile ikame edilmiş olabilir daha maliyetlerini azaltmak için kayar. Hücre dışı matriks jel hazırlanması için oda slaytlar gecede kurutma esastır görür. Hücre dışı matris jel noktalar saydam olarak, aydınlatma geri kullanılarak alt tarafındaki yeri işaretlemek için gereklidir. odaları slaytlar kolay manipülasyon için bir Petri kabındaki sabittir. Daha fazla hücre kültürü genişletme Smal SCS çalışma imkanı sunduğu gerekli değildir,kasları veya küçük kas örnekleri Ler. Seçenek olarak, PCR ya da kas için, örneğin daha fazla hücre gerekli ise, yukarıda belirtildiği gibi, yeni izole edilmiş SC&#39;ler ilk T75 şişelerinde genişletilebilir oluşturur. SC&#39;ler Bu protokol kullanılarak izole hemen sonra akış sitometrisi ile daha fazla saflaştırılması için uygun değildir izole edilmiştir. Pronaz ile sindirme yüzeyinin geniş sindirimi 14 antijenleri neden olur. Farklı lot numaraları farklı şekilde miyoblastlar proliferasyonunu ve farklılaşmasını etkilenen hücre kültürü için kullanılan at serumu ve fetal inek serumu ilk düzgün, izolasyondan önce, özelliği olmalıdır. Son yıllarda, brankial kemerler ve baş mezoderm (örneğin göz dışı kaslar) 24 türetilen kasların artan bir ilgi var. Açıkça baş ve bacak kasları çok farklı özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir. Eski hayvanlardan masseter kası yeniden görünüyorbacak kasları 25,26 ile karşılaştırıldığında onların rejeneratif kapasitesini tain. Göz dışı kaslarının gelen SC&#39;ler kafa kaslardan SC&#39;ler karşılaştırılabilir sağlam bir çoğalma ve farklılaşma kapasitesine sahip ve bacak kas SC&#39;ler 24 daha büyük engraftmınt potansiyeli gösteriyor. lif tipi dağılımı ve miyozin kompozisyonu, kas grupları arasında ve aynı zamanda türler arasında değişmektedir. İnsanlarda ilk branşiyal kemer kaynaklanan Kaslar kalp kası geliştirmek için tipik yavaş ve hızlı hem de lifler (alt tiplerini IIA ve IIX), yenidoğan miyosinler ve miyosinler içerirler. Kemirgenlerde bu kaslar yaklaşık% 95 hızlı lifler miyozin IIA ve IIb) 44-46 içerirler. Kuş kaslar üzerinde yapılan çalışmalar, farklı kas lifi türlerinden SC&#39;ler farklılaşma kapasitesi değişir olduğunu göstermektedir. Yavaş liflerden SC&#39;ler hem elyaf türleri 47 ayırt süre hızlı lifler SC&#39;ler sadece hızlı kas lifleri ayırt. Buna ek olarak, hızlı bir kas SC&#39;ler yüzdesilifler, düşük kas lifleri 48,49 daha düşüktür. Bu lif tipi dağılımı kraniofasyal alanda kasları üzerinde çalışmalar için dikkate alınması gerektiğini göstermektedir. Yarık damak kasları benzer kemirgenlerde LVP hızlı optikleri 50 neredeyse sadece içerir. Bu nedenle, LVP gelen SC&#39;ler yarık damak alanı içindeki ön-klinik çalışmalar için uygundur. Bu protokol branchiomeric baş kas veya diğer küçük kaslar veya daha küçük kaslar örneklerinden elde edilen SC&#39;ler incelemek için yeni imkanlar sunuyor. Bu tür yarık damak olarak değil, aynı zamanda daha küçük kasları etkileyen diğer koşullarda şartlarda maksillofasiyal bölgedeki kasların yenilenmesini artırmak için yeni tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır.

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52802">Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles</a>. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Yaklaşık 1: 500-1: 1000 yenidoğan dudak ve / veya damak (CLP) içeren yarık gösterirler; Böylece bu insanlarda 1 en sık doğumsal anomalidir. yumuşak damak kasları konuşma, yutma ve emme sırasında yumuşak damak işleyişi için kritik öneme sahiptir. Yumuşak damak yarık varsa, bu kaslar anormal damak kemiğinin arka ucuna yerleştirilir. yumuşak damak burundan kaçmak için havanın önlenmesi, konuşması sırasında yukarı ve aşağı hareket eder. Damakta bir yarık olan çocuklar velofaringeal disfonksiyonu 2,3 olarak bilinen bir fenomen sonuçlanan bu kontrol fonksiyonu yoktur. Tedavi protokolleri değişken olmasına rağmen, yumuşak damağın cerrahi onarımı erken çocukluk (yaş 6-36 ay) 4 gerçekleşir. yumuşak damak anormal eklenen kasları cerrahi 5-7 düzeltilebilir, ancak velofaringeal disfonksiyon% 30% 7 devamHastaların 2,3,8-10 evi. Uydu hücreleri (SCS) aksiyonu sayesinde yeniden oluşturmak için iskelet kası kabiliyeti de 11,12 kurulur. Kas hasarı üzerine, SCs aktive edilir ve yaralanma yerinde göç ederler. Daha sonra, çoğalırlar farklılaştırmak ve yeni myofibers veya onarım hasarlı olanları 13 oluşturmak için sigorta. Onların soyu, çoğalan miyoblastlar, ayrıca miyojenik belirleme faktörü 1 (MyoD) 16 ifade ederken hareketsiz SC&#39;ler, transkripsiyon faktörü Pax7 14,15 ifade eder. Farklılaşan miyoblastlar 17 (MyoG) myogenin ifade başlar. miyoblastların terminal farklılaşma myofibers oluşumu ve bu miyozin ağır zincir (MyHC) 16,18 kas özel proteinlerin ekspresyonu ile işaretlenir. Son zamanlarda, çeşitli stratejiler bacak kasları 19-23 kas rejenerasyonu arttırmak için rejeneratif tıpta kullanılmaktadır. Üzerine özel çalışmalarSon zamanlarda onlar çeşitli yönleriyle 24 diğer kasların farklı olduğu gösterilmiştir çünkü branchiomeric baş kasları da önemlidir. Bacak kaslarının aksine, bu branchiomeric kası az SC&#39;ler 25 içeren yavaş yeniden, daha lifli bir bağ dokusu, aynı zamanda, diğer transkripsiyon faktörlerini ifade branchiomeric kafası kaslardan SC&#39;ler çoğalan Buna ek olarak, yaralanma 26 sonrası meydana geldiği önerilmiştir. Örneğin, Tcf21 kraniofasiyel kas oluşumu için bir transkripsiyon faktörü kuvvetli baş kasları rejenere ancak pek bacak kasları 25 yenileyici olarak ifade edilir. CLP hastaların yumuşak damak kasları genellikle daha küçük ve daha az normal bir damak kasları 27,28 oranla iyi organize bulunmaktadır. Yavaş ve hızlı lifler hem yumuşak damak kasları mevcut ama yavaş lifler daha boldur. Buna karşılık, yarık kaslar da daha yüksek bir hızla liflerin oranı ve azaltılmış kılcal kaynağı ihtivaNormal yumuşak damak kasları 29-31 ile karşılaştırıldığında. Hızlı lifler daralma kaynaklı yaralanma 31-33 daha yatkındır. Ekteki kötü kılcal kaynağı da fibrozis 34,35 teşvik edebilir. Bütün bu yönleriyle cerrahi yarık kapatılması 36 sonra yumuşak damak kaslarının zayıf rejenerasyon katkıda bulunabilir. Bu göz önüne alındığında, branchiomeric baş kas SC&#39;ler izolasyonu ve karakterizasyonu için bir protokol önemlidir. Bu branchiomeric baş kasların SC biyolojisi okumak için imkanı sağlar. Buna ek olarak, doku mühendisliği dayalı yeni tedaviler CLP ve kraniofasial alanı ödün diğer koşullarda ameliyat sonrası kas rejenerasyonu teşvik etmek geliştirilebilir. Genel olarak, SCs kas dokusunun 14 ayırmadan sonra elde edilebilir. Kıyma, enzimatik sindirim, ve toz haline getirme genellikle niş SC&#39;ler serbest bırakmak için gereklidir. SC&#39;ler FR, kaplanmamış yemekler 14,37,38 ilgili ön plaka ile saflaştırılabiliractionation Percoll 39,40 tarihinde, fluorescent- veya manyetik veya hücre 41-43 sıralama. Burada genç erişkin sıçanların branchiomeric baş kasları uydu hücrelerin izolasyonu için yeni bir ekonomik ve hızlı bir protokol mevcut. Bu protokol daha önce el yazması 14 ve özellikle de küçük bir doku örnekleri için uyarlanmış dayanır. 1 st, 2 nci ve 4. branşiyal kemerlerin kaynaklanan temsili kaslar SC&#39;ler izolasyonu açıklanmıştır. İzolasyondan sonra, uydu hücreleri düşük sayıda kendi farklılaşma çalışma milimetre büyüklüğü hücre dışı matris jel noktalar üzerinde kültürlenmiştir. Bu yaklaşım, SC&#39;ler genişlemesi ve geçiş için gereksinimi ortadan kaldırır.

<table><tbody><tr><td>Hipodermik İğne 25&nbsp; G 0.5&nbsp; x&nbsp; 25&nbşk; m</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon makası</td><td>Braun</td><td>BC154R</td><td></td></tr><tr><td>Mikro forseps düz</td><td>Braun</td><td>BD330R</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Neşter Bıçağı No.&nbsp; 15</td><td>Swann-Morton</td><td>0205</td><td></td></tr><tr><td>Alkol %70</td> <td>Denteck</td><td>2,010,005</td><td></td></tr><tr><td>Permanox Slayt, 8 Odacıklı</td><td>Thermo Scientific</td><td>177445</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu hücre kültürü plakası</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Kapları (100 x 20 mm)</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>15 ml steril konik santrifüj tüpü</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml steril konik santrifüj tüpü</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci (40 &mu; m)</td> <td>Gibco</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serolojik pipet</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>20&nbsp; &mikro; l FT20</td><td>Greiner bio-one</td><td>774288</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, Fenol-Kırmızı İçermeyen</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>10&nbsp; KU</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium, yüksek glikoz, GlutaMAX Takviyesi, piruvat&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu&nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>3600511</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>At Serumu</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Tavuk Embriyo Ekstresi</td><td>MP Biyomedikal</td><td>2850145</td><td>20 ml</td></tr></tbody></table>

sıçan başkanı branchiomeric kaslar gelen İzolasyon ve uydu hücrelerinin karakterizasyonu

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibroz ve kusurlu kas rejenerasyonu, yarık damak onarımından sonra yumuşak damak kaslarının fonksiyonel iyileşmesini engelleyebilir. Bu, konuşma, yutma ve emmede kalıcı sorunlara neden olur. Kafa kaslarından alınan uydu hücrelerinin (miyojenik kök hücreler) incelenmesine izin veren in vitro kültür sistemleri, ameliyat sonrası kas yenilenmesini teşvik etmek için doku mühendisliğine dayalı yeni tedaviler geliştirmek için çok önemlidir. Bu sistemler, yarık damak hastalarının tedavisi için yeni bakış açıları sunacaktır. Uydu hücrelerinin kafa kaslarından izolasyonu, kültürü ve farklılaşması için bir protokol sunulmuştur. İzolasyon, uydu hücrelerini serbest bırakmak için enzimatik sindirim ve öğütmeye dayanır. Ek olarak, bu protokol, farklılaşma testleri için yalnızca az sayıda uydu hücresi gerektiren, milimetre boyutunda hücre dışı matris jel kaplamaları kullanan yenilikçi bir yöntem içerir.

Bu protokolü kullanarak, masseter kası (tek taraf) 0.8-1 x 10 6 hücre, digastrik kas (arka göbek) 1.5-2 x 10 5 hücre verimleri ve levator veli palatini kas verimi 1-1.5 x 10 5 hücre verir. Hücre verimleri hayvanın kas tipi, zorlanma ve yaş bağlıdır. Üç kas grupları arasında karşılaştırma için, yeni izole edilmiş SC&#39;ler aynı hücre yoğunluğu (1.5 x 10 3/10 ul) tohumlanmıştır. Doğrudan izolasyonundan sonra, yeni izole edilmiş hücrelerin% 90&#39;ından fazlası Pax7 (Şekil 6) ifade etmektedir. Gün 4, 7 ve 10 kültürleri Pax7, MyoD, MyoG ve MyHC immün karşı antikorlar ile boyandı. Beş rasgele alanları bir 20x objektif kullanarak kültür başına sayılmıştır. 4. günde Pax 7 ve Myo D tüm kas grupları olarak ifade edilir (Şekil 6 ve 7 ve 8), masseter ve digastrik kaslardan SATC nin ancak döl Expres başlarmyogenin önce levator veli palatini kası (Şekil 9) daha şarkı. 10. günde, MyoG sentezlenmesi güçlü Tüm gruplarda (Şekil 9) azalır. Birkaç gün hücre dışı matris jel noktalar üzerinde tohumlama sonra, hızla çoğalan hücreleri sigorta ve miyozin ağır zincir ifade eden çok çekirdekli miyotüpler, oluşmaya başlar. Küçük miyotüpleri günde 7 (Şekil 10) açıkça görebilir. 10. günde, miyotüplerinin seğirmesi (video 1) görülebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig1.jpg" /> Şekil 1:. Bir oda slayt Ekstraselüler matriks jel noktalar (A) kolay manipülasyon için, 100 mm Petri kabı içine 8-iyi odasının slayt yerleştirin. Pipet 10 ul hücre dışı matriks her odasında jel ve soğuk bir yüzeye (7 dk) üzerine koydu. (B) aşırı hücre dışı matris g sonrasında Odası slaytEl kaldırılır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52802/52802fig2.jpg" /> Şekil 2:. Lateral görünümde hayvanın maseter kası Diseksiyon (A) Baş. Kulak (E), parotis bezi (P) ve fasial sinir (VII). (B) maseter kası (Ms) ve temporal kas (T) yüzeysel kafasının tendineae aponevrozu (Te). Bir forseps ile ekleme gelen tendon ayırın. (C) dikkatlice mandibula ramus onun ekleme kadar kas teşrih. E: kulak, P: parotis, VII: fasial sinir, T: Temporal kas, Ms: masseter kas, Te yüzeysel başkanı: tendon, Mp: masseter kas derin başkanı. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52802/52802fig3.jpg" /> Şekil 3: digastricus&#39;un arka karın diseksiyonu (.Bir yatar pozisyonda hayvanın A) Başkanı. Submandibular bezi (Tr), masseter kası (M), fasial sinir (VII) ve SKM kas (SCM) yerelleştirilmesine. Submandibular bezi çıkarın. (B) digastrik kas anterior (AD) ve posterior karın (PD) yerelleştirilmesine. Düz forseps ile, arka karnının ön tendonu almak onu kesmek ve timpanik bulla (ty), aslına kadar dikkatlice incelemek. E: kulak, Sg: submandibular bez, VII: fasial sinir, M: masseter kası, SMC: sternocleidomastoid kas, AD: ön göbek digastrik kas, PD: arka göbek digastrik kas, Ty: Kulak bül. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52802/52802fig4.jpg" /> Şekil 4:. Levator veli palatini kas diseksiyonu (A) digastricus&#39;un (arka göbek) diseksiyonu sonrası genel görünümü. Stylohyoid kası (St) ve levator tendonveli palatini lokalize edilebilir. Bunun arkasında çalışan trakea (T) ve yemek borusu (Es) unutmayın. Trakea ve farenks (P) maruz yemek borusu kaldırılmasından sonra (B). yumuşak damak içine levator veli palatini sokulması artık görünür. ok her iki tarafta levator veli palatini kasları ile disseke yumuşak damak gösterir. E: kulak, St: Stylohyoid kas, VII: fasial sinir, M: masseter kası, AD: ön göbek digastrik kas, PD: arka göbek digastrik kas, T: trakea, Es: özofagus, P: Yutak, * levator veli palatini kası . <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52802/52802fig5.jpg" /> Şekil 5: Pronaz ile enzimatik sindirme önce sonra kas dokusunda (A) Görüntü ve (B). Kas demetleri enzimatik sindirimi sonra gevşetti gibi göründüğüne dikkat edin. Şekil 6: Pax 7 immün izolasyon sonunda hücre dışı matris jel tatbik Taze izole SC&#39;ler (yaklaşık 6 saat, ilk doku sindirilmesinden sonra).. Beş rasgele alanları alan başına 210 hücre ortalama 10X objektif kullanılarak sayıldı. Hücrelerin yaklaşık% 90 pozitif Pax 7 vardır. DAPI: mavi, Pax7: Kırmızı. Ölçek çubuğu, 100 mikron. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" width="700" /> Şekil 7:. Pax 7, MyoD immün Gün 4, 7 ve 10 kültürleri Pax7 karşı antikorlar ve MyoD immün boyandı. (A - C) ve (D - F) 4 gün arasında Temsil edici fotomikrografikler ve maseter kası 7 kültürleri. (G ve H </strong&gt;) Pax7 + ve MyoD + mikroskobik alan başına çekirdek sayısı sayılmış ve çekirdeklerin sayısı (DAPI) bir yüzdesi olarak ifade edildi. DAPI: mavi, Pax7: kırmızı, ve MyoD: yeşil. Ölçekler bar, 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" width="700" /> Şekil 8:. Masseter, digastrik ve levator veli palatin kas kültürlerde tek çekirdekli hücrelerden kültürlerinde Pax7 ± / MyoD ± dağılımı (A - C) Gün 4, 7 ve 10 kültürleri Pax7 karşı antikorlar ve MyoD immün boyandı. Toplam hücre sayısı, çekirdeklerin sayısı (DAPI) dayanmaktadır. (D) cel ± Pax7 ± / myod Veri ölçümüls. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 9," src="/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" width="700" /> Şekil 9:. Myogenin immün Gün 4, 7 ve 10 kültürleri Myogenin karşı antikorlar ile boyandı. (A - D) Temsili günde 4 fotomikrografları ve levator veli palatin kası 7 kültürler. (E) MyoG + mikroskobik alan başına çekirdek sayısı sayılmış ve çekirdeklerin sayısı (DAPI) bir yüzdesi olarak ifade edildi. MyoG + hücreleri (F) veri miktar. DAPI: mavi, Myogenin: yeşil. Ölçekler bar, 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" target="_blank">Bu figur büyük halini görmek için tıklayınız</a>e. <img alt="Şekil 10," src="/files/ftp_upload/52802/52802fig10.jpg" /> Şekil 10:. Miyozin ağır zincir immün Gün 4, 7 ve 10 kültürleri miyozin ağır zincir (MyHC) karşı antikorlar ile boyandı. Temsili günde 4, 7 fotomikrografları ve digastrik (DIG) kas 10 kültürler. Günde 10 uzun ve iyi organize miyotüpleri belirgin iken 7. günde, küçük miyotüpleri mevcuttur. Ölçekler bar, 200 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Video 1.:. Miyotüp seğirmesi seğirmesi miyotüplerinin iki temsilci alanların örnekleri günü için digastricus&#39;un 10 kültürleri gösterilir <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/Video1.mpg" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Bu protokol, 9 haftalık farenin branchiomeric merkez kas uydu hücreleri izolasyonunu anlatmaktadır. kaslar, farklı brankiyal kemerlerin kaynaklanmaktadır. Daha sonra, uydu hücreleri farklılaşma çalışma milimetre boyutta bir Noktası kaplama üzerinde kültürlenmiştir. Bu yaklaşım, uydu hücrelerinin genişleme ve pasajlanmasını önler.

Sıçan Başkanı Branchiomeric Kaslar gelen İzolasyon ve Uydu Hücrelerinin Karakterizasyonu

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Bu prosedürün genel amacı, hücre dışı matris jel noktaları üzerinde kültüre edilmek üzere birinci, ikinci ve dördüncü brakiyal arklardan köken alan temsilci kaslardan uydu hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle genç yetişkin bir sıçanın masseter, digastrik ve levator veli palatini kaslarının diseksiyonu ile gerçekleştirilir.İkinci adımda, her bir kas örneğindeki uydu hücreler enzimatik sindirim ve belirli bir süre ile izole edilir. Hücreler daha sonra hücre dışı matris jelleri üzerinde kültüre edilir. Son olarak, uydu hücre kültürlerinin miyogenezinin dinamik durumu, ilgili kas belirteçlerine yönelik boyama yoluyla takip edilebilir.Dudak ve damak yarığı, insanlarda en yaygın görülen kraniofasiyal malformasyonlardan biridir. Bir yarık mevcut olduğunda, defekti kapatmak ve normal konuşma gelişimine olanak sağlamak için cerrahi onarım gereklidir; ancak fibroz ve kusurlu kas rejenerasyonu, yumuşak damak kaslarının fonksiyonel iyileşmesini engelleyebilir. Damak yarığı onarımı sonrası, sadece milimetre boyutundaki hücre dışı matris jel nokta kaplamalarını kullanarak, taze izole edilmiş satelit hücrelerin kültürü için yenilikçi bir yöntemi demonstre edebilirsiniz.Bu, genişletme gereksinimini ortadan kaldırır. İzolasyondan bir gün önce, sekiz kuyucuklu oda slaytlarını 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve kabı soğuk bir yüzeye aktarın. 10 dakika sonra, önceden doldurulmuş bir mikro pipet kullanarak her bir kuyucuğa tek bir 10 µL hücre dışı matriks jeli damlası damlatın.Slaytları yedi dakika daha soğuttuktan sonra kalan jeli tamamen temizleyin ve kuyucukları ertesi güne kadar gece boyunca 37 °C'de kurutun. Masseter kasını diseke etmek için, dokuz haftalık bir sıçanın başındaki deriyi kaldırın ve başı yan tarafına sabitlemek için hipodermik iğneler kullanın. Bir silikon ped üzerinde, parotis bezini ve fasiyal siniri izole edin ve bezi çıkarın.Ardından, 15 numaralı bir bistüri ucu kullanarak fasiyal siniri dikkatlice uzaklaştırın. Masseter kasının yüzeysel başını tanımlayın. Daha sonra, düz bir penset kullanarak tendonu zigomatik proçesteki başlangıç noktasından ayırın ve ardından tendonu diseksiyon makasıyla dikkatlice kesin.Skarpel kullanarak, masseter kasının yüzeysel başını, mandibula ramusunun açısında ve lateral yüzeyinin alt yarısındaki yapışma noktasına kadar diseke edin. Digastrik kasın posterior karnını diseke etmek için başı iğnelerle supin pozisyonda sabitleyin ve hem sublingual hem de submandibular bezlerin üzerindeki deri altı yağ dokusunu temizleyin. Anterior ve posterior digastrik kas karnlarını açığa çıkarın; ardından posterior karnın anterior tendonunu düz bir pensle tutarak, tendonun tympanic buller'daki başlangıç noktasına kadar dikkatlice diseke ederek kesin.Levator veli palatini kasını diseke etmek için, stylohyoideus kasını lokalize edin. Kası lateral olarak çekin ve kas dokusunu dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, tympanic bulla'ya insert eden levator veli palatini tendonunu lokalize edin ve dikkatlice diseke edin.Ardından özofagusu trakeanın arkasından kaldırın. Yumuşak damağın levator veli palatini kasının yerleştiği bölgeyi belirleyin ve kası kesin. Daha sonra kası %70 ethanol içine daldırın ve antibiyotiklerle desteklenmiş buz gibi soğuk PBS'ye aktarın.Uydu hücreleri izole etmek için, her bir kası altı kuyucuklu bir plakadaki ayrı kuyucuklara aktarın ve dokuları iki milimetrelik küçük parçalara bölün. Kasları çok fazla parçalamamaya dikkat edin. Ardından, doku parçalarını her kuyucukta 2,5 ml 0,1% pronaz çözeltisi içinde, 37 °C'de, her 20 dakikada bir hafifçe çalkalayarak 60 dakika boyunca inkübe edin.Lif demetleri gevşemiş bir görünüm sergilediğinde, her kuyucuğa at horseserumu ve antibiyotiklerle desteklenmiş 2.5 milliliters DMEM ekleyin ve sindirilmiş dokuları ayrı 15 milliliter konik tüplere aktarın. Doku bulamalarını santrifüjleyerek çöktürün ve süpernatantları dökün. Ardından, her tüpe beş milliliters besiyeri ekleyin ve dokuyu 10 milliliter plastik pipetle homojenize edin.Dokuları tekrar santrifüjleyin ve süpernatantları yeni 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Ardından tüplere beş mililitre daha besiyeri ekleyin ve parçalar pipetten kolayca geçene kadar doku parçalarını tekrar trite edin. Bir başka santrifüj işleminin ardından süpernatantları uygun karşılık gelen tüplere çekin ve hücre süspansiyonlarını 40 mikrometrelik süzgeçler aracılığıyla ayrı 50 mililitrelik tüplere filtreleyin.Maksimum hücre geri kazanımı için süzgeçleri 1 mL DMEM ile yıkayın. Ardından hücreleri santrifüjleyerek çöktürün, pelletleri taze besiyerinde yeniden süspande edin ve izole edilen satelit hücreleri kültüre etmek için hücre sayımı yapın. Sonrasında, hücre süspansiyonlarını 10 µL kültür besiyeri başına 1,5 × 10³ hücre olacak şekilde seyreltin.Ardından, önceden hazırlanmış her bir hücre dışı matriks jel noktasına 10 µL hücre ekleyin ve jelleri 37 °C'de altı saat inkübe edin. Her bir jel noktasına dikkatlice 400 µL kültür medyumu ekleyin ve lamları inkübatöre geri yerleştirin. Üç gün sonra, izolasyonun hemen ardından uygun kültür medyumunu ekleyerek hücrelerin farklılaşmasını başlatın.Taze izole edilen uydu hücrelerinin %90'ından fazlası Pax7 eksprese eder. Dördüncü güne gelindiğinde, tüm kas gruplarından alınan uydu hücreleri tarafından Pax7 ve MyoD eksprese edilir. Myogenin, yedinci günde tüm kas gruplarında yüksek düzeyde eksprese edilir. Ekstraselüler matriks jel noktalarına ekimden dört gün sonra, prolifere olan hücreler birleşmeye başlar ve yedinci ile onuncu günlerde miyozin ağır zincir eksprese eden küçük çok çekirdekli miyotüpler oluşturur.10. güne gelindiğinde uzun ve iyi organize olmuş miyotüpler belirginleşir. Miyotüp seyirmeleri de gözlemlenebilir. Bu protokol, beyin baş kaslarından köken alan uydu hücrelerin incelenmesine olanak tanır ve yarık damak hastalarının tedavisi için yeni olasılıklar sunar.

isolation-characterization-satellite-cells-from-rat-head

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, uydu hücrelerinin sıçan başı dallıyomerik kas dokularından doku diseksiyonu, enzimatik sindirim ve ardından mekanik ve santrifüj saflaştırma yoluyla izolasyonunu göstermektedir. Hücreler daha sonra miyoblastlara ve sonunda miyotüplere ve olgun kas liflerine farklılaşmak için hücre dışı matris kaplı kuyucuklara ekilir.

Sıçan Başı Kas Dokusundan Uydu Hücrelerini İzole Etmek İçin Bir Teknik

Myofibers izolasyonu ve kültürü altın...

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Vitro kültürü sistemleri omurgalı Miyogenesis anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmıştır. Ancak, çok özellikle bazal taksa içinde, memeli olmayana iskelet kas gelişimi ve büyüme öğrendi gerekmektedir. Bu doku, kas kaynaklı öncü hücreleri (MPCs) yetişkin kök hücrelerin izole edilmesi ve bir birincil kültür ortamda kendi kendini yenileme, proliferasyon ve farklılaşma korumak için etkili ve güçlü bir protokol boyunca korunmuş ve farklı düzenleyici mekanizmaların tanımlanması için sağlar: omurgalı...

Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Burada, insan miyoblastlarının saf bir popülasyonunu yetişkin kas dokusundan elde etmek için bir metodoloji tarif ederiz. Bu hücreler, in vitro iskelet kası diferansiasyonunu incelemek ve özellikle Ca 2+ sinyallemeyle ilgili proteinleri incelemek için kullanılırlar.

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

Uydu hücreleri hassas tanımlaması işlevlerini çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullarda çalışmak için esastır. Bu makale ayirt tabanlı boyama tarafından uydu hücreleri yetişkin iskelet kas bölümlerinde tanımlamak için bir protokol sunar.

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Burada, homozigot mutant Lamin Δ8-11 fare modeli, Emery-Dreifuss kas distrofisi (EDMD) için çok ciddi bir model erken doğum sonrası gelişim aşamalarında verimli bir şekilde tek kas lifleri elde etmek için bir yöntem öneriyoruz.

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Bu protokol, kas kök hücrelerinin ve fibro-adipojenik progenitörlerin farelerde bireysel iskelet kaslarından izolasyonunu tanımlar. Protokol, tek kas diseksiyonu, floresan aktive hücre sıralama ile kök hücre izolasyonu, immünofloresan boyama ile saflık değerlendirmesi ve 5-etinil-2'-deoksiüridin dahil etme testi ile S-faz girişinin kantitatif ölçümünü içerir.

Sessiz Kök Hücre Popülasyonlarının Bireysel İskelet Kaslarından İzolasyonu

Burada sunulan, fare uzuv kas uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) izolasyonu için, hedeflerin altında bölünme ve nükleaz (CUT &amp;RUN) kullanılarak salım yoluyla kas liflerinde transkripsiyon regülasyonu çalışmasına uyarlanmış etkili bir protokoldür.

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&amp;RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Bu protokol, yetişkin ve yenidoğan fare iskelet kaslarından birincil miyoblastların doku ayrışması, ardışık filtrasyon, ön kaplama ve tanımlanmış kültür koşulları yoluyla izole edilmesi ve zenginleştirilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sunar; böylece uydu hücresinden türetilen miyoblast kültürlerinin sonraki deneysel uygulamalar için oluşturulması ve bakımı mümkün olur.

In vitro miyogenez çalışmaları için iskelet kası uydu hücrelerinin izolasyonu

Öğrenin sıçan baş kaslarından uydu hücre izolasyonu ve ekstraselüler matris jel üzerinde kültürleme yöntemini. Bu protokol miyogenez ve kas rejenerasyonu mekanizmalarını incelemek için güvenilir bir model sunar.

Sıçan Başkanı Branchiomeric Kaslar gelen İzolasyon ve Uydu Hücrelerinin Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet