Sıçan Başkanı Branchiomeric Kaslar gelen İzolasyon ve Uydu Hücrelerinin Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, uydu hücrelerini, hücre dışı bir matris üzerindeki kültürleri için birinci, ikinci ve dördüncü brakiyal arklardan kaynaklanan temsili kaslardan izole etmektir. Jel lekeleri. Bu, ilk önce genç bir yetişkin sıçanın katliam, digastrik ve levada vli palatin kaslarının diseke edilmesiyle gerçekleştirilir.

İkinci adımda, her bir kas örneğinden alınan uydu hücreleri enzimatik, sindirim ve süre ile izole edilir. Hücreler daha sonra hücre dışı matriks jelleri üzerinde kültürlenir. Sonuç olarak, uydu hücre kültürlerinin dinamik miyogenez durumu, ilgilenilen kas belirteçleri için boyama yoluyla izlenebilir.

Yarık dudak ve damak, insanlarda en sık görülen c kraniyofasiyal malformasyonlarından biridir. Bir yarık mevcut olduğunda, kusuru kapatmak ve normal bir konuşma gelişimine izin vermek için cerrahi onarım gereklidir, Fibroz ve kusurlu kas Rejenerasyonu, bununla birlikte, yumuşak damak kaslarının fonksiyonel iyileşmesini engelleyebilir. Yarık damak onarımından sonra, sadece milimetre boyutunda ekzo hücresel matris jel spot kaplamalar kullanarak yeni izole edilmiş uydu hücrelerinin kültürü için yenilikçi bir yöntem gösterebilirsiniz.

Bu, genişleme gereksinimini ortadan kaldırır. Bu hücrelerin ve bu hücrelerin izolasyondan bir gün önce sekiz kuyulu hazneyi 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve çanağı soğuk bir yüzeye aktarın. 10 dakika sonra, her bir oyuğa 10 mikrolitrelik tek bir hücre dışı matris jel damlası dağıtmak için önceden doldurulmuş bir mikro pipet kullanın.

Slaytları yedi dakika daha soğuttuktan sonra, kalan jeli tamamen çıkarın ve ertesi gün gece boyunca kuyuları 37 santigrat derecede kurutun. Katliam kasını incelemek için, dokuz haftalık bir sıçanın kafasındaki cildi çıkarın ve kafayı yan tarafına sabitlemek için hipodermik iğneler kullanın. Silikon bir ped üzerinde parotis bezini ve fasiyal siniri izole edin ve bezi çıkarın.

Daha sonra, 15 numaralı bir neşter bıçağı kullanarak, yüz sinirini dikkatlice çıkarın. Masseter kas kasının yüzeysel başını tanımlayın. Daha sonra, elmacık işleminde tendonu kökeninden ayırmak için düz bir forseps kullanın, ardından tendonun diseksiyon makası ile dikkatli bir şekilde kesilmesini izleyin.

Neşter kullanarak, katliamın yüzeysel başını, mandibula ramusunun yan yüzeyinin açısına ve alt yarısına yerleştirilene kadar inceleyin. Digastrik kasın arka göbeğini incelemek için, başı iğnelerle sırtüstü pozisyonda sabitleyin ve hem dil altı hem de alt mandibular bezlerin üzerindeki deri altı yağını çıkarın. Ön ve arka di mide kası karınlarını açığa çıkarın, ardından arka göbeğin ön tendonunu düz bir forseps ile tutarak kesin, tendonu timpanik bullerdeki kökenine dikkatlice inceleyin.

Levada vli palatino kasını incelemek için stylo halloid kasını lokalize edin. Yanlamasına çekin ve kas dokusunu dikkatlice çıkarın. Daha sonra, timpanik bulleri yerleştiren levada vli palatino'nun tendonunu lokalize edin ve dikkatlice inceleyin.

Daha sonra yemek borusunu soluk borusunun arkasından kaldırın. Levada vli damağın yerleştirildiği yumuşak damak bölgesini belirleyin ve kası gevşetin. Daha sonra kası% 70 etanole batırın ve antibiyotiklerle takviye edilmiş buz gibi soğuk PBS'ye aktarın.

Uydu hücrelerini izole etmek için, her bir kası altı oyuklu bir plakanın ayrı ayrı kuyucuklarına aktarın ve dokuları küçük iki milimetrelik parçalar halinde kesin. Kasları çok fazla kıymamaya özen gösterin. Daha sonra, doku parçalarını her 20 dakikada bir hafifçe çalkalayarak 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede oyuk başına 2.5 mililitre% 0.1 pronaz çözeltisi içinde dikkatlice inkübe edin.

Lif demetleri olduğunda, her bir oyuğa at serumu ve antibiyotiklerle takviye edilmiş 2.5 mililitre DMEM'de gevşemiş bir görünüm sergiler ve sindirilmiş dokuları ayrı ayrı 15 mililitrelik konik tüplere aktarır. Doku bulamaçlarını aşağı doğru döndürün ve süpernatanları boşaltın. Daha sonra her tüpe beş mililitre ortam ekleyin ve dokuyu 10 mililitrelik plastik bir pipetle homojenize edin.

Dokuları tekrar döndürün ve süpernatanları yeni 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Daha sonra tüplere beş mililitre daha orta ekleyin ve parçalar pipetten kolayca geçene kadar doku parçalarını tekrar üç kez sıkılaştırın. Başka bir santrifüjlemeden sonra, süpernatanları uygun karşılık gelen tüplere çekin ve hücre süspansiyonlarını 40 mikrometre süzgeçlerden ayrı ayrı 50 mililitrelik tüplere süzün.

Maksimum hücre geri kazanımı için süzgeçleri bir mililitre DMEM ile yıkayın. Daha sonra hücreleri döndürün, peletleri taze, orta derecede yeniden süspanse edin ve izole edilmiş uydu hücrelerini kültürlemek için hücreleri sayın. Daha sonra, hücre süspansiyonlarını 10 mikrolitre kültür ortamı başına üç hücreye 1.5 kez 10 kez seyreltin.

Daha sonra önceden hazırlanmış her bir hücre dışı matris jel noktasına 10 mikrolitre hücre ekleyin ve jelleri altı saat sonra 37 santigrat derecede inkübe edin. Her jel noktasına dikkatlice 400 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve slaytları inkübatöre geri koyun. Üç gün sonra, izolasyondan hemen sonra uygun kültür ortamının eklenmesiyle hücrelerin farklılaşmasını başlatın.

Yeni izole edilmiş uydu hücrelerinin% 90'ından fazlası yedinci paketi eksprese eder Dördüncü günde, yedinci paket ve MyoD, tüm kas gruplarından gelen uydu hücreleri tarafından eksprese edilir. OG'm tüm kas gruplarında yedinci günde yüksek oranda ifade edilir. Hücre dışı matriks üzerine tohumlamadan dört gün sonra, jel lekeleri, çoğalan hücreler kaynaşmaya başlar ve yedi ve 10. günlerde miyozin ağır zincirini eksprese eden küçük çok çekirdekli miyo tüpleri oluşturur.

Uzun ve iyi organize edilmiş miyo tüpleri 10. günde belirgindir. Myo tüp seğirmesi de görülebilir. Bu protokol, baş kaslarından köken alan uydu hücrelerinin incelenmesine olanak tanır ve yarık pal tedavisi için yeni olanaklar sunar. Hasta.