Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Bu prosedürün genel amacı, aşıya özgü adaptif bağışıklığın fizyolojik başlangıcını değerlendirmek için bir sistemi tanımlamaktır. Bu, ilk olarak, spesifik bir immünojenik peptit içeren canlı, zayıflatılmış grip aşıları üretmek için ters genetik kullanılarak ve daha sonra virüsü çoğaltmak için bir civciv embriyosu kullanılarak gerçekleştirilir. Daha sonraki hücreler aşılanmış farelerin lenf düğümlerinden toplanır ve dendritik hücre göçünü izlemek için faks analizi kullanılır.

Bir sonraki tahlilde, immünojenik peptide reaktif olan CD sekiz pozitif T hücresi etiketlenir ve aşılanmış farelere enjekte edilir, ardından bağışıklık tepkisini daha ayrıntılı olarak analiz etmek için bu hücrelerin proliferasyonunu ölçmek için faks analizi yapılır. Rekabetçi bir kemik iliği çanı aynası, kemik iliği hücrelerini eksprese eden dipteri toksin reseptörünün ışınlanmış konjenik farelere infüze edilmesiyle yapılır ve bunlar daha sonra dipteri toksinine maruz bırakılır. Başarılı bir tükenmeden sonra, fare aşılanır ve CD sekiz pozitif T hücresini tanımlamak için antikorlar ve tetramerler etiketlenir.

Spesifik peptidi tanımak. Bu yöntem, bir aşının nörolojik düzeyde nasıl çalıştığı, aşının ana hücresel ve moleküler hedefleri olduğu ve en önemlisi mevcut profilaktik stratejileri nasıl geliştirebileceğimiz gibi aşı bilimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü gösteren Sanmen Medina olacak.

Laboratuvar yöneticimiz ve ben Bu protokol için, soğuğa uyarlanmış suşu kullanarak yeniden çeşitlendirilmiş soğuk algınlığına uyarlanmış bir grip aşısı oluştururuz. Bir Ann Arbor altı 60. Arka plan olarak hemaglutinin ve A PR 8 34 suşunun modifiye edilmiş bir nöraminidazı ile birleştiğinde.

Nöraminidaz geninin protein sapı dizisinin bir kısmı, tavuk peptidi syn fekal'i kodlayan kısa bir CDNA dizisi ile değiştirilir. Bu peptit, H iki BMHC sınıfında yüksek oranda immünobaskındır. C 57 siyah altı farenin kısıtlı bir tepkisi ve izlenebilir bir eleman olarak işlev görür.

Başlamak için plaka 1, 000, 002 % 10 fetal sığır serumu ve% 1 pen strep içeren DMEM ile altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 93 T hücresi. Daha sonra, kuyucuk başına 100 mikrolitre için yeterli plazmid transfeksiyon karışımı hazırlayın. Her plazmidin bir mikrogramını birleştirin ve tüpü başka bir tüpte 50 mikrolitreye kadar önceden ısıtın opti MEM hücre ortamı ile doldurun.

Transfekte edilecek toplam plazmit miktarına karşılık gelen lipektomi hacminin 2000 iki katını ekleyin ve transfeksiyon karışımını hücrelere eklemeden önce tüpü opti MEM ile 50 mikrolitreye kadar doldurun. Oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Daha sonra her bir oyuğa 100 mikrolitre transfeksiyon karışımı ekleyin ve plakayı 16 saat boyunca bir inkübatöre taşıyın.

Ertesi gün, ortamı %0.3 BSA ve %1 kalem strep ile DMEM olarak değiştirin. Daha sonra hücreleri beş saat boyunca% 5 karbondioksit ile 33 santigrat dereceye taşıyın. Beş saat sonra.

Tripsin takviyeli DMEM'de bir milyon influenza izin veren MDCK hücresinin bir katmanını ekleyin. Virüsü oluşturmak ve çoğaltmak için 33 santigrat derece inkübasyon rejimi altında kokültürleri iki ila üç gün koruyun Daha sonra, beş dakikalık 260 G'lik bir dönüş kullanarak kalıntıları temizleyin. Daha sonra süpernatanları toplayın, steril koşullar altında dokuz ila 10 günlük tavuk embriyosu yumurtalarını aşılayın.

Bunu yapmak için, yumurta kabuğunun üstüne bir delik açın ve virüsü 100 x 10 x veya bir x seyreltmede ekleyin. Yumurta kabuğunu pamuklu çubuk kullanarak eritilmiş balmumu ile örtün ve aşılanmış tavuk yumurtalarını 33 santigrat derecede üç gün boyunca kuluçkaya yatırın. Daha sonra, enfekte yumurtalardan Alan Toic sıvısını toplayın.

Yumurta kabuklarını %70 etanol ile yıkayın. Yumurtayı üst kısmında çok hafif bir çatlak olacak şekilde açın ve steril forseps kullanarak Alan Toic zarını çıkarın. Mümkün olduğunca fazla sıvı toplamak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın.

Tipik olarak altı ila 10 mililitre. Sıvıyı 260 gs'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve temizlenen Alan Toic sıvısını yeni tüplere aktarın. Bir donör fareyi uyuşturduktan ve mediastene cerrahi olarak eriştikten sonra, kavisli forseps kullanarak lenf düğümlerini toplayın.

Lenf düğümlerini bir mililitre DMEM içeren altı oyuklu bir plakaya aktarın. Lenf bezini çevreleyen herhangi bir bağ veya yağ dokusu çıkarıldıktan sonra, lenf bezini bir iğne ile sabitleyin ve diğer iğne ile kırın. Bu, hücreleri toplamak için hücrelerin lenf düğümünden ortama patlamasına neden olmalıdır.

İlk olarak, santrifüjlemeye hazır hücrelerin bir süspansiyonunu elde etmek için tüm doku materyalini 70 mikronluk bir naylon filtreden geçirin. Hücre peletini iki mililitre RBC Lysing tamponunda yeniden süspanse edin. Lizis reaksiyonunun oda sıcaklığında üç dakika sürmesine izin verin ve iki mililitre buz gibi soğuk PBS ilavesiyle sonlandırın, hücreleri metin protokolüne göre boyamaya devam edin.

Antikor inkübasyonundan önce adlandırılan süper adı çıkarmak ve atmak için plaka fiske kullandığınızdan emin olun. Ticari olarak temin edilebilen TCR transgenik farelerden elde edilen etiket donör T hücreleri, beş mikromolar CFSE ile bir mililitre PBS'de 5 milyon hücreyi inkübe eder. Kuluçka süresinin karanlıkta 37 santigrat derecede 20 dakika devam etmesine izin verin.

Daha sonra hücreleri 100 mikrolitre PBS başına 2 milyonda toplayın ve alıcı konjenik fareleri retroorbital sinüs enjeksiyonu yoluyla 100 mikrolitre bolus ile infüze edin. Üç ila beş gün sonra, fareleri ötenazi yapın, mediastinal lenf düğümlerini toplayın ve akış sitometrisi için tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın. Daha önce olduğu gibi.

Daha sonra, tek hücreli süspansiyonları bir antikor kokteyli içinde boyayarak donör hücreleri tanımlayın. Analiz için. CFSE'nin seyreltme profilini belirlemek için FL'yi akış sitometresinin bir kanalını açık bırakın.

Ötenazi yapılmış bir farenin tibialarını ve uyluk kemiğini çıkarıp sterilize ettikten sonra, onları orada bir DMEM kabında toplayın. Keskin bir makas kullanarak kemik uçlarını kesin ve kemik iliğini DMEM'e akıtın. Şimdi standart yöntemleri kullanarak, fareleri ışınladıktan iki ila dört saat sonra bir sezyum 1 37 kaynak ışınlayıcı kullanarak altı ila sekiz haftalık dişi fareleri ışınlayın, fareleri uyuşturun ve 100 mikrolitre PBS'de 2 milyon hücrenin retroorbital sinüs enjeksiyonu yoluyla donör kemik iliği hücreleri ile nakledin Önümüzdeki iki hafta boyunca, Farelere içme suyunda kilogram başına 2,5 ila beş miligram Baal verin.

Aşılamadan iki gün önce başlayarak, 50 mikrolitre PBS içinde seyreltilmiş 50 nanogram DT'yi doğrudan anestezi uygulanmış farelerin burun deliklerine damla damla uygulayın. Aşılamadan sonraki üç gün boyunca bu tedaviye devam edin. Son fare modelini oluşturmak için ayrıntılar için metin protokolüne bakın.

Fareleri anestezi altında intranazal enjeksiyon kullanarak rekombinant canlı zayıflatılmış grip ile aşılayın. 50 mikrolitre PBS'de 200 mikrolitrelik bir pipetten 1000 PFU aşı verin Rekombinant canlı zayıflatılmış influenza aşılarının üretimi, çift yönlü promotörlerin kontrolü altında influenza virüsünün sekiz segmentini kodlayan plazmitlerin transfeksiyonu ile elde edilebilir. Soğuk algınlığına adapte edilmiş bir influenza aşısı genellikle soğuğa adapte edilmiş bir suşun altı segmentini ve ayrıca H bir N bir gibi tercih edilen influenza suşunun HA ve NA'sını içerir.

Soğuk adaptasyon, farelerde ve insanlarda üst solunum yollarının sıcaklığı olan 33 santigrat derecede virüsün kısıtlı replikasyonuna izin verir, ancak alt solunum yollarında replikasyona izin vermez, bu nedenle pnömoni füzyonu ile sonuçlanamaz. PCR, viral nöraminidaz sapındaki korunmuş bir bölgeyi izlenebilir bir OVA türevi peptit ile değiştirmek için kullanıldı. İzlenebilir peptit modeli, aşılamadan üç ila altı gün sonra farelere aşılandı.

İzlenebilir protein syn fekal, akciğer drenajlı lenf nodlarında tespit edildi. Aşı kaynaklı antijen sunumunu gerçek zamanlı olarak ölçmek için multiparametrik akış sitometrisi kullanıldı. Benzer şekilde, syn fekal spesifik T hücrelerinin infüzyonu, aşılama sırasında gene özgü fonksiyonları değerlendirmek için aşıya özgü CD sekiz T hücresi yanıtının niceliklendirilmesine izin verdi.

DTR teknolojisi ile rekabetçi kemik iliği kyirasını birleştiren bir fare modeli kullanıldı. Bu nedenle, gen fonksiyonu kaybı, aşılamaya karşı bağışıklık tepkileri boyunca spesifik hücre bölmelerine hedeflendi. Bu videoyu izledikten sonra, konakçıda aşı kaynaklı bağışıklığın modülasyonunda yer alan moleküler ve fizyolojik yolakların nasıl analiz edileceğini iyi anlayacaksınız.

Ek olarak, bu teknik, aşının hücre hedeflerinin belirlenmesinde yeni bir bakış açısı sağlayacak ve böylece yeni aşı platformlarının değerlemesini ilerletecektir.