Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri

Bu prosedürün amacı, bir sitokin yakalama sistemi kullanarak adoptif immünoterapi için klinik dereceli antijene özgü T hücrelerini izole etmektir. Bu, ilk olarak T hücrelerini aktive etmek için CMV PP 65'ten türetilen üst üste binen peptitlerden oluşan bir panel ile bir CMV pozitif donörden elde edilen mononükleer hücrelerin inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, aktive edilmiş antijene özgü CD 45 pozitif IFN gama eksprese eden T hücreleri sitokin yakalama ile izole edilir.

CMV'ye özgü T hücrelerinin sayısı ve saflığı daha sonra akış sitometrisi ile değerlendirilir. Sonuç olarak, CMV'ye özgü T hücrelerini eksprese eden CD dört ve CD sekiz pozitif IFN gama yüzdesi bu sitokin yakalama sistemi kullanılarak hasat edilebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajları, tamamen otomatik olması ve iyi üretim uygulamalarına uygun olarak çalışan bir tesisin yakalanan klinik derece T hücrelerini izole etmesine gerek olmamasıdır.

Bu yöntem, hücre üretimi ile ilişkili maliyetlerin nasıl azaltılacağı ve aynı zamanda bu hücrelerin erişilebilirliğinin nasıl artırılacağı gibi, evlat edinen hücre tedavisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Çok sayıda hasta için, bu yöntem CMB antijenine özgü T hücrelerinin izolasyonu hakkında fikir verebilir. Ayrıca, T hücrelerinin diğer patojenlere verdiği yanıta, hücrelerin ilgilenilen spesifik enfeksiyöz ajanlardan türetilen pep antijenleri ile entübe edilmesiyle de uygulanabilir.

Bu otomatik sistem aynı zamanda sitokin yakalama sürecini basitleştirir ve yakalanan T hücresi ürünlerinin operatörlerin doğrudan gözetimi olmadan talep üzerine üretilmesini sağlar. Prosedüre başlamadan önce, tüm peptit transfer edildiğinde, yeni sulandırılmış C-M-V-P-P 65 peptit kokteylini 50 mililitre hacimli bir dondurma torbasına aktarmak için bir yem spike ara konektörü kullanın. Torbayı kilitleme forsepsleri ile sıkıştırın ve steril koşullar altında hücre zenginleştirici boru setini açın, havalandırmalı flakon adaptörünü ve steril filtreyi boru setinden çıkarın ve yem spike ara konektörünü yem bağlantısına vidalayarak peptit kokteyl torbasını bağlayın.

Daha sonra, toplam 50 mililitre taze hazırlanmış P-B-S-E-D-T-A tamponu ve insan serum albümini hacminde 1 milyar toplam nükleer hücreyi askıya alın ve hücresel ürünü 150 mililitrelik bir transfer torbasına enjekte edin. Şimdi hücre zenginleştirme sistemini açın ve sitokin yakalama sistemi IFN Gama Zenginleştirme Programını seçin. Prosedür için talimatlar ve resimler içeren ekranları gösteren bir kullanıcı arayüzü görünecektir.

Operatörü ve boruyu girin, parsel numarası parametrelerini ayarlayın. Ardından, etkileşimli monitör ekranında görüntülenen talimatları kullanarak, prodigy boru setini otomatik hücre zenginleştirme cihazına takın. Reaktiflerin kataloğunu ve lot numaralarını kaydettikten sonra, ortamı ve tamponları cihaza bağlamak için ekranda görüntülenen adım adım talimatları izleyin.

Ardından, boru setinin son bir kontrolünden sonra, peptit kokteylini ve orta boy torbaları açın ve borunun otomatik olarak astarlanmasını başlatın. Hazırlama tamamlandığında, rezervuar torbasındaki sodyum klorür tamponuna insan serum albüminini eklemek ve başlangıç hücresel ürününü uygulama torbasına aktarmak için steril bir boru kaynak makinesi kullanın. Ardından, sitokin yakalama sistemi reaktiflerini ilgili tüplerine bağlamak için adaptörler kullanın ve hücre zenginleştirme işleminin sonu için tercih edilen süreyi girin.

Girilen tüm verilerin ve parametrelerin doğruluğunu gözden geçirin ve doğrulayın. Ardından kalite kontrol torbası contasını çıkarın ve torbayı tartın ve dört santigrat derecede saklayın. Şimdi zenginleştirme işlemini başlatın.

Hedef hücreler, rezervuar torbasından elüsyon tamponunda toplanacaktır. Zenginleştirmenin sonunda, hedef olmayan hücre negatif ve hedef hücre pozitif fraksiyonlarının her birinden iki alikot toplayın. Daha sonra hedef olmayan hücreyi ve hedef hücre torbalarını kapatın ve tartın ve bunları dört santigrat derecede saklayın.

Son olarak, boru setini hücre zenginleştirme cihazından çıkarın ve günlük dosyasını daha sonra kullanmak üzere bir USB sürücüsüne aktarın. Örneklerin her birinden zenginleştirilmiş hücre sayısını belirlemek için, karanlıkta dört santigrat derecede 10 dakika boyunca kalite kontrol hedef olmayan hücreden ve hedef hücreden alikotlardan birine CD 45 menekşe mavisi ekleyin. Daha sonra, kalite kontrol ve negatif fraksiyonlara 1.5 mililitre taze hazırlanmış kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi ve 15 dakika boyunca pozitif fraksiyona 450 mikrolitre ekleyin.

Oda sıcaklığında, analizden hemen önce, numunelere mililitrede bir mikrogramlık bir son konsantrasyonda propidyum iyodür ekleyin ve numuneleri otomatik bir hücre sayacına yükleyin. Her numunenin mutlak hücre numarasını belirlemek için, zaman kapısını gösterildiği gibi ayarlamak için kalite kontrol numunesini kullanın. Tek hücreleri ileri saçılma alanı grafiği ile ileri saçılma yüksekliğinde kapılayın, ardından CD 45 pozitif hücreler üzerinde bir monosit ve lenfosit kapısı izleyin, ardından canlı hücrelerin tanımlanmasına izin vermek için ileri yan yana saçılma grafiğindeki kalıntıları hariç tutun.

Orijinal kalite kontrol numunesi içindeki canlı hücrelerin sayısı daha sonra zenginleştirmenin kalitesini değerlendirmek için hesaplanabilir, orijinal pozitif ve negatif fraksiyonlardan ikinci alikotları önceden soğutulmuş P-B-S-E-D-T-A tamponu ile yıkayın, bir B serumu ile desteklenmiştir. Peletleri 100 mikrolitre uygun antikor florokrom boyama karışımında karanlıkta dört santigrat derecede yeniden askıya alın. 10 dakika sonra, numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir mililitre taze hazırlanmış kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi içinde inkübe edin.

Daha sonra hücreleri tekrar döndürün, analizden hemen önce propidyum iyodür eklemeden hemen önce AB serumu ile takviye edilmiş taze P-B-S-E-D-T-A içinde peletleri tekrar askıya alın. Daha sonra, sitokin yakalama sistemi zenginleştirmesinden sonra canlı CD üç pozitif T hücresi ve pozitif fraksiyonun sayısını ve ayrıca CD dört ve CD sekiz, tek pozitif ve CD dört IFN gama ve CD sekiz IFN gama çift pozitif T hücresi popülasyonlarının frekanslarını hesaplamak için aşağıdaki bir geçit stratejisi kullanıldı. Zenginleştirme işleminden önce ve sonra mutlak bir interferon gama pozitif T hücresi sayısı değerlendirildi.

Zenginleştirmeden önce interferon gama pozitif T hücrelerinin toplam sayısı, 1 milyar başlangıç toplam nükleer hücresinden türetildiği gibi 1.140.000 idi. Zenginleştirmeden sonra 309.000 interferon gama pozitif T hücresi elde edilirken, işlemden önce nokta %16 IFN gama pozitif CD dört pozitif T hücresi tespit edildi ve bu oran zenginleştirmeden sonra %47.5'e yükseldi. CD sekiz pozitif IFN gama pozitif T hücrelerinin saflığı %0.47'den %90.3'e zenginleştirilirken, numune geri kazanımı ve yakalanan pozitif fraksiyon, tek pozitif CD dört T hücresi için %32.9 ve tek pozitif CD sekiz T hücresi için %31.8 idi.

Birlikte alınan başlangıç popülasyonundaki IFN gama pozitif T hücrelerinin ölçümüne dayanarak, bu veriler hem CD dört pozitif hem de CD sekiz pozitif CMV PP 65'e özgü T hücrelerinin otomatik olarak ve insan uygulamaları için uygun bir şekilde hasat edilebileceğini göstermektedir. Bu prosedürü takiben, endotoksin ve mikoplazma testleri gibi diğer tahliller, nihai ürünün geliştirilmesinden sonra sterilitesi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için yapılabilir. Bu teknik, evlat edinici hücre tedavisi alanındaki araştırmacıların, çeşitli fırsatçı enfeksiyonları kontrol etmek için çoklu antijene özgü T hücrelerinin terapötik kullanımını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, klinik sınıf T hücrelerinin otomatik bir sistem kullanılarak nasıl izole edilebileceğini iyi anlamış olmalısınız. Biyolojik numunelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.