Name: Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-05T15:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Öğrenin sitokin yakalama sistemi ile otomatik CMV pp65 özgü T hücre izolasyonunu. Bu yöntem, GMP tesisi gerektirmeden klinik düzeyde antijen özgü T hücre üretimini mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Değerlendirme çalışmaları için reaktifler ve CliniMACS Prodigy ekipmanı sağladığı için Miltenyi Biotec, Almanya'ya teşekkür ederiz. George T. McNamara'ya (Pediatri bölümü, MD Anderson Kanser Merkezi) el yazmasını okuduğu için teşekkür ederiz. Hibe desteği: Kanser Merkezi Çekirdek Hibesi (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Hoşgeldin Fonu; Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü; CLL Küresel Araştırma Vakfı; Noelan L. Bibler'in Malikanesi; Gillson Longenbaugh Vakfı; Harry T. Mangurian, Jr., Lösemi İmmünoterapisi Fonu; Kişiselleştirilmiş Kanser Tedavisi Enstitüsü; Lösemi ve Lenfoma Derneği; Lenfoma Araştırma Vakfı; MDACC'nin Kardeş Kurum Ağı Fonu; Değirmenci Vakfı; Sayın Herb Simons; Bay ve Bayan Joe H. Ölçekler; Sayın Thomas Scott; Ulusal Kanser Araştırmaları Vakfı; Pediatrik Kanser Araştırma Vakfı; William Lawrence ve Blanche Hughes Çocuk Vakfı.

Steril Koşullarında Malzemelerin hazırlanması 1. (Malzemeleri ve Ekipmanları Tablo bakınız) <ol><li> % 0.5 bir son konsantrasyona kadar insan serum albümini (HSA) ile desteklenmiş PBS / EDTA tampon maddesi 3 L hazırlanması (a / h). </li><li> Klinik sınıf% 0.9 sodyum klorid (NaCl) çözeltisi 1 L&#39;lik bir çanta GMP sınıfı hücre kültür ortamının 2 L hazırlayın. </li><li> Steril su, 8 ml CMV pp65 bir vial sulandırılması CMV-spesifik peptid antijeni kokteyli 60 nmol hazırlayın. </li><li> Bir Luer / Spike interconnector kullanılarak 50 ml hacim dondurucu torbaya CMV pp65 peptid kokteyl aktarın ve boru setinin içine kokteyl sonraki dağılımını önlemek için forseps kilitleme kelepçe. Steril koşullar altında Açık hücreli zenginleştirme boru seti (TS 500). </li><li> Steril boru kaynakçı kullanarak, şu anda peptit kokteyl çantası kelepçesini açmayın boru setinin vananın 2 TS 500 için tüp bağlantısı içine peptid kokteyl donma çanta bağlayın. </li><li> Kaldır 1 x 10 9 TBaşlangıç ​​hücre üründen NC ve 50 ml &#39;lik bir toplam hacme% 2.5 HSA ihtiva eden PBS / EDTA tampon maddesi içinde askıya. 150 ml&#39;lik bir aktarma torbaya hücresel ürünü enjekte edilir. </li></ol> 2. Hazırlık ve Kullanım otomasyon Hücre Zenginleştirme Sistemi (Malzemeleri ve Ekipmanları Tablo bakınız) <ol><li> Hücre zenginleştirme sistemi (Şekil 1B) açın ve programı &quot;CCS_IFN-γ Zenginleştirme&quot; seçeneğini seçin. Prosedür yoluyla operatöre rehberlik talimatlar ve resimlerle ekranları gösteren bir kullanıcı arayüzü gözlemleyin. </li><li> Parametresi &quot;Operatör&quot; ve &quot;Boru Seti P / N Hayır&quot; girin. Sonraki interaktif monitör ekranında görüntülenen talimatlara göre Boru Seti 500 otomatik hücre zenginleştirme cihazı takın. </li><li> Cihaza orta ve tamponlar bağlamak için ekranda görüntülenen yönergeleri adım adım izleyin. Kayıt katalog numarası ve connectin önce reaktiflerin lot numarasıCihaza örn. </li><li> Boru setinin son kontrolünden sonra, peptid kokteyl çanta kelepçeyi açın. Orta çantayı açın ve boru setinin otomatik hazırlanmasını başlatmak. </li><li> Priming adımı tamamlandıktan sonra, steril boru kaynakçı yardımıyla rezervuar torba (200 mi) içinde NaCI tampon içine HSA (% 2.5) tamamlar. Steril boru kaynak makinası kullanarak &quot;Uygulama bag&quot; içine başlayan hücresel ürünü aktarın. </li><li> Adaptörleri aracılığı ile ilgili boru içine CCS (IFNy) reaktifler bağlayın. Zenginleştirme işlemi öncesinde selüler malzemenin bir kısmını toplamak için tercih edilen bir zaman girin. İnceleme ve tüm verilerin doğruluğunu / parametreler girilir. Işlemini başlatın. </li><li> Otomatik hücre zenginleştirme işlemi başlamadan önce, kalite kontrol yastığı (QCB orijinal fraksiyon (ori) PBS / EDTA tampon maddesi ile seyreltildi, 100 mi odacık içeriği üzerinden yaklaşık 1.3 ml içeren) çıkarın. , QCB Seal tartmak ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Enrichme başlatnt süreci. İşlemin sonunda, hedef hücreler, rezervuar torba gelen seçme tampon çözeltisi yaklaşık bir hacmi ile elüt edilecektir. </li><li> Olmayan Hedef Hücre Bag (NTCB, negatif fraksiyon = negatif) ve Hedef Hücre Çanta (TCB, pozitif kesir = pos) Mühür ve her torbayı tartın. Ağırlıklar daha sonra hücre sayıları hesaplanması için kullanılacaktır. </li><li> Hemen zenginleştirme işleminden sonra akış sitometresi analizi için fraksiyondan başına iki alikotları toplamak ve 4 ° C&#39;de numunelerin kalan saklayın. Hücre sayısı tayin zenginleştirme performans analizi (Tablo 1) Diğer numune kısım için bir numune kısım kullanın. </li><li> Hücresi zenginleştirme aletten boru setinin çıkarın. Ileride kullanmak üzere bir USB sürücüsüne günlük dosyasını aktarın. Not: Tüm reaktifler, steril koşullar altında hazırlanmalıdır. Biyogüvenlik tip II kaput kullanılması tavsiye edilir. Sağlıklı izole kararlı durum aferezi hücresel ürün (non-mobilize) kullanarakCMV seropozitif verici CMV antijen spesifik T hücrelerini zenginleştirmek. Sadece FDA HSA kullanılmalıdır lisanslı. Hücre hazırlama tamponu indirgenmiş saflık ve bir hedef hücre, indirgenmiş verimle sonuçlanır düşük veya daha yüksek çevre sıcaklıklarında olarak 25 ° C&#39;ye kadar 19 ° C &#39;de tutulması gerekmektedir. </li></ol> 3. Hücre Sayısı Tayini <ol><li> Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi. Hücre sayımları için QCB, NTCB ve TCB hacimde al, 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle karanlıkta her kısım (titre 01:11) CD45-VoBlue ekleyin ve inkübe edilir. </li><li> Orijinal fraksiyonu ve negatif fraksiyon pozitif fraksiyona 450 ul taze hazırlanmış kırmızı kan hücre parçalama çözeltisi 1,5 ml taze hazırlanmış kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi (1x) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika seyahati kesirler inkübe edin. </li><li> (100 ug / ml, 100 seyreltme 1) hemen önce analiz için 1 ug / ml nihai konsantrasyona kadar propidyum iyodür ilave edin. Hücre sayımı ve vi belirlemek için otomatik hücre sayacı kullanınyeteneği. Flow sitometri analizi için hücre karşı cihaz tavsiye yazılımını kullanın. Orijinal negatif ve pozitif fraksiyonları lökositlerin mutlak sayılarını belirlemek. Not: Hücre sayısı analizi için alınan örnekler ml&#39;si başına canlı hücre sayısı lökositlerin hücre analizörü tarafından önerilen yazılım kullanılarak belirlenir. </li><li> Şekil 2 (bölge 5, uygun bir lökositler) &#39;de gösterildiği gibi bölge ayarlayın. Hücre sayısını belirlemek için aşağıdaki yolluk strateji kullanın. Orijinal fraksiyonunda bir canlı lökosit Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Aşağıda belirtilen bölgeler (Şekil 2, 1-6) hiyerarşik olarak şunlardır: 1: Zaman kapısı → 2: Tek hücre → 3: CD45 + hücreler → 4: lökositler (enkaz hariç) 5 →: geçerli lökositlerin → 6: geçerli lenfositler </li><li> Negatif ve pozitif kesirler hücre sayılarını belirlemek için aynı adımları tekrarlayın. Bütün fraksiyonun hücre sayısını hesaplayınörnek ve fraksiyon (Tablo 2) toplam hacmine seyreltici faktörü dikkate alınarak. </li></ol> Ayırma Performansının 4. Ara Sınavı <ol><li> Önceden soğutulmuş PBS / EDTA tampon /% 0.5 AB serumu ile QCB, NTCB ve TCB fraksiyon hücrelerin alikotları yıkayın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ve hücreler süpernatan aspire. </li><li> Içeren 100 ul antikor florokrom boyama karışımı içinde süspanse edin hücreleri: CD3-FITC CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue ve anti-IFNy-PE (titresi 01:11) ve 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir. </li><li> 1 ml taze hazırlanmış kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi (1x) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ve süpernatan aspire. PBS / EDTA tampon /% 0.5 AB serumu yeterli bir hacimde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 100 diluti: 1 ug / ml hemen önce analiz (1 bir son konsantrasyona propidiyum iyot ekleme) 100 ug / ml üzerine. Numunenin saflığı değerlendirmek için flow sitometri analizi gerçekleştirir. </li><li> CCS zenginleştirme işleminden sonra pozitif fraksiyonun gösterilmiştir CD3 + T hücreleri belirlemek için uygun bir lökosit Yolluk stratejisinde CD3 + T hücreleri hesaplamak için aşağıdaki yolluk strateji kullanın. Aşağıda belirtilen bölgeler (Şekil 3A ve 3B, 1-6) hiyerarşik olarak bağlıdır: 1: Zaman kapısı → 2: Tek hücre → 3: CD45 + hücreler → 4: Hücreler (enkaz hariç) 5 →: geçerli lökositler → 6: geçerli CD3 + hücre popülasyonu </li><li> CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-y + ve CD8 + IFN-y + CCS zenginleştirme işleminden sonra, T hücreleri (Tablo 2) frekanslarını belirlemek. </li><li> F aşağıda CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-y + ve CD8 + IFN-y + T hücrelerinin frekansları belirlemek için yolluk strateji kullanarakveya CCS sürecinden sonra orijinal ve zenginleştirilmiş (esir) pozitif kesir. Aşağıdaki gibi gösterilen bölgeler hiyerarşik bağlantılı ve adlandırılır: 1: Zaman kapısı → 2: Tek hücre → 3: CD45 + hücreler → 4: Hücreler (enkaz hariç) 5 →: geçerli Lökosit → 6: geçerli CD3 + hücreleri → 7: CD4 + hücreleri → 7a: CD4 + IFN-γ + Hücreler (kutu) → 8: CD8 + hücreleri → 8a: CD8 + IFN-γ + hücreleri (kutu) </li></ol> NOT: hiyerarşi birinci bağlantı 6 belirtilen bölgeler, (1-6), burada Şekil 3 ile aynıdır ve 2 bölgeler geçen Şekil 4 (6-8a) &#39;de gösterilmiştir.

<ol><li>Syed, B. A., Evans, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+Analyst%27s+Couch+Stem+Cell+Therapy+Market%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).</li>
<li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Immunotherapy+for+Cancer+or+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses.</a> Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).</li>
<li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+T+cells+to+target+carbohydrate+to+treat+opportunistic+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).</li>
<li>Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).</li>
<li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automating+the+manufacture+of+clinically+appealing+designer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Treatment+Strategies-BMT%22%5BJournal%5D)">Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells.</a> Treatment Strategies-BMT. (1), Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/">http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/</a> 55-59 (2014).</li>
<li>Einsele, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+CMVpp65-peptide+loaded+DCs+to+improve+CMV-specific+T+cell+reconstitution+following+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 100 (11), 214a-214a(2002).</li>
<li>Blyth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-derived+CMV-specific+T+cells+reduce+the+requirement+for+CMV-directed+pharmacotherapy+after+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).</li>
<li>Gerdemann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+clinical+efficacy+of+rapidly-generated+trivirus-directed+T+cells+as+treatment+for+adenovirus%2C+EBV%2C+and+CMV+infections+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant.</a> Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).</li>
<li>Meij, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+treatment+of+refractory+CMV+reactivation+after+allogeneic+stem+cell+transplantation+with+in+vitro-generated+CMV+pp65-specific+CD8%2B+T-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines.</a> J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).</li>
<li>Lee Buckler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enal+Razvi%2C.+Rise+of+Cell-Based+Immunotherapy+%3A+Personalized+Medicine+Takes+Next+Step+Forward%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Engineering+%26+Biotechnology+News%22%5BJournal%5D)">Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).</li>
<li>Apel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Clinical+Scale+Manufacturing+System+for+Cellular+Products+Derived+by+Magnetic+Cell+Separation%2C+Centrifugation+and+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Chem-Ing-Tech%22%5BJournal%5D)">Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture.</a> Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).</li>
<li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T-Cell+Therapy+of+a+Lung+Transplanted+Patient+with+Severe+CMV+Disease+and+Resistance+to+Antiviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy.</a> Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li>
<li>Feuchtinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+grade+generation+of+hexon-specific+T+cells+for+adoptive+T-cell+transfer+as+a+treatment+of+adenovirus+infection+after+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation.</a> J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).</li>
<li>Peggs, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+selected+cytomegalovirus-reactive+donor+T+cells+confer+rapid+and+safe+systemic+reconstitution+of+virus-specific+immunity+following+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation.</a> Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).</li>
<li>Tischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+clinical-grade+antiviral+T+cells%3A+selection+of+suitable+T-cell+donors+and+GMP-compliant+manufacturing+of+antiviral+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells.</a> Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336(2014).</li>
<li>Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Costs+after+Allogeneic+Haematopoietic+Sct+Are+Associated+with+Major+Complications+and+Re-Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).</li>
<li>Leen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+study+of+banked+third-party+virus-specific+T+cells+to+treat+severe+viral+infections+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).</li>
</ol>

MD Anderson Kanser Merkezi ve Cooper Hem ZIOPHARM Onkoloji, Inc., ve Intrexon Corporation mali ilgi var. 7 Mayıs 2015 tarihinde, Dr. Cooper ZIOPHARM Onkoloji Baş Müdür olarak atandı. Doktor Cooper şimdi, MD Anderson bir Misafir Araştırmacı olduğunu. Doktor Cooper kurulan ve o yapay nükleazlarla ile Sangamo BioSciences ile patente sahiptir InCellerate, Inc. sahibi. O Targazyme, Inc. (eski Amerikan Kök hücreler, Inc.), GE Healthcare, Ferring İlaç, Kader Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals ve Bristol-Myers Squibb danışır. O Cellectis Bilimsel Danışma Kurulu üzerindedir. O, Miltenyi Biotec honoraria alır.

Evlatlık T-hücre tedavisi B-hücresi maligniteler 4 tedavisinde uygulanabilir bir seçenek olarak ortaya çıkmıştır. Bu tedavi edici potansiyeli replikatif yaşlanmayla 2 barındırmayan hedef antijene özel T hücreleri istenen sayıda beslerken bağlıdır. Bu halen geçerli gıda işleme uygulamalarıyla uyumlu genişletilmiş T hücrelerinden antijen belirli T hücrelerinin saf bir nüfus ayrıştırılması ile elde edilebilir. İki ayırma işlemleri yaygın olarak, yani, floresans ile aktive edilen hücre çeşitleme (FACS)...

Hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) 1, graft-versus-tümör etkisini arttırmak ve fırsatçı enfeksiyonlara 2 bağışıklığı sağlamak için adoptif T-hücre terapisi ile kombine edilebilir. Infüzyon için antijene spesifik donör kaynaklı T hücrelerinin üretilmesi tarihsel kalifiye personel ve GMP uyumlu olan uzman tesislerin kullanılmasını gerektirmiştir. Bu T hücrelerinin dağıtım fırsatçı enfeksiyon 3 çözünürlüğü hem de altta uzanan malignite 4 tedavi ile sonuçlanmıştır. Yakın geçmişte, araştırmacılar göstermiştir ki bin az sayıda virüs spesifik T hücrelerinin adoptif transfer (~ 1 x 10 4-2,5 x 10 5 hücre / kg alıcı vücut ağırlığı) başarılı bir şekilde HKHN 5-9 sonra fırsatçı CMV enfeksiyonları tedavi olabilir. Ilişkili vasıflı imalat şartlarına GMP tesislerinin sınırlı sayıda ve hücre üretimi ile ilişkili yüksek maliyetli, ancak, restr vardırT-hücre tedavileri 10 vaat için icted hasta erişim. Antijen-spesifik T hücrelerinin izole edilmesi için bir yaklaşım, CD45 ve IFN-y tanımak için bir çift spesifik bir reaktif kullanılarak CCS dayanmaktadır. Gösterildiği gibi, bu yöntem, bir otomatik hücre ilave CCS cihazı (Şekil 1B) kullanılarak klinik düzeyde CMV-spesifik T hücreleri üretmek için kullanılabilir. CMV-spesifik T hücreleri, CMV-seropozitif donörlerden lökaferez, toplam nükleer hücreler (TNC) CMV pp65 antijeninden örtüşen peptidlerin inkübe edilerek oluşturulur. İnsan lökosit antijen (HLA) bağlamında gösterildi Bu peptidler, IFN-y salgılaması için TNC olan CMV pp65-spesifik T hücrelerini aktive etmektedir. Bu T hücreleri daha sonra &quot;esir&quot; olmak ve manyetik ayrılmış olabilir. Birinci nesil cep zenginleştirme cihazının çalışması (Şekil 1A) birden s üstlenmek GMP koşulları altında hücre kültüründe yetişmiş personel gerekli ve personelin koordinasyonuBir &quot;esir&quot; ürünü üretmek için gerekli Teps. Prosedür genellikle sürekli çalışma 12 saat için 10 gerekli ve bu nedenle personelin büyük olasılıkla GMP tesisi iki vardiya üzerinden çalışmak gerekiyor. Bu kısıtlamalar, artık (Şekil 1B de gösterilen), bir ikinci kuşak cihazının uygulanması ile ortadan kaldırılır. Bu cihaz, ilk nesil cihaza benzer manyetik zenginleştirme, taahhüt, ancak bir unbreached bir yaklaşımla CCS&#39;nin diğer yönlerini otomatik hale getirir. Bu önemli ölçüde adımların en personeli tarafından sahipsiz yapılabilir olarak GMP ekibi üzerindeki yükü azaltır. Cihaz, bir kapalı bir sistem olarak işlev Dahası, antijen-spesifik T hücrelerinin yakalanır ve cihazı başlamadan önce lökaferez izolasyonu ve materyallerin hazırlanmasında yer alan adımları dışında masa üstü işlenebilir. Tam enstrümantasyon ve bu ikinci nesil cep zenginleştirme cihazın işlevselliği Detayları pub edilmiştir11 yayımlanır. Burada, biz otomatik hücre zenginleştirme CCS sistemini kullanarak bir kararlı durum aferez üründen CMV pp65-spesifik T hücrelerini zenginleştirmek için gereken adımları açıklar. Bir kez izole edildiğinde, bu, CMV-spesifik T hücreleri, hemen bir hastaya infüzyon yoluyla olabilir.

<table><tbody><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA Tampon 3 L torba</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>700-29</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy Boru Seti TS 500</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-182</td><td></td></tr><tr><td>5 L çöp torbası</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>110-004-067</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Sitokin Yakalama Sistemi (IFN-gama)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>279-01</td><td></td></tr><tr><td>Albümin (İnsan) %25&nbsp;</td><td>Grifols</td><td>58516-5216-2</td><td></td></tr><tr><td>Luer/Spike Ara Konnektör</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-701</td><td></td></tr><tr><td>% 0,9 NaCl Çözeltisi (1 L)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP PepTivator HCMV pp65</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-109</td><td></td></tr><tr><td>Enjeksiyonluk su</td><td>Hospira, inc, Lake Forest, IL</td><td>NDC-0409-4887-10</td><td></td></tr><tr><td>MILLEX GV Filtre Ünitesi 0.22 & mu; m&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>TexMACS GMP Orta 2 L torba</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-306</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Torbası, 150 ml (hücresel başlangıç malzemesi için)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-301</td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS Dondurma Torbası 50</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-074-400</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Şırıngalar, steril</td><td>BD, Laagstraat, Temse, Belçika</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>CMV sero pozitif aferez ürünü</td><td>Key Biologics, LLC, Memphis</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Sitometri Malzemeleri</td><td>Üretici<</td><td>strong>Katalog numarası</td><td></td></tr><tr><td>AB Serum, GemCell</td><td>Gemini Bio-Products, West Sacramento, ABD</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>CD3-FITC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-080-401</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-033</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-065</td><td></td></tr><tr><td>CD14-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-072</td><td></td></tr><tr><td>CD20-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-077</td><td></td></tr><tr><td>CD45-VioBlue</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-136</td><td></td></tr><tr><td>aIFN-&gamma;-PE, insan</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-940</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-091-374</td><td></td></tr><tr><td>propidium iyodür çözeltisi (100 & mikro; g/ml)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td><güçlü>Üretici</güçlü></td><td><güçlü>Katalog Numarası</güçlü></td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy Cihazı&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-075-301</td><td></td></tr><tr><td>Yazılım V1.0.0.RC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analizörü 10</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Yazılım 2.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5415R&nbsp;</td><td>Eppendorf AG</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer K2</td><td>Nexelom Bioscience, Lawrence, MA</td><td>LB-001-0016</td><td></td></tr><tr><td>Steril boru kaynakçı SCDIIB</td><td>Terumo Medical Corp., Elkton, MA</td><td>7811</td><td></td></tr></tbody></table>

sitokin yakalama sistemi kullanılarak klinik uygulamalar için sitomegalovirüs özgü otomatik hücre zenginleştirme t hücreleri

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Patogene-özgü T hücrelerinin adoptif transfer önlenmesi ve allogeneik kök hücre transplantasyonundan sonra ortaya çıkan gibi enfeksiyon (CMV), sitomegalovirüs gibi fırsatçı enfeksiyonları tedavi etmek için de kullanılabilir. Üçüncü şahıs bağışçı olmak üzere allojenik vericilerden, viral-spesifik T hücreleri, seçici istenen T hücrelerini yaymak için antijen-odaklı uyarım tekrarlanan mermi kullanan mevcut iyi üretim uygulamaları (cGMP) uygun olarak ex vivo olarak yayılan olabilir. Antijen-spesifik T hücrelerinin tanımlanması ve izolasyonu da gama-interferon (IFN-γ) salgılamaya aktive edilmiş T hücrelerinin sitokin yakalama sistemine dayalı yapılabilir. Üretim süreci zaman alıcı ve yetenekli bir operatör gerektirir Ancak, bağışıklık geri yardımcı olmak için sitokin yakalama sistemi (CCS) yaygın insan uygulaması sınırlı kalmıştır. Şimdi bu CliniMACS Prodigy gibi ikinci nesil hücresi zenginleştirme cihazının geliştirilmesiotomatik bir, daha az emek yoğun bir sistem kullanılarak viral özgü T hücrelerinin üretilmesi için araştırmacılar sağlar. Bu cihaz, manyetik klinik sınıf ürünler üretmek için bir manyetik etkinleştirilmiş hücre tasnif teknolojisi kullanılarak etiketlenmemiş hücrelerden hücreler etiketli ayırır, kapalı bir sistem olarak tasarlanmıştır ve masa üstü erişilebilen ve çalıştırılabilir. Bu yeni otomatik hücresi zenginleştirme Cihazın çalışması, bir CMV seropozitif vericiden elde edilen bir kalıcı-hal aferez ürününden elde edilen CMV pp65-spesifik T hücreleri üretmek için göstermektedir. Bu izole edilmiş T hücreleri, daha sonra doğrudan, kurumsal ve federal düzenleme denetimi altında bir hastaya infüze edilebilir. Kırmızı kan hücrelerinin ortadan kaldırılması dahil olmak üzere tüm biyo-işlem aşamaları, T hücreleri, antijen-spesifik T hücrelerin, saflaştırma ve yıkama ayrılmasının uyarılması tam olarak otomatikleştirilmiştir. Bu gibi cihazlar, insan uygulaması için T hücreleri GMP (özel iyi üretim uygulamaları dışında imal edilebilmesi olasılığı ortaya) Yerine tesisleri ve personel birden ürünler üretmek için otomatik protokolleri denetleyebilir kan bankacılığı tesislerinde üretilecek.

Bu çalışmada, bir otomatik hücre ilave CCS Sistemi CMV pp65-spesifik T hücrelerinin otomatik üretimi için kullanılmıştır. CMV-spesifik T hücreleri, üç aferez hücre ürünlerinden zenginleştirildi. Kararlı durum aferez ürünü 10 10 toplam nükleer hücreler (TNC) CMV seropozitif donörden 2 saat boyunca hasat ve üretilmiştir. 10 9 TNC CMV pp65 türetilmiş peptidler (60 nmol), 4 saat ve T hücreleri, otomatik hücre zenginleştirme cihazda CCS kullanılarak izole edildi salgılayan IFN-y için aktive edildi. Bir ...

Bu protokolün amacı, kapalı bir sitokin yakalama sistemi içeren ve özel personel veya bir GMP tesisinin kullanılmasını gerektirmeyen tezgah üstü, otomatik, ikinci nesil hücre zenginleştirme cihazı kullanarak patojene özgü klinik dereceli T hücreleri üretmektir. Üretilen sitomegalovirüs pp65'e özgü T hücreleri doğrudan hastalara uygulanabilir.

Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Bu prosedürün amacı, bir sitokin yakalama sistemi kullanarak adoptif immünoterapi için klinik derece antijen spesifik T hücrelerini izole etmektir. Bu işlem, öncelikle CMV pozitif bir donörden elde edilen mononükleer hücrelerin, T hücrelerini aktive etmek için CMV PP 65'ten türetilen bir dizi örtüşen peptit ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, aktive olmuş antijen spesifik CD 45 pozitif IFN gamma eksprese eden T hücreleri sitokin yakalama yöntemiyle izole edilir.Ardından, CMV spesifik T hücrelerinin sayısı ve saflığı akış sitometrisi ile değerlendirilir. Nihayetinde, bu sitokin yakalama sistemi kullanılarak yüksek yüzde oranında CD4 ve CD8 pozitif, IFN gamma eksprese eden CMV spesifik T hücreleri elde edilebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajları, tamamen otomatize olması ve yakalanan klinik düzeydeki T hücrelerini izole etmek için iyi imalat uygulamalarıyla uyumlu bir tesisin gerekmemesidir.Bu yöntem, hücre üretimiyle ilişkili maliyetlerin nasıl düşürülebileceği ve aynı zamanda bu hücrelerin erişilebilirliğinin nasıl artırılabileceği gibi adaptif hücre tedavisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bununla birlikte, bu yöntem

automated-cell-enrichment-cytomegalovirus-specific-t-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dolaşımdaki tümör hücreleri hücresel hasara maruz kalmadan kanserli hastaların kandan izole edilir. Tümör hücrelerinin izolasyonu epiteliyal belirteçler karşı antikorların yanısıra E-selektin bir iki moleküllü yüzey kullanılarak gerçekleştirilir. Bir nanotüp kaplama özellikle yüksek yakalama saflık sonuçlanan kanser hücre adezyon teşvik etmektedir.

Hasta Kan Örneklerinden Canlı Dolaşımdaki Tümör Hücreleri Rapid İzolasyonu

Bu videoda, manyetik ayırıcı kullanılarak negatif seçilimle farenin dalağından T hücrelerinin zenginleştirilmesi anlatılmaktadır. Teknik, spesifik hücre yüzeyi antijenlerine karşı yönlendirilmiş antikorlar veya ligandlar kullanılarak numunedeki diğer hücrelerin tükenme için hedeflenmesini içerir.

T-Hücresi Zenginleştirme: Manyetik Ayırma ile Karışık Hücre Popülasyonundan T-Hücrelerini İzole Etme Tekniği

Sirkülasyon tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) birçok metastatik kanser prognostik bulunmaktadır. Bu el yazması altın standart CellSearch sistemi (CSS) CTC sayım platformu ve golleri ortak yanlış sınıflandırma hatalar açıklanır. Buna ek olarak, iki uyarlanmış protokolleri bu teknolojiyi kullanarak metastaz klinik öncesi fare modellerinde kapalı zaman eğrilerinin ve CTC numaralandırma kullanıcı tanımlı işaretleyici karakterizasyonu için tarif edilmiştir.

Klinik ve Klinik Öncesi Araştırma Uygulamaları Tümör Hücre (CTC) Tahliller Sirkülasyon semiautomated adaptasyon

Yeniden elde etmek ve moleküler genetik karakterizasyon tek hücre düzeyinde bir karışımı nadir Hedef hücrelerden olmayan hedef arka plan hücrelerle hazırlamak protokolüdür. DNA kalitesi olmayan tedavi tek hücrelere eşittir ve (her iki tarama tabanlı ve analiz hedefli) tek hücreli uygulama için sağlar.

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Burada, sirkülasyon tümör hücrelerini (CTCs) karakterize eden fenotifik ve moleküler özellikleri tanımlamak için entegre bir iş akışı sunuyoruz. Tek ve kümelenmiş CTCs 'lerin canlı immünostasyon ve robotik mikromanipülasyonunu, alt analiz ve metasrin-tohumlama yeteneğinin değerlendirilmesi için tek hücre bazlı tekniklerle birleştiriyoruz.

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Burada periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyon ve genleşmesini gerçekleştirmek için bir protokol sunmaktayız- periferik kan mononükleer hücrelerden türetilmiş sitokin kaynaklı CD3+CD56+ öldürücü hücreler ve in vitro tanı akış sitometri sistemi kullanarak hematolojik ve katı kanser hücrelerine karşı sitotoksisite etkilerini göstermek.

Kanser Tedavisi için Sitotoksik Sitokin Kaynaklı Katil T Hücrelerinin İzolasyon ve Genişlemesi

Klinik mikroakışkan çip, klinik hasta kan numunesinin ön işlenmesini basitleştiren ve çip üzerinde yerinde dolaşan tümör hücrelerini (CTC'ler) yerinde boyayarak tek bir CTC'nin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve tanımlanmasını sağlayan önemli bir biyomedikal analiz tekniğidir.

Çok Yönlü Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İzolasyonu için Klinik Mikroakışkan Çip Platformu

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler), kanserin ilerlemesi ve metastazının incelenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, CTC zenginleştirme ve tek CTC dizilimi için yüksek verimli, entegre bir protokol sunmakta, kontaminasyon ve dizileme maliyetlerini azaltırken yakalama verimliliğini ve CTC saflığını artırmakta, böylece hassas onkoloji araştırmalarını ve klinik uygulamaları ilerletmektedir.

Mikroakışkan Tabanlı Yüksek Verimli Dolaşımdaki Tümör Hücresi Sıralama ve Tek Hücre Dizileme Teknolojisi

Bu protokol, Benimseyen Hücre Tedavileri (ACT) ürünlerinin genişletilmesi için ölçeklenebilir bir yöntemi tanımlar; yani Kimerik Antijen Reseptörü (CAR)-T hücreleri ve Sitokin İndüklenen Katil (CIK) hücreleri, gaz geçirimli Hızlı Genişleme (G-Rex) cihazları kullanılarak, klinik açıdan ilgili bir ortamda verimli ve sağlam büyüme göstermektedir.

GMP ölçeklenebilir cihazlarda CAR-T ve sitokin kaynaklı katil hücrelerin verimli ve hızlı üretimi

Biz retroviral transdüksiyon kullanarak fare antijen spesifik T-hücrelerinin üretmek için bir protokol...

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

Öğrenin sitokin yakalama sistemi ile otomatik CMV pp65 özgü T hücre izolasyonunu. Bu yöntem, GMP tesisi gerektirmeden klinik düzeyde antijen özgü T hücre üretimini mümkün kılar.

Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri

Daha fazla video keşfet