Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme
12 Mayıs 2015
Doğum sonrası beyincik gelişimi sırasında, germinal bölgeden köken alan olgunlaşmamış granül hücreleri, nihai hedeflerine ulaşmak ve nöronal ağlar kurmak için farklı göç yöntemleri sergilerler. Bu protokol, serebellar kesitlerin hazırlanmasını ve nöronal göçü düzenleyen faktörleri araştırmak için kullanılan konfokal makroskopik yaklaşımı tanımlar.
Bu prosedürün genel amacı, göç eden nöronları canlı beyin dilimlerinde görselleştirmektir. Bu, önce serebellumun bir P 10 sıçandan diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, akut serebellar dilimler hazırlamak ve nöronları bir floresan prob ile etiketlemektir.
Daha sonra hızlandırılmış deney, makro konfokal görüntüleme veya konfokal mikroskopi ile gerçekleştirilir. Son adım, ortaya çıkan filmlerdeki nöronları izlemektir. Sonuç olarak, ex vivo mikroskopi, nöronal göçü düzenleyen endojen faktörlerin veya toksik maddelerin rolünü göstermek için kullanılır.
Bu tekniğin konfokal mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, makro konfokal görüntülemenin doğrudan kasık ekine yerleştirilen serebral sanat kesitlerinden çıkma hissini artırmasıdır. İlk olarak, konfokal mikroskopi deneyleri için serebral sanat dilimlerini transfer etmekte ve stabilize etmekte zorluk çektiğimde bu yöntem için fikrim vardı Kafası kesilmiş bir P 10 sıçan yavrusu kafasının kafatasına erişerek başlayın, ince iris makası kullanarak tabandan kafatasının rostral bölgesine hassas bir şekilde iki lateral kesi yapın. Daha sonra disseke edilmiş kafatasını iki numara üç forseps ile çıkarın ve beyin ile kafatası arasındaki herhangi bir yapışmayı kırın.
Şimdi, bir spatulanın kaşık ucuyla beyni çıkarın ve buz üzerinde iki mililitre soğuk HBSS ile 35 milimetrelik bir Petri kabına koyun. Şimdi, bir stereo mikroskop altında, iki numara üç forseps kullanarak beyinciği beyinden D laserasyonları ile izole edin. Beyincikleri buz gibi soğuk tamponlu yeni bir yemeğe koyun.
Daha sonra aynı aletleri kullanarak, kalan omuriliği ve soyma zarını çıkarın ve atın. 15 numara cerrahi bıçak ile üç numara sağlam bir neşter sapı hazırlayın. Bıçağı stereo mikroskop altında kullanarak, verus ile sağ hemisfer arasındaki beyinciği kesin.
Şimdi vibratoda, numune diskine bir damla siyanokrilat yapıştırıcı koyun ve beyinciği diske aktarmadan önce çözücü buharının dağılması için 15 ila 25 saniye bekleyin. Ardından, beyinciğin kenarını numune diskine sabitleyin ve 10 saniye bekleyin. Şimdi manipülatörü kullanarak, numune diskini, beyinciğin enine ekseni bıçak tutucusuna dik olacak şekilde tampon tepsisine yerleştirin.
Diski bir şap anahtarı kullanarak sabitlediğinizden emin olun. Daha sonra beyinciği dikkatlice HBSS ile örtün ve kırılmış buzu soğutma banyosuna yükleyin. Numuneyi dilimlemek için temizlenmiş bir bıçağı, kenarı numunenin arka kenarının hemen arkasında olacak şekilde yerleştirin.
Bunu buzlanma için başlangıç noktası olarak tanımlayın. Ardından, uç noktayı örneğin ön kenarının hemen yanından geçecek şekilde tanımlamak için forward komutunu kullanın. Şimdi dilim kalınlığını 180 mikron olarak ayarlayın.
Ardından kesit alma hızını 2,5'e ve frekansı sekize ayarlayın ve numuneyi kesitlere ayırmaya başlayın. Beyincik başına en fazla beş dilim toplayın. Kesik geniş bir yaban domuzu camı pipeti kullanarak her bölümü alın.
Bölümleri buz üzerinde soğuk HBSS içeren bir kaba aktarın. Dilimleri stereo mikroskop altında topladıktan sonra, iki numaralı beş forseps kullanarak meninksleri dikkatlice çıkarın. Ayrıca, daha iyi prob yüklemesi için LOE'leri nazikçe ayırın.
Numuneyi dilimledikten sonra, bunları bir miktar HBSS ile altı Kuyulu bir plakaya aktarmak için kesik bir geniş yaban domuzu pipeti kullanın, her bir oyukta üç dilime kadar yükleyin. Daha sonra, her yüklenen ortamdaki ortamı boşalttıktan sonra, numuneleri ışıktan korumak için 10 mikromolar floresan boya içeren beş mililitre yükleme çözeltisi ekleyin, plakayı folyo ile örtün. Ardından plakayı 35 RPM'ye ayarlanmış bir mutatöre koyun.
Boyanın hücreleri iyi etiketlemesine izin vermek için plakayı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Şimdi dilimleri daha önce olduğu gibi üç mikron gözenekli bir transwell ekinin zarına aktarın. Ardından yükleme ortamını aspire edin ve sadece dilimleri bırakın.
Şimdi kuyuyu 1.9 mililitre DMEM ile doldurmak için eki ve dilimleri çıkarın. Ardından eki geri takın ve dokuları kaplamak için 100 mikrolitre daha DMEM ekleyin. Bu preparasyonu iki saat inkübe edin, ardından granül hücreleri görünür hale gelecektir.
Plakayı kapaksız olarak konfokal mikroskopta sabit gaz akışı olan bir çevre odasına aktarın. Ardından, hızlandırılmış deneyler için konfokal mikroskobun plaka ekine cam kapak yerleştirin. Devam etmeden önce hücrelerin odada iki saat daha kuluçkaya yatmasına izin verin.
Doku dilimlerinde göç eden granül hücrelerini görselleştirmek için, preparasyonu 488 nanometre ışıkla aydınlatın ve iki x kuru objektif kullanın. Görüntü J'yi kullanarak 500 ila 530 nanometre arasındaki floresan emisyonlarını tespit edin.Hızlandırılmış filmin her görüntüsü için, standart sapma modunu kullanarak bir Zack projeksiyonu gerçekleştirin, her görüntünün kontrastını ve parlaklık seviyelerini ayarlayın, böylece etiketli granül hücrelerinin görülmesi kolaylaşır. Şimdi, partikül analizi menüsünden manuel izleme eklentisini seçin.
Hızlandırılmış görüntü dizisi boyunca etiketlenmiş her hücre gövdesinin merkezi noktasına tıklamak için eklentiyi kullanın. Ardından, daha fazla analiz için ham izleme verilerini bir elektronik tabloya aktarın. Programı kullanarak her hücreyi ve ilişkili konumları tanımlayan akıllı bir ev yapımı araçla Görüntü J'den dışa aktarılan ham izleme verilerini yeniden düzenleyin.
Her hücre için toplam hareket mesafesini ve ortalama göç hızını hesaplayın. Doğum sonrası erken serebellumda, granül hücreleri farklı kortikal tabakaları geçerken göç modlarında ve hızlarında önemli değişiklikler gösterir. PM sıçan serebellar doku dilimlerinde CTG işaretli granül hücreleri incelendi.
Tarif edildiği gibi, granül hücreleri moleküler tabakada saatte ortalama 18 mikron hızla radyal olarak göç etti. Daha sonra göç oranını değiştirmesi beklenen ilaçların etkisini test etmek için başka bir preparat kullanıldı. Ödeme başlığının 38 kültür ortamına uygulanması, moleküler tabakadaki granül hücrelerinin% 79'luk bir hız düşüşüne, saatte 2.5 mikrona düşmesine neden oldu.
Endojen TPA'nın bir inhibitörü olan PI one'ın uygulanması, granül hücre göç hızını kontrol hızından saatte 4.2 mikrona% 78 oranında azalttı. Bu videoyu izledikten sonra, gelişmekte olan teori balonundaki hücrelerin nasıl izleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, hücre göçü için gerekli olan uygun ve sabit çevresel parametreleri sağlamayı unutmamak önemlidir.
Bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların beyindeki olgu uyandırma süreçlerini keşfetmesinin yolunu açtı.
Genel Bakış
Bu çalışma, canlı beyin dilimlerindeki nöronal hareketi görselleştirmek için konfokal makroskobik bir yaklaşım kullanarak, postnatal serebellumdaki olgunlaşmamış granül hücrelerinin migrasyonuna odaklanmaktadır. Protokol, serebellum dilimlerinin hazırlanmasını ve nöronal migrasyonu etkileyen faktörleri özetlemektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Nöronal migrasyon
- Konfokal mikroskopi
Arka Plan
- Granül hücreleri, serebellum gelişimi sırasında nöronal ağlar kurmak için göç eder.
- Nöronal göçün anlaşılması, beyin gelişimi ve bozukluklarına dair içgörüler elde etmek için kritik öneme sahiptir.
- Konfokal mikroskopi, nöronal davranışın ayrıntılı şekilde görselleştirilmesine olanak tanır.
- Ex vivo mikroskopi, çeşitli faktörlerin nöronal göç üzerindeki etkilerini ortaya çıkarabilir.
Çalışmanın Amacı
- Serebellumdeki granül hücrelerinin migrasyonunu görselleştirmek.
- Endojen faktörlerin ve toksik maddelerin nöronal migrasyon üzerindeki etkisini incelemek.
- Beyin kesitlerinde nöronal dinamiklerin incelenmesine yönelik teknikleri geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- P10 sıçandan serebellumun diseksiyonu ve akut kesitlerin hazırlanması.
- Görselleştirme için nöronların floresan problarla işaretlenmesi.
- Makro konfokal mikroskopi kullanılarak zaman ayarlı (time-lapse) görüntüleme.
- Nöronal hareketin takibi ile migrasyon hızının ve mesafesinin analiz edilmesi.
Temel Sonuçlar
- Granül hücreleri, kortikal katmanlar boyunca migrasyon modlarında ve hızlarında belirgin değişiklikler göstermiştir.
- Moleküler tabakada ortalama migrasyon hızının 18 microns per hour olduğu tespit edilmiştir.
- Spesifik ilaçların uygulanması, granül hücrelerinin migrasyon hızını anlamlı şekilde değiştirmiştir.
- Sonuçlar, nöronal migrasyonun düzenleyici mekanizmalarına dair bilgiler sunmaktadır.
Sonuçlar
- Çalışma, serebellar kesitlerde granül hücre göçünü başarıyla görselleştirmektedir.
- Bulgular, endojen faktörlerin nöronal hareket üzerindeki etkisini vurgulamaktadır.
- Bu yöntem, gelişim sırasındaki nöronal dinamiklerin anlaşılmasını geliştirmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu yöntem, canlı beyin kesitlerinde nöronal migrasyonun gerçek zamanlı görselleştirilmesine olanak tanıyarak, nörogelişimsel hedef doğrulamasında mekanistik risklerin azaltılmasını destekler. Migrasyon hızını ve yolak dinamiklerini nicelleştirerek, bileşiklerin nöronal devreler üzerindeki etkilerini değerlendirmek için öngörücü bir güvenilirlik sağlar. Bu yaklaşım, keşif biyolojisi ile nöroaktif maddelerin preklinik değerlendirmesi arasında bir köprü kurar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Granül hücre migrasyonunu, nöronal yolak bütünlüğünün fonksiyonel bir çıktısı olarak görselleştirerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Endojen faktörlerin ve toksik maddelerin hücre hareketi üzerindeki etkilerinin doğrudan gözlemlenmesi yoluyla biyolojik risk azaltmayı sağlar.
- Öngörücü Değer: Migrasyon değişikliklerini serebellar devrelerdeki potansiyel fonksiyonel eksikliklerle ilişkilendirerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Kortikal katmanlarda temel migrasyon kinetiğini belirleyerek, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki iş akışlarına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Toplam kat edilen mesafenin ve ortalama hızın kantitatif takibi yoluyla analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Tarama Hazırlığı: Time-lapse formatında güvenilir bileşik değerlendirmesi için ölçeklenebilirliği ve platformun yeniden kullanılabilirliğini vurgular.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Migrasyon düzensizliğini çeşitli serebellar fonksiyonlardaki eksikliklerle ilişkilendirerek hastalıkla olan ilgisini tartışır.
- Risk Ayarlı İlerleme: Keşif aşamasından nöroaktif bileşiklerin preklinik doğrulamasına kadar olan süreci tanımlar.
- Öngörülü Risk Azaltma: Alkol veya metilmerküri gibi maddelerin nöronal migrasyon üzerindeki etkileri değerlendirilirken mekanistik içgörülere odaklanır.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Göçü fonksiyonel bir son nokta olarak ölçme kapasitesiyle desteklenen bu yöntemi, hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürekliliği içindeki konumuna yerleştirir.
- Keşif Biyolojisi: Yöntemin hipotez testlerini, yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini ve nöronal migrasyon mekanizmalarının biyolojik risklerinin azaltılmasını nasıl desteklediğini açıklar.
- Tarama: Bileşiklere yanıt olarak granül hücre hareketinin takibinde analiz hazırlığını, tekrarlanabilirliği ve kantitatif çıktıları tanımlar.
- Analitikler: Ekiplerin farklı koşullar arasında migrasyon hızını ve mesafesini karşılaştırmalarına yardımcı olan ölçümleri, okumaları veya istatistiksel çıktıları vurgular.
- Translasyonel Araştırma: Yöntemi, yalnızca kaynak desteklediği takdirde preklinik süreklilik veya biyobelirteç uyumu ile ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yöntemi tek seferlik bir teknikten ziyade yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak çerçeveler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Öngörü güvenilirliği, hedef doğrulaması, nöronal göç yollarındaki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Zaman ayarlı (time-lapse) görüntüleme ve izleme protokollerinin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Nöroaktif bileşik taramalarında daha iyi devam/durdurma kararları, sermaye verimliliği ve geç aşama biyolojik risklerin azaltılması.
- Portföy Etkisi: Göç fenotipi verilerine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Nöroanatomi, floresan işaretleme ve konfokal mikroskopi konularında gerekli bilimsel uzmanlık.
- Çevresel hazne, konfokal makroskop ve izleme eklentileri yüklü Image J dahil olmak üzere enstrümantasyon ve analitik altyapı gereksinimleri.
- Kesit hazırlama, işaretleme tutarlılığı ve migrasyon kantifikasyonu için ekipler arası standardizasyon gereklilikleri.
- Farklı postnatal yaşlar veya türler gibi model sistemler genelindeki adaptasyon değerlendirmeleri.
- Kesit canlılık penceresi ve uzun süreli görüntüleme sırasındaki fototoksisite riskleri dahil olmak üzere kaynak materyalle desteklenen pratik kısıtlamalar.
