Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Bu prosedürün genel amacı, vasküler doku rejenerasyonu için boru şeklinde yapılar tasarlamaktır. Bu, önce tip bir kollajen ve düz kas hücrelerinin silindirik geometride bir kalıplama tekniği kullanılarak birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, yapıyı özel olarak tasarlanmış bir statik biyoreaktörde olgunlaştırmaktır.

Daha sonra, olgun yapılar dikkatlice toplanır ve endotel hücreleri, dönen duvarlı bir biyoreaktör aktörü kullanılarak yapının lümenine oturtulur. Sonuç olarak, bu tübüler yapıların özelliklerini değerlendirmek için histoloji, metabolik testler ve mekanik testler yapılır. Bu tekniğin özgünlüğü, herhangi bir ek fiziksel veya kimyasal işlem olmaksızın hedeflenen mekanik özelliklere sahip doku mühendisi yapısını elde etmek için hücreleri ve kolajeni birleştirmek için sadece bir adım kullanmasıdır.

Dahası, manipülasyonlarına ve uç bağlantılarına izin veren özel tasarım kulpları sayesinde yapı kolayca manipüle edilebilir. Bu yöntem, vasküler doku rejenerasyonu için büyüme ve yeniden şekillenme sırasında hücreler ve hücre dışı matris arasındaki etkileşim hakkında bir fikir verebilir. Ayrıca tendonlar, deri greftleri, kalp yaması ve sinir sistemi gibi bir dizi hedeflenen doku için de uygulanabilir.

Ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi statik biyoreaktörü imal etmeye ve monte etmeye başlamak için, rezervuar ve gazlı bez, kavrama imalatı, mandrel kapağı ve muhafaza kalıbı montajı ve sterilizasyon teknikleri hakkında ayrıntılar dahildir. Daha sonra, domuz aort düz kas hücrelerini 175 santimetre karelik bir doku kültürü şişesinde %90 birleşene kadar genişletin. Standart kültür tekniklerini kullanarak, hücreleri hasat edin ve daha sonra tam kültür ortamında mililitre başına 4 milyon hücrede yeniden süspanse edin.

Daha sonra, bir kısım tampon çözeltisini, litre başına dört gramda iki kısım steril kollajen çözeltisini ve bir kısım hücre süspansiyonunu birleştirin. Bu sırayla, karışımın pH'ını ölçün ve pH 7.0 ile 7.4 arasında olduğundan emin olun. Daha sonra hücre kollajen karışımını yavaşça monte edilmiş muhafaza kalıp kompleksine dökün.

Karışımda hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kolajen jeli steril bir ortamda bir saat oda sıcaklığında bekletin. Bir saat sonra, muhafaza tüpünü çıkarın ve yapıyı 35 mililitre ön ısıtma kültür ortamı içeren rezervuara dikkatlice aktarın.

Yapıyı bir veya iki haftalık statik olgunlaşma için dikey konumda inkübe edin. Eski besiyerini alt septum portundan aspire ederek ve rezervuarı eşdeğer miktarda taze kültürle yeniden doldurarak kültür ortamını her iki günde bir değiştirin. Orta. İstenirse, ilk 12 saat boyunca her saat başı ve daha sonra her 24 saatte bir biyokimyasal analiz için her ortam değişiminde hem eski hem de taze kültür ortamından bir mililitre toplayın.

Yapıyı steril koşullar altında kültür ortamından çıkarın ve bir ila iki haftalık statik olgunlaşmanın ardından yapının kalınlığını ölçmek için bir taramalı lazer interferometre yoluna ortogonal olarak yerleştirin. Biyoreaktörü bir hücre kültürü davlumbazına aktarın ve yapıyı mandrelinden nazikçe çıkarın. Serbest kaldıktan sonra, 40 mililitre taze kültür ortamı içeren 100 milimetre çapında bir Petri kabına yerleştirin.

Ardından, beş ila 10 Newton'luk bir yük hücresi ve 37 santigrat derecede tutulan bir PBS banyosuna uzanan tutamaklarla donatılmış bir mikro mekanik test cihazı kurun. Yapıyı Petri kabından çıkarın ve uzunlamasına testler için özel kavrama cihazlarına bağlayın ve jeli ezmeden yapının gazlı bez kısmına bağlanacak şekilde tasarlanmıştır. Test sırasında kavrama cihazlarının kaymasını önlemek için Teflon bant kullanın.

Ardından yapıyı mikro mekanik test cihazına monte edin. Ardından, yapıyı önce ilk ölçü uzunluğuna kadar gererek ve 10 dakika boyunca orada tutarak uzunlamasına yönde bir yorulma testi yapın. Daha sonra saniyede% 5 oranında %10'luk bir döngüsel gerinimin 30 döngüsünü uygulayın.

Numune çevresel yönde testler gerçekleştiremeyene kadar suşu% 10 döngüsel gerinimin artımlı adımlarıyla artırın. İlk olarak, numuneyi 10 milimetre uzunluğundaki halka yapılarına bölün. Ardından halkaları, tutamakların yerine kullanılan paslanmaz çelik çubuklara monte edin.

Boyuna yön testlerinde olduğu gibi, önce yapıyı ilk ölçü uzunluğuna kadar gerin ve 10 dakika boyunca orada tutun. Ardından, saniyede% 5 oranında %10'luk bir döngüsel gerinimin 30 döngüsünü uygulayın. Yapı olgunlaştıktan ve mandrelinden çıkarıldıktan sonra, her iki ucu rezervuara sabitleyin ve rezervuar tertibatına yerleştirin.

Burada gösterildiği gibi. Rezervuarın dışını 30 mililitre kültürle doldurun. Orta. Daha sonra, yapının lümen hacminin% 75'ini bir protein karışımı ile doldurun ve ardından yapının her iki ucunu da kapatın.

Protein çözeltisinin herhangi bir sızıntısını önlemek için, biyoreaktörü bir inkübatörün içine yerleştirin ve biyoreaktörü 4.02 çarpı 10'da eksi beşe kadar bir saat boyunca döndürün. Standart tekniklerle kültürlenen insan göbek damarı ve tial hücreleri hasat edin, %90 birleşik, Resus hücreleri askıya alın ve M1 99 kültür ortamını destekleyin. Ardından, insan göbek damarı ve ürotelyal hücreleri yapının lümenine bakın.

Santimetre kare başına 1000 hücre yoğunluğu ile, hücre çözeltisinin herhangi bir sızıntısını önlemek için yapının üst ekstremitelerini kapatın. Dönen duvar biyoreaktör kültüründe barındırılan yapıları, negatif 5G kuvvetine 4.02 kez 10 sabit bir dönüşle iki gün boyunca inkübe edin. Damar yapılarının statik olgunlaşması sırasında, hücresel yükselme yapılarının dış çapı hızla azalır.

Burada gösterildiği gibi, yapıların çapı, statik kültürün birinci gününde başlangıç değerlerinin %60'ı kadar azalmıştır. Yedinci günde, yapılar neredeyse %85 oranında azalmıştı: Yapıların hem uzunlamasına hem de çevresel gerinim döngüleri, kollajen bazlı yapıların tipik viskoelastik özelliklerini takip etti. Genel olarak, yapılar aynı gerinim aralığındaki çevresel yöne kıyasla uzunlamasına yönde daha güçlüydü, endotel yapıları üzerinde gerçekleştirilen Massen trikon boyaması oldukça homojen bir endotel gösterdi.

Düz kas hücreleri, iğ benzeri şekilli morfoloji sergiledi ve duvar boyunca homojen bir şekilde dağılmış gibi görünürken, endotel hücreleri luminal tarafta iyi yayılmış görünüyordu. Gelişiminden sonra. Bu teknik, biyomekanik ve rejeneratif tıp alanındaki araştırmacıların, tasarlanmış ve doğal dokuların mekanik davranışlarını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, vasküler yapıların nasıl hızlı bir şekilde tasarlanabileceğini ve nihayet dinamik bir cihazda mekanik koşullandırma için işlenecek ve kullanılabilecek kadar güçlü hale geldiğini iyi anlamış olmalısınız. Umarız çabalarımız ve sonuçlarımız, biyolojik fonksiyonel dokuların gelişimi için hücre dışı matriks modelindeki hücrelerin yüksek potansiyeli konusunda sizi ikna etmiştir.