Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma
14 Mayıs 2015
Bu protokol, serum içermeyen tek katmanlı bir yöntem kullanarak embriyonik kök hücrelerden nöral progenitörler üretme yöntemini ayrıntılı olarak açıklar. Bu progenitörler, olgun nöral hücre tiplerini türetmek veya nöral spesifikasyon sürecini incelemek için kullanılabilir ve bileşik tarama için çok kuyulu format ölçeklendirmesine uygundur.
Bu prosedürün genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerini, serum içermeyen tek katmanlı bir hücre kültüründe nöral bir soya farklılaştırmaktır. Bu, önce kültür kabının jelatin ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, embriyonik kök hücreler farklılaşma ortamında tek hücreli bir süspansiyon halinde ilişkilendirilir ve uygun kaplama yoğunluklarına seyreltilir.
Son adımda, hücreler jel ENC kaplı plaka üzerine ekilir. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu, ilgilenilen nöral belirteçlerin görselleştirilmesi yoluyla farklılaşmanın başarısını doğrulamak için kullanılır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, iyi bir farklılaşma elde etmek için uygun yoğunlukta kaplama kritik öneme sahip olduğundan, mücadele edeceklerdir.
Ve kaplama yoğunluğunu hem doğrudan hem de dolaylı olarak etkileyen birkaç faktör vardır. Kaplamadan önce, hücreler çözünene kadar 37 santigrat derece su banyosunda %1'lik bir jelatin alikotunu ısıtın. Daha sonra jelatini 500 mililitre ılık PBS ile karıştırın ve jelatin kaplanırken hücre kültürü kabının tabanını, yüzeyi kaplamaya yetecek kadar çözelti ile kaplayın.
Fare embr kök hücrelerinin alt birleşen kültürünü PBS'de iki kez durulayın. Daha sonra kültüre bir mililitre ayrışma reaktifi ekleyin. İki ila beş dakika sonra, tek tabakayı tek hücreli bir süspansiyona çıkarmak ve kültürü toplam 10 mililitre ortam ve hücre ayrışma reaktifi içinde toplamak için kaba dokunun.
Hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve bir santrifüjde döndürün. Daha sonra, supinatın dikkatli bir şekilde aspire edilmesinden sonra, peleti 10 mililitre ön ısıtma N iki B 27 içinde tüpün yan tarafına çukur açarak yeniden süspanse edin. Kabarcık oluşturmaktan kaçınmak için, şimdi konsantrasyonu kaydeden hücreleri sayın ve tabloya göre ön ısıtma N iki B 27'de oyuk başına hacim birimi başına uygun sayıda hücrede yeniden askıya alın.
Daha sonra jelatini kültür kabından aspire edin ve kabı döndürmeden hücreleri kaplayın. Kültürleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemli bir inkübatöre yerleştirin. Ortamı her bir ila iki günde bir değiştirmek.
Taze N iki B 27 ile hücreler, immünofloresan görüntüleme için hücreleri boyamak için dört ila altı gün içinde bir ekspresyon olan çorapları farklılaşmaya ve sergilemeye başlayacaktır. Farklılaşma ortamını kültürlerden çıkarın ve hücreleri 15 dakika sonra 500 mikrolitre% 4 Para formaldehit içinde sabitleyin, hücreleri iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve süzün. Daha sonra, hücrelerin bir saatlik inkübasyonu ile spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı bloke edin.
Bir mililitre PBS arasında, az önce gösterildiği gibi hücreleri yıkadıktan sonra bir plaka rocker üzerinde serum ile desteklenir. 500 mikrolitre fare IgG'de beta üç tübüline karşı, dört santigrat derecede plaka külbütör üzerinde bir gece inkübasyon için kültürlere. Ertesi gün.
Hücreleri yıkadıktan sonra, numuneleri floresan etiketli anti-US IgG ikincil antikoru içinde, bir saat sonra sallanarak ışıktan korunan oda sıcaklığında inkübe edin. Hücreleri tekrar durulayın ve beş dakika boyunca 500 mikrolitre DPI içinde boyayın. Son olarak, hücreleri son bir kez yıkadıktan sonra, dört santigrat derecede iki haftaya kadar PBS arasında saklayın.
Görüntülenene kadar. Bu deneyde, nöral farklılaşmayı izlemek için endojen bir SOX bir GFP raportörü olan fare embriyonik kök hücreleri kullanıldı. Altıncı günde, hücreler nöronal belirteç beta üç tübülin için sabitlendi ve boyandı.
Optimal yoğunlukta, hücreler nöral progenitörlere ve nöronlara farklılaşırken, daha yüksek yoğunluğa yerleştirildiğinde, SOX bir GFP ve beta üç tübülin pozitif hücre sayısının azalmasına neden oldu. Hücre kültürü kabının hacmi, optimum kaplama yoğunluğunu da etkiler. Örneğin, 96 oyuklu bir plakada büyütülen hücreler, bundan yaklaşık 10 kat daha yüksek bir hücre yoğunluğu gerektirir.
Hücreler, optimal ve iki birleşen hücre yoğunluğuna ulaşmak için altı kuyulu bir kültür kabında kaplandı. Farklılaşma sırasında, embriyonik kök hücreler yavaş yavaş morfolojilerini değiştirir. Örneğin, bu görüntülerde, optimum hücre yoğunluğunda yandıktan sonraki bir günden altıncı güne kadar hücre ve koloni morfolojisi gözlemlenebilir.
Dördüncü günde, hücreler, SOX bir GFP muhabirinden gelen yeşil floresan sinyalinin ortaya çıkmasıyla kanıt olarak nöral progenitörler haline gelmeye başlar. Ve altıncı günde, hücrelerin çoğu SOX bir pozitiftir. Bazı nöral olmayan hücrelerin varlığı beklense de Bu videoyu izledikten sonra, tek katmanlı hücre kültüründe fare emry kök hücrelerinin nöral farklılaşmasının nasıl başlatılacağını iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, serumsuz monokatman yöntemini kullanarak fare embriyonik kök hücrelerinin nöral öncüllere farklılaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu yaklaşım, olgun nöral hücre tiplerinin üretilmesine olanak tanır ve bileşik taraması için çok kuyucuklu format ölçeklendirmesine uygundur.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Kök Hücre Araştırmaları
Arka Plan
- Embriyonik kök hücreler çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilir.
- Nöral progenitörler, nöral gelişimin incelenmesi için gereklidir.
- Serumsuz kültür yöntemleri tekrarlanabilirliği artırabilir.
- Başarılı bir farklılaşma için uygun ekim yoğunluğu kritiktir.
Çalışmanın Amacı
- Nöral progenitörlerin üretimi için güvenilir bir yöntem oluşturmak.
- Nöral spesifikasyon süreçlerinin incelenmesini kolaylaştırmak.
- Nöral diferansiyasyonu etkileyen bileşiklerin yüksek çıktılı taramasını sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kültür kaplarının jelatin ile kaplanması.
- Embriyonik kök hücrelerden tek hücre süspansiyonu oluşturulması.
- Hücrelerin jelatinle kaplanmış plakalara ekilmesi.
- Diferansiyasyon başarısını doğrulamak için immünofloresan mikroskobunun kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Embriyonik kök hücrelerin nöral öncüllere başarılı şekilde diferansiyasyonu.
- Nöral belirteçlerin görselleştirilmesi diferansiyasyonu doğrular.
- Etkili diferansiyasyon için optimal ekim yoğunluklarının belirlenmesi.
- Yöntem, bileşik tarama uygulamaları için ölçeklendirilebilir niteliktedir.
Sonuçlar
- Serumsuz monokatman yöntemi, nöral progenitör üretimi için etkilidir.
- İmmünofloresan, diferansiasyonu değerlendirmek için güvenilir bir tekniktir.
- Bu protokol, nörobilimdeki çeşitli araştırma uygulamaları için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu protokol, nörobilim ilaç keşfinde erken aşama hedef doğrulamasını ve mekanistik risk azaltmayı destekleyerek, tanımlanmış, serumsuz bir monokatman sisteminde fare embriyonik kök hücrelerinden ölçeklenebilir nöral progenitor üretimine olanak tanır. Yöntem, bileşiklerin nöral diferansiyasyon üzerindeki etkilerini değerlendirmek için tekrarlanabilir ve kantitatif bir platform sağlayarak, ön klinik süreçlerde öncü bileşik tanımlamasını ve öngörülebilirlik güvenini kolaylaştırır. Reporter hatları ve yüksek yoğunluklu kültür formatlarıyla uyumluluğu, yolak modülasyonu ve hedef etkileşim çalışmaları için tarama iş akışlarına entegrasyona imkan verir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Yönlendirilmiş farklılaşma yoluyla nöral belirleme mekanizmalarının sorgulanmasına ve nörogelişimsel hedeflerin fonksiyonel validasyonuna olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Deneyler ve hücre hatları genelinde değişkenliği azaltan ve tekrarlanabilirliği artıran, tanımlanmış, serumsuz bir sistem sağlar.
- Öngörücü Değer: Bileşik kaynaklı nöral öncül hücre verimi ve marker ekspresyonundaki değişimlerin değerlendirilmesini destekleyerek, hedef etkileşimi ve yolak modülasyonu hakkında bilgi sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Bileşik tarama ve nöral farklılaşmanın fenotipik değerlendirmesi için uygun, homojen bir nöral progenitör popülasyonu oluşturur.
- Operasyonel Değer: Ölçeklenebilir ekim yoğunluğu optimizasyonu ile çok kuyucuklu formatlara (örneğin, 96 kuyucuklu) uyarlanabilir; orta ve yüksek kapasiteli uygulamalara olanak tanır.
- Analiz Hazırlığı: Farklılaşma verimliliğinin ve marker ekspresyonunun çok parametreli analizi için immunofloresans, akış sitometrisi ve moleküler okumalarla uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Nöral progenitör üretiminden fonksiyonel nöron ve glia olgunlaşmasına kadar ilerlemeye olanak tanıyarak hastalığa özgü modellemeyi destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Nöral spesifikasyonu gerçek zamanlı olarak izlemek için reporter hatlarını (örneğin, SOX1-GFP) kullanarak soy taahhüdü ve diferansiyasyon dinamiklerinin çalışılmasını kolaylaştırır.
- Preklinik Yararlılık: Bileşiklerin nöral olgunlaşma ve glial diferansiyasyon üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesini sağlayarak güvenlik farmakolojisi ve etki mekanizması çalışmalarını destekler.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, nöral farklılaşmanın mekanistik sorgulaması yoluyla hedef doğrulamayı destekleyerek ve nörobilim portföylerinde bileşik taraması için assay geliştirmeyi mümkün kılarak erken keşif sürecine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Yönlendirilmiş farklılaşma ve marker tabanlı okumalar aracılığıyla nörogelişimsel yolların hipotez testlerini ve hedef validasyonunu destekler.
- Tarama: Monolayer kültürde assay standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği sağlar; burada ekim yoğunluğu, tutarlı nöral progenitor üretimi için kritik bir parametredir.
- Analitikler: Farklılaşma verimliliğini ve bileşik yanıtını ölçmek için immünofloresan (örneğin, SOX1-GFP, βIII-tubulin) ve akış sitometrisi yoluyla kantitatif çıktılar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Erken nöral progenitor üretimini, fonksiyonel nöron ve glialara dönüşen alt olgunlaşma süreçleriyle ilişkilendirerek preklinik sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Tanımlanmış ve ölçeklenebilir protokol; birden fazla ESC hattı, kültür kabı ve tarama kampanyası genelinde yeniden kullanımı destekleyerek yeniden geliştirme çabasını azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nöral farklılaşma yollarındaki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş, serumsuz koşullar, farklı laboratuvarlar ve hücre hatları arasında tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Bileşiklerin nöral soy taahhüdü ve farklılaşma verimliliği üzerindeki etkilerinin erken değerlendirilmesine olanak tanıyarak devam/dur kararlarına temel oluşturur.
- Portföy Etkisi: Mekanistik risk azaltma ve yolak doğrulama yoluyla nörobilim hedeflerinin risk odaklı önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Kök hücre kültürü, farklılaşma teknikleri ve immünofloresan mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- CO2 inkübatörlerine, santrifüjlere, mikroskoplara ve jelatin, N2B27, disosiyasyon reaktifleri ve antikorlar gibi reaktiflere erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilirliği sağlamak için kullanıcılar ve merkezler arasında ekim yoğunluğunun ve jelatin kaplama prosedürlerinin standartlaştırılması gereklidir.
- Farklı ESC hatlarına veya reporter konstrüktlarına adaptasyon; ekim yoğunluğunun ve farklılaşma zamanlamasının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında, ekim yoğunluğuna karşı hassasiyet ve topaklanmayı veya eksik tek hücre süspansiyonunu önlemek için dikkatli monokatman disosiyasyonu ihtiyacı yer alır.
