Name: Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerinin sinir soyu hücrelerine serum içermeyen tek tabakalı kültürde farklılaşmasını. Bu yöntem sinir gelişimi ve yüksek verimli bileşik taraması için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma, Tayland Eğitim Bakanlığı'ndan W.W.'ye Bilim ve Teknolojinin Geliştirilmesi ve Teşviki bursu ve Tenovus ve Anonymous Trust'tan MPS'ye verilen hibelerle finanse edildi.

1. Medya Hazırlık Not:: 1 oranında, tipik olarak 1, B27 eki ile takviye modifiye N2 ek ve Neurobasal ile desteklenmiş DMEM / F12: Protokol iki ayrı ortam karışımı kullanımına dayanır. <ol><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde bileşenlerin karıştırılması ile değiştirilmiş N2 ek hazırlayın. Vorteks veya bu filtre etmeyin; çözüm netleşene kadar tersini tüp karıştırın. <ol><li> Daha sonra, (0.01 M HCl içinde yapılır) 25 mg / ml insülin 1 ml ilave edilir ve tersini tüp iyice karıştırın, DMEM / F12 içinde 7.2 ml pipetleme başlayın. Çözelti berrak olana kadar bu birkaç dakika sürer. </li><li> (Su içinde oluşan), 100 mg, 1 ml / ml apo-transferrin, mi progesternone (etanol içinde oluşan) / 0.6 mg 33 ul, 160 mg / ml (1 M), putreskin, 100 ul (su içinde yapılan ), 10, su içinde yapılır 3 mM sodyum selenit () ve% 7.5 sığır serum albümini 666 ul ul ve de tüp karıştırın. -20 ° 2.5 ml kısım ve mağaza2 aya kadar ısıtılır. </li></ol></li><li> Ortamı hazırlayın. <ol><li> DMEM / F12 içinde 250 ml&#39;lik bir N2 2.5 ml. İyice karıştırın ama sallamak ya da filtre yoktur. </li><li> Neurobasal 250 ml&#39;lik ortam B27 ek 5 ml ekleyin. İyice karıştırın ama sallamak ya da filtre yoktur. </li><li> : 1 oranında bir 1 adım 1.2.1 ve 1.2.2 medya karıştırın. 1 Bazı durumlarda: 3 karışım gerekebilir (: Adım 1.2.4 1 mix 1 olarak desteklenmiş). </li><li> Karışımına L-glutamin (son konsantrasyon 0.2 mM) ve 2-merkaptoetanol (nihai konsantrasyon 0.1 mM) 3.5 ul 0.5 ml ilave edilir ve çalkalamadan iyice karıştırın. En fazla 3 hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilir ve ortam ışığına maruz kaçının. Bu son karışım N2B27 olarak adlandırılır. </li></ol></li><li> Jelatin çözeltisi hazırlayın. <ol><li> 15 dakika boyunca, 121 ° C, 15 psi, ultra saf su ve otoklav içinde% 1 jelatin çözeltisi hazırlayın. Bunun için kullanılan şişe deterjan veya dezenfektan tamamen temiz olması önemlidir, bu yüzden yeni bir şişe tavsiye edilirBu işlem için kullanılan ve sadece hiç kullanımlar arasında, aşırı saf su içinde çalkalanır. 50 ml&#39;lik miktarlar halinde% 1 çözeltisi eş-payı ve ay için 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> Çözülene kadar 37 ° C su banyosu içinde,% 1 jelatin bir kısım ısıtın ve ılık fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 500 ml ekle. İyice karıştırın ve iyi ya da plaka her alt karşılamak için yeterli pipetlemeyin. En az 30 dakika süreyle kaplamak için jelatin satıh izin verir. </li></ol></li></ol> 2. Hücreler Kaplama NOT: Bu protokol, lösemi önleyici faktör (LİF), LİF ve kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) veya MEK ve GSK3 inhibitörlerinin (2R ortam) sahip LIF ve serumsuz ortam ile, serum yerine% 10 serum içinde yetiştirilen fare ESC için de geçerlidir veya LİF yoktur. Bununla birlikte, farklılaşma zamanlaması ve verimlilik ortam ve hücreler (tartışmaya bakınız) bağlı olarak değişebilir. Burada gösterilen deneyler için biz bir EGFP muhabiri o içine çaldı vardır (46C fare ESC hattını kullanılan% 10 serum ve LİF ile GMEM yetiştirilen endojen Sox1 allel NE). En iyi sonuçlar için, hücreler ayrılmış ve N2B27 ortam içinde yeniden kaplanmıştır olması önemlidir; N2B27 zaman hücrelerin şarjı ile karşılaştırıldığında daha düşük bir farklılaşma verimi ile sonuçlanır basitçe GMEM / serum / LİF ortamların değiştirilmesi. <ol><li> % 10 serum, 1 mM sodyum piruvat, 1 x esansiyel olmayan amino asitler ile GMEM hücreler büyümek 0.1 M 2-merkaptoetanol ve 100 birim / ml LİF 13. Fare ESC, plaka SUBCONFLUENT kültürünü almak için 2 götürecek bir T25 kültür balona 1 x 10 6 hücre - 3 gün. </li><li> Aydınlık alan mikroskobu altında hücreleri gözlemleyin. Hücreler geçişine SUBCONFLUENT ve hazır olduğunuzda, PBS içinde iki kez yıkayın. Hücre ayrışma reaktifi 1 ml ilave edilir ve 2 için inkübatöre geri - 5 dak. Tripsin ve diğer enzimler de hücre ayrılma için kullanılabilmesine rağmen kaplama yoğunlukları olması gerekir, bu yüzden onlar Adju hücre eki üzerinde olumsuz bir etkisi olabilirsted. </li><li> Hücreler plaka kaldırmaya başlıyor sonra, tek bir hücre süspansiyonu içine çıkarmak için gemi dokunun. 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine ortam ve hücre ayrışma reaktif ve pipet 10 ml toplam içine hücreleri toplamak. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücreleri dönerler. </li><li> Dikkatle süpernatant aspire ve aşağı 3 yukarı pipetleme tarafından önceden ısıtılmış N2B27 10 ml pelletini - 5 kez. Aşağı süspansiyon pipetleme yaparken, tüpün kenarına pipet hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için. Otomatik hücre sayacı veya haemocytometer ile hücre sayımı ve konsantrasyon kaydedin. </li><li> Birim hacim başına hücre istenen sayıda ihtiva eden bir hücre süspansiyonu önceden ısıtılmış N2B27 içinde oyuk başına kaplama için hazırlayın. 6-çukurlu tabak cm2 başına 10,500 hücre olan bir yoğunlukta (yani, 6-çukurlu tabak oyuk başına 1 x 10 5 hücre) en uygunudur. Cm2 ve pla başına hücre önerilen sayıda Tablo 1&#39;e bakınızHücre kültürü damarlarının çeşitli ting medya hacimleri. </li><li> Kültür kabından jelatin aspire ve Tablo 1&#39;de önerilen yoğunluğu ve hacmine göre hücre süspansiyonu plaka. Bu merkeze hücreleri konsantre olacak gibi plakaları girdap etmeyin. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de nemli bir inkübatörde kültür yerleştirin. </li><li> Taze N2B27 ile tüm medya değiştirerek 2 gün - her 1 ortam değiştirin. Pipet hafifçe yoğunluğunu etkiler ve önümüzdeki günlerde farklılaşma verimliliği azaltmak olabilir hücreleri kızarma olarak. Kaplama sonraki ilk canlılık yoksul olduğu durumlarda, 1 hücreleri plaka: N2 ve B27-desteklenmiş medya 3 karışımı ve ilk iki gün sonra N2B27 bu değiştirin. Hücreler ayırt başlayacak ve 4 içinde (burada kullanılan 46C hücre hattında muhabiri yeşil floresan görünür) Sox1 ifadesini göstermesi gerekir - 6 gün. </li></ol> 3. Immunofluorescent Boyama HAYIRTE: protokol her gemi tipine uygulanabilir. her reaktif hacmi 6-çukurlu plaka içinde çukur başına anlatılan herhangi bir yüzey alanına ölçeklendirilebilir. Şarjı sonradan düşük canlılığı nedeniyle tavsiye edilmez. <ol><li> Farklılaşma Ortamı çıkarın ve 4,% 500 ul (h / h) paraformaldehit eklenerek hücrelerin tespit, 15 dakika boyunca bırakın. </li><li> Yıkayıp ((hac / hac) Tween-20% 0.5 fosfat tamponlu tuzlu su), iki kez PBS-T 2 ml hücre geçirgenliği. Hücreler, 4 ° C&#39;de 2 aya kadar PBS-T içinde tutulabilir. </li><li> % 10 (sekonder antikor ile aynı türden) (v / v) serumu ile PBS-T, 1 ml PBS-T değiştirin. Herhangi bir spesifik olmayan bağlanma bloke etme oda sıcaklığında levha rocker 1 saat inkübe edin. </li><li> 1 saat sonra, PBS-T 2 ml hücreler iki kez yıkayın ve βIII-tubulin karşı 500 ul fare IgG inkübe (:% 10 serum ile PBS-T içinde 1000: 1 seyreltilmiş). Plaka rocker koyun ve 4 ° C&#39;de O / N bırakın. </li><li> Bu adımdan itibaren, her zaman gemiyi korumakışıktan. Daha sonra (% 10 serum ile PBS-T içinde 2 ug / ml&#39;ye seyreltilmiş) floresan-etiketli anti-fare IgG antikoru 500 ul PBS-T ile hücreler iki kez yıkanır. Oda sıcaklığında 1 saat plaka rocker koy. </li><li> Daha sonra DAPI 500 ul PBS-T ile hücreler iki kez yıkayın (PBS-T içinde 0.5 ug / ml&#39;ye seyreltilmiş) ve 5 dakika boyunca bırakın. </li><li> Tekrar hücreleri yıkayın ve PBS-T saklayın. Hücreler çekilmeye hazır olduğunu ve 4 ° C&#39;de 2 haftaya kadar saklanabilir. Bu sabit ve canlı hücre ya da farklı zamanlarda, sabit hücrelerde GFP yoğunluğunu karşılaştırma uygunsuz şekilde GFP sinyali, zaman içerisinde kaybolur edin. </li></ol>

<ol><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li>
<li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li>
<li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1%2F2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li>
<li>Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+orchestrates+fibroblast+growth+factor+signalling+to+drive+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 137, 881-890 (2010).</li>
<li>Speakman, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li>
<li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+stimulation+of+the+Erk1%2F2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li>
<li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells%3A+a+new+ES+cell+regulatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).</li>
<li>Aubert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+mammalian+neural+genes+via+fluorescence-activated+cell+sorter+purification+of+neural+precursors+from+Sox1-gfp+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).</li>
<li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li>
<li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

tek tabaka sinir farklılaşma protokolü on üzerinden 6 kullanımda olmuştur. Protokol tanımlanan ortam oluşan ve pratik için sistem daha uygulanabilir kılan bir tek-tabakalı sistemde yapılır, yüksek verimli (örneğin, ilaç tarama) kullanır. Ancak, farklılaşma etkinliğini belirleyen bazı kritik faktörler vardır. Bu makalede, bu faktörleri ve her engel için çözüm işaret ediyor. Farklılaşma durumu kaplama sonrası hücrelerin yoğunluğu belki de en önemli faktördür. Çok düşük yoğu...

Embriyonik kök hücreler, sinjeneik ya da bağışıklık yetersizliği konaklara (a Kimera oluşturarak) uygun bir aşamada embriyo yeniden yerleştirilmesi, aşağıdaki tüm yetişkin hücre tiplerine farklılaşma yetisine, enjeksiyon koruyarak, in vitro olarak sonsuza çoğalma kapasitesi ile erken embriyodan türetilen pluripotent hücreler (Bir teratom oluşturarak) ya da uygun işaretlere 1 in vitro konu. Nöral soy içine fare embriyonik kök hücrelerinin in vitro farklılaşması ve 1995 tarif edilmiştir ve morfojen retinoik asit ile takviye edilmiş 2-4 serum ihtiva eden ortam içinde çok-hücreli süspansiyon agregatların oluşumunu (embriyoid organları, EBS) yer aldı. O zamandan bu yana çeşitli protokoller nöral farklılaşma 5 izin vermek için geliştirilmiştir. Hala toplanmasını kullanmak Birçok diğerleri hücre tipleri indükleyici ile-kültür co ve çeşitli serum serbest medya kullanımını içerir. Tüm protokoller avantajlara bir olmasınd dezavantajları ve sinirsel hassas doğası veya nöronal hücreleri de kullanılan protokole göre değişir üretti. İdeal protokol, sağlam ölçeklenebilir olması ve tam olarak tanımlanmış medya ve yüzeylerde faydalanmak, farklılaşma sürecinin non-invazif izleme için uygun olmalı ve mümkün sinirsel atalarıdır saf popülasyonlarının nesil neden dış ipuçlarının tarafından ve ayırt desenli olmak istiyorum nispeten kısa bir süre içinde yüksek verim ve verim bütün nöronal ve glial alt tiplere. Son düzine yıllarda biz bir düşük yoğunluklu, serum serbest yapışık tek tabaka kültürü 6-10 fare ESC nöral atalarıdır ve nöronlar üretmek için bir yöntem kullanıyoruz. Bu protokol, yukarıda belirtilen kriterler içinde, birçok yerine getirir: Elimizdeki farklılaşma verimliliği oldukça uzun yıllar boyunca tutarlı ve hücre çizgileri, çeşitli olmuştur, bu yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir edilebilir (başarıyla 96 oyuklu plakalar, damar kullanımı 15 cm çapında dio kız) ve kullanılan ortam iyi tanımlanmış bulunmaktadır. süreci (dopaminerjik nöronların 6 örneğin, Shh ve FGF8) nöronal alt tiplerinin farklı tiplerinin üretimini indüklemek için ilave edilebilir farklılaşma izlenmesi ve desen ipuçlarının çeşitli timelapse mikroskopi elverişlidir. Yine, bu protokolün başarılı bir uygulama için bazı zorluklar vardır. Anahtar yönlerinden biri medyanın dikkatli bir hazırlık olduğunu. Biz her zaman ticari alternatiflerin varlığına rağmen içi ortam hazırlar. Kullanılan takviyeleri biri (N2; Protokolü bakınız) standart piyasada mevcut sürümleri üzerinde değişiklikler vardır. Son olarak, bu yöntemin başarılı bir uygulama için en önemli adımlardan biri kaplama optimum hücre yoğunluğudur. Uyaran sinyallerin biri (Fgf4 11) otokrin yapısı gerektirirken, bu yeterli hücre uygun viabil izin vermek için mevcut olması esas olarakçok yüksek yoğunlukları farklılaşma de Sığ ve farklılaşma, (nedeniyle LIF 12 otokrin üretimine muhtemelen kısmen) bozulur. Hem medya hazırlama ve hücre kaplama özenle yapılır ve sürekli optimum sonuçlar sağlamak için bu nedenle önemlidir.

<table><tbody><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Hücre Ayrışması Reaktifi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi, serumsuz</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>Steril 0.01 M HCl</td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td> ile <td>sulandırın Steril su ile sulandırın</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>Etanol Putresin ile sulandırın</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Steril su ile sulandırın</td></tr><tr><td>Sodyum selenit</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td>Steril su ile sulandırın</td></tr><tr><td>Sığır albümin fraksiyonu V</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030-081</td><td>Glutamin genellikle çökeltildiği için kullanmadan önce tamamen çözündüğünden emin olun</td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu doku kültürü kabı</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu doku kültürü kabı</td><td>Thermo Bilimsel</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu doku kültürü kabı</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel olmayan amino asit çözeltisi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr> Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods <tr><td></td><td></td><td></td> Tween-20 Sigma P1379 <td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542'de</td><td></td></tr> <tr><td>olduğu gibi kurum içinde hazırlanan</td> <td>lösemi inhibitör faktör</td> Işıktan koruyun Fare anti ve beta;<td></td><td></td></tr><tr><td> III tübülin IgG antikoru</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Floresan etiketli anti-fare IgG antikoru</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A31571</td><td>Işıktan koruyun</td></tr><tr><td>25 cm2 doku kültürü şişesi</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

serum serbest tek tabakalı kültüründe fare embriyonik kök hücre sinir farklılaşma

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

nöral progenitörlerin fare embriyonik kök hücreleri ayırt etmek yeteneği (ESC) nöral özellikleri yanı sıra, daha fazla çalışma için olgun nöral hücre tiplerinin üretimini kontrol eden mekanizmaların çalışmasını sağlar. Bu protokolde serum serbest, tek tabaka kültürü kullanarak sinir atalarıdır için ESC farklılaşması için bir yöntem açıklanmaktadır. yöntem, etkili, ölçeklenebilir ve 4 içinde% 70 nöral projenitör hücrelerinin ~ üretimi ile sonuçlanır - 6 gün. Bu, çeşitli koşullar altında yetiştirilen çeşitli suşlardan ESC uygulanabilir. Sinir progenitörler, mikroskopla fonksiyonel nöronlar ve glia veya analiz içine daha ayırt sitometri veya moleküler teknikler akmasına izin verilebilir. farklılaşma süreci zaman atlamalı mikroskopi için uygun olduğunu ve nöral şartname sürecini izlemek üzere raportör hatlarının kullanımı ile kombine edilebilir. Biz sürecin b izin medya hazırlanması ve hücre yoğunluğu optimizasyonu hakkında ayrıntılı yönergeler sağlarE en ESC hatları ve hücre kültür kapları çeşitli uygulanan.

Bu deneyde, nöral farklılaşma izlemek için, bir endojen Sox1-GFP raportör ile, fare embriyonik kök hücreleri 46C hücre hattı 14 kullanılır. Sox1 nöral progenitor için bir marker Bu hücre hattı, ifade kullanılarak, yeşil floresan tespit edilebilir. Yoğunluğu Kaplama nöronal farklılaşma elde etmek için kritik bir faktördür. Fare embriyonik kök hücreleri / cm2 10,500 88.500 hücre arasında değişen farklı yoğunluklarda 6-çukurlu plaka içinde plakalanmıştır. Şekil 1A, 6-çukurlu plaka içi...

Bu protokol, serum içermeyen tek katmanlı bir yöntem kullanarak embriyonik kök hücrelerden nöral progenitörler üretme yöntemini ayrıntılı olarak açıklar. Bu progenitörler, olgun nöral hücre tiplerini türetmek veya nöral spesifikasyon sürecini incelemek için kullanılabilir ve bileşik tarama için çok kuyulu format ölçeklendirmesine uygundur.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Bu prosedürün genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerini serumsuz bir monokatman hücre kültüründe nöral bir soy hattına farklılaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle kültür kabının jelatin ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, embriyonik kök hücreler farklılaştırma ortamında tek hücre süspansiyonu haline getirilir ve uygun ekim yoğunluklarına seyreltilir.Son adımda, hücreler gel ENC kaplı plakaya ekilir. Nihayetinde, ilgili nöral belirteçlerin görselleştirilmesi yoluyla farklılaşmanın başarısını onaylamak için immünofloresan mikroskopi kullanılır. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaktır çünkü uygun yoğunlukta ekim yapmak, başarılı bir farklılaşma elde etmek için kritik öneme sahiptir.Ekime yoğunluğunu doğrudan ve dolaylı olarak etkileyen birkaç faktör vardır. Hücreleri ekmeden önce, %1 jelatin içeren bir alikotu, çözünene kadar 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın. Ardından jelatini 500 mL ılık PBS ile karıştırın ve jelatin kaplama yaparken, hücre kültürü kabının tabanını yüzeyi kaplayacak kadar bu çözeltiyle doldurun.Subkonflüen fare embriyonik kök hücre kültürünü iki kez PBS ile durulayın. Ardından kültüre bir mililitre disosiyasyon reaktifi ekleyin. İki ila beş dakika sonra, monokatmanı tek hücre süspansiyonu haline getirip yerinden çıkarmak ve kültürü toplam 10 mililitre besiyeri ve hücre disosiyasyon reaktifi içinde toplamak için kaba hafifçe vurun.Hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve santrifüjle çöktürün. Ardından, süpernatantı dikkatlice aspire ettikten sonra, peleti tüpün kenarına vurarak önceden ısıtılmış N two B 27'nin 10 mililitresi içinde yeniden süspanse edin. Kabarcık oluşumunu önlemek için, konsantrasyonu kaydederek hücreleri sayın ve tabloya göre, önceden ısıtılmış N two B 27 içerisinde her kuyucuk için birim hacim başına uygun hücre sayısında yeniden süspanse edin.Ardından jelatini kültür kabından aspire edin ve kabı çalkalamadan hücreleri ekim yapın. Kültürleri 37 °C ve %5 karbondioksit içeren nemli bir inkübatöre yerleştirin. Besiyerini bir ila iki günde bir yenileyin.Taze N2 B27 ile hücreler farklılaşmaya başlayacak ve dört ila altı gün içinde SOX1 ekspresyonu gösterecektir; hücreleri immunofloresan görüntüleme için boyamak üzere, kültürlerden farklılaşma ortamını uzaklaştırın ve hücreleri 500 µL %4 paraformaldehit ile fiksasyon yapın. 15 dakika sonra hücreleri iki kez 2 mL tween içeren PBS ile yıkayın ve permeabilize edin. Ardından, hücreleri bir saat inkübe ederek spesifik olmayan tüm bağlanmaları bloke edin.Hücreler az önce gösterildiği gibi yıkandıktan sonra, plak sallayıcı üzerinde serum takviyeli bir mililitre PBS tween içerisinde bekletilir. Kültürlere, dört derece Celsius'ta plak sallayıcı üzerinde gece boyunca inkübasyon için 500 mikrolitre beta üç tubulin karşıtı fare IgG eklenir. Ertesi gün.Hücreleri yıkadıktan sonra, örnekleri floresan işaretli anti-US IgG sekonder antikoru ile oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak ve sallayarak bir saat boyunca inkübe edin. Hücreleri tekrar durulayın ve 500 microliters DPI ile beş dakika boyunca boyayın. Son olarak, hücreleri son bir kez daha yıkadıktan sonra, dört degrees Celsius'ta iki haftaya kadar PBS tween içinde saklayın.Görüntüleme yapılana kadar. Bu deneyde, nöral farklılaşmayı takip etmek için endojen SOX1 GFP raporlu fare embriyonik kök hücreleri kullanılmıştır. Altıncı günde, hücreler fikse edilmiş ve nöronal marker beta 3 tubulin için boyanmıştır.Optimal yoğunlukta hücreler nöral öncüllere ve nöronlara farklılaşırken, daha yüksek yoğunlukta ekim yapılması SOX1 GFP ve beta three tubulin pozitif hücre sayısının azalmasıyla sonuçlanmıştır. Hücre kültürü kabının hacmi de optimal ekim yoğunluğunu etkilemektedir. Örneğin, 96 kuyucuklu plakada büyütülen hücreler, bunun yaklaşık 10 katı daha yüksek bir hücre yoğunluğu gerektirir.Hücreler, optimal ve iki konfluens hücre yoğunluğuna ulaşmak için altı kuyucuklu bir kültür kabına ekilmiştir. Diferansiyasyon sırasında, embriyonik kök hücreler morfolojilerini kademeli olarak değiştirirler. Örneğin, bu görüntülerde, optimal hücre yoğunluğunda ekimden sonraki birinci ile altıncı günler arasındaki hücre ve koloni morfolojisi gözlemlenebilir.Dördüncü günde, SOX1 GFP raporundan gelen yeşil floresan sinyalin ortaya çıkmasıyla kanıtlandığı üzere, hücreler nöral progenitörlere dönüşmeye başlar. Altıncı güne gelindiğinde ise hücrelerin çoğu SOX1 pozitiftir. Bazı nöral olmayan hücrelerin bulunması beklense de, bu videoyu izledikten sonra fare embriyonik kök hücrelerinin tek katmanlı hücre kültüründe nöral diferansiyasyonunun nasıl başlatılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz motor nöronlar içine fare embriyonik kök hücreleri in vitro ayrımında verimliliğini artırmak için yeni bir protokol geliştirdi. Farklılaşmış ES hücreleri motor nöronlar gibi immünohistokimyasal teknikler kullanılarak nöron ve motor nöron belirleyicilerin ekspresyonu ile kanıtlandığı özellikleri satın aldı.

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Video, fare embriyonik kök hücrelerinden nöral progenitörler oluşturmak için serumsuz ortam kullanan bir protokolü göstermektedir. Serumsuz ortamda süspanse edilen embriyonik kök hücrelerin istenen konsantrasyonu, jelatin kaplı lameller üzerine kaplanır. Optimal bir hücre yoğunluğunda, hücreler, serumsuz ortamdaki nöral farklılaşmayı indükleyen faktörlerle birlikte, embriyonik kök hücrelerin nöral progenitörlere farklılaşmasını tetikleyen otokrin sinyal faktörleri üretir.

Serumsuz Monotabaka Kültürlerde Embriyonik Kök Hücrelerden Nöral Progenitörlerin Üretilmesi

Bu video, fare embriyonik kök hücrelerinden (mESC'ler) nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) in vitro olarak üretilmesi için bir yöntemi göstermektedir. mESC'ler, embriyoid cisimcikleri (EB'ler) oluşturmak için süspansiyon halinde kültürlenir ve daha sonra yapışık bir kültürde retinoik asit tedavisi yoluyla NPC'lere farklılaşmaya yönlendirilir.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitör Hücreler Üretmek İçin Bir Teknik

Video, nöral progenitör hücreleri nöronlara ayırmak için bir hücre kültürü yöntemini gösterdi. Hücreleri, büyüme faktörleri ile desteklenmiş, besin açısından zengin bir ortamda inkübe ederek, progenitör hücreler, gelişmiş aksonlar ve dendritler ile nöronlara olgunlaştı. Stabilize edici bir ajan, hücre canlılığını sağladı ve farklılaşma süreci boyunca oksidatif hasara karşı koruma sağladı.

Nöral Progenitör Hücrelerin Nöronlara Farklılaşması

Bu video, işleyen sinapslara sahip ağa bağlı bir nöron popülasyonuna embriyonik kök hücre farklılaşması için bir tekniği göstermektedir. Embriyonik kök hücrenin nöronlara farklılaşması, nöronal ağ oluşumunun indüklenmesi ve kültürün ağa bağlı nöronlarla zenginleştirilmesi ile ilgili aşamaları ana hatlarıyla belirtir.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerini Ağa Bağlı Bir Nöron Popülasyonuna Farklılaştırmak

Embriyo kültürlerinde kullanılan serum, özellikle sinyalizasyon etkileşimler içeren çalışmalarda deney sonucunu etkileyebilecek bilinmeyen bileşenleri içerir. Burada bir serum içermeyen kültür sistemi kullanılan oksijenli ve 16-40 saat süre ile kültüre orta gebelik fare embriyo utero gelişen embriyo benzer morfolojik gelişimini gösteren göstermektedir.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

İki ya da üç boyutlu bir embriyoit gövdeleri oluşturmak için fare embriyonik kök hücreleri kullanılarak bir tekniği açıklar. Daha sonra progenitör hücre işaretleyici immünofloresan ve immün farklılaşma hallerindeki analiz retinoik asit ve ne göre embriyoit vücut hücrelerinin sinir farklılaşmasını uyarmak üzere açıklar.

İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Burada sunulan insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli kültür ve nöral progenitor hücrelere sonraki farklılaşma için bir protokoldür. Protokol basit, sağlam, ölçeklenebilir ve ilaç tarama ve rejeneratif tıp uygulamaları için uygundur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerinin sinir soyu hücrelerine serum içermeyen tek tabakalı kültürde farklılaşmasını. Bu yöntem sinir gelişimi ve yüksek verimli bileşik taraması için uygundur.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

Daha fazla video keşfet