Bir Aquatic Mikrobiyal Metaproteomics İş Akışı: Tandem Kütle Spektrometre tabanlı analiz için uygun Triptik Peptitler için Hücreleri itibaren

Bu prosedürün amacı, deniz suyundan elde edilen mikrobiyal biyokütleden protein ve DNA ekstraksiyonu gerçekleştirmek ve ardından tandem kütle spektrometrisi tabanlı proteomik analiz için triptik peptitler üretmektir. Bu işlem, öncelikle bir kartuş filtre üzerinde biriktirilmiş hücrelerin lizize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hücre lizatının ultrasantrifüj filtre üniteleri kullanılarak konsantre edilmesidir.

Ardından, lizat protein çöktürme ve DNA çöktürme işlemleri için iki fraksiyona ayrılır. Son adımda, proteinlerin jel içi tripsin sindirimi gerçekleştirilir ve sıvı kromatografisi, tandem kütle spektrometrisi analizine uygun peptitler ekstrakte edilir. Nihayetinde, örnekteki eksprese olan proteinleri tanımlamak için sonraki biyoinformatik analizler kullanılabilirken, izole edilen DNA metagenomik ve/veya 16 S-R-R-N-A gen analizi için kullanılabilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hem proteinin hem de DNA'nın aynı örnekten eş zamanlı olarak izole edilebilmesidir. Başlamak için, filtre santrifüjünün luer lock ucuna takılı 60 mL'lik bir şırınga kullanarak, RNA stabilizasyon solüsyonunu kartuş filtre ünitesinden iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne boşaltın; hücresel kalıntıları çöktürmek için iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpünü 10 dakika boyunca 17.000 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatanı, örnekten liz olmuş hücrelerden kaynaklanan proteinleri tutmak için bir 10 K ultra santrifüj filtre ünitesine aktarın.

Peleti atmayın. Ultra santrifüj filtre ünitesini 3.270 xg'de 30 dakika boyunca veya hacim yaklaşık 600 µL'ye düşene kadar santrifüjleyin. Bu sırada, bir P10 pipet ucunun ucunu eritin ve kartuş filtre ünitesinin luer lock olmayan tarafını pipet ucunun açık ucuyla kapatın.

Bu işlem, sonraki adımlarda ekstraksiyon tamponunun ve biyokütlenin dışarı sızmamasını sağlayacaktır. Pelleti bir mililitre SDS ekstraksiyon çözeltisi içinde süspanse edin ve orijinal kartuş filtre ünitesine pipetleyin. Kartuş filtre ünitesine pipetlemenin en kolay yolu, bir P 200 ucunu bir P 1000 ucunun üzerine üst üste getirerek bu çift ucu pipetleme için kullanmaktır. Toplam hacim yaklaşık iki mililitre olacak şekilde kartuş filtre ünitesine bir mililitre daha SDS ekstraksiyon çözeltisi ekleyin.

Parafilm. Kartuş filtre ünitesinin luer-lock ucunu kapatın ve kartuş filtre ünitesini 50 mililitrelik tüpün içine yerleştirin. Ardından, 50 mililitrelik konik tüpün tabanına üç adet buruşturulmuş laboratuvar mendili yerleştirin.

Kapağı kapatın ve tüpü, döndürerek oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmek üzere hibridizasyon fırınına yerleştirin. 10 dakika sonra, filtreyi bir köpük yüzücü üzerine yerleştirin ve bir 5 ml şırınganın luer lock ucunu kullanarak sabitleyin; ardından 95 °C sıcaklıktaki su banyosunda 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, kartuş filtre ünitesinin oda sıcaklığında bir saat boyunca soğumasını ve dönmesini bekleyin. Soğuma tamamlandığında, filtredeki SDS ekstraksiyon çözeltisi hücre lizatını bir 60 ml şırınga ile aynı ultra santrifüj filtre ünitesine boşaltın.

Daha önce yapıldığı gibi, kartuş filtre ünitesine bir mililitre taze SDS ekstraksiyon çözeltisi ekleyin ve 30 saniye boyunca elle karıştırın. Ardından, tüm proteinlerin uzaklaştırıldığından ve toplandığından emin olmak için durulama yapmak amacıyla 60 mililitrelik şırıngayı kullanarak filtrenin içeriğini ultra santrifüj filtre ünitesine aktarın. Ultra santrifüj filtre ünitesini, filtre ünitesindeki hacim 600 µL'den daha az olana kadar veya 45 dakika boyunca 3.270 ×g'de santrifüj edin.

Akış sıvısını boşaltın ve ultra santrifüj filtre ünitesini taze SDS ekstraksiyon çözeltisiyle tamamlayın. Filtre ünitesini, bu adımı iki kez daha tekrarlamadan önce 3.270 ×g hızında 45 dakika daha santrifüjleyin. Son santrifüjlemin sonunda ultra santrifüj filtre ünitesindeki nihai hacmin en fazla 600 µL olduğundan emin olun.

Bu aşamada, konsantre hacmini ölçün ve konsantreyi ikiye bölün. Fraksiyonlardan biri DNA çöktürme, diğeri ise protein çöktürme için kullanılacaktır. Protein çöktürme için, bir hacim konsantreye 50'ye 50 oranında dört hacim metanol ve aseton ekleyin, 10 saniye boyunca vortekslleyin ve -20 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, karışımı 17.000 ×g hızda 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dekante ettikten sonra, peleti bir saat boyunca speed vac cihazında kurutun. Peleti aşırı kurutmayın, çünkü bu durum yeniden süspansiyon haline getirmeyi zorlaştırabilir.

Pelleti 25 µL SDS ekstraksiyon çözeltisi içinde süspande edin. Bir saat bekletin ve ardından pipetleme yaparak yeniden süspande edin. Kontaminasyonu minimize etmek için biyolojik güvenlik kabininde çalışarak, metin protokolünde detaylandırıldığı şekilde proteinlere SDS-PAGE uygulayın ve her şerit için 10 kilodalton marker işaretinin altındaki fazla jeli kesin.

Her bir şerit tandem kütle spektrometresinde analiz edilecektir. Yüzey alanını artırmak için her bir şeridi ayrı ayrı bir milimetreye bir milimetre boyutunda kareler şeklinde kesin ve şeritteki tüm kareleri düşük bağlanma özelliğine sahip bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Tüm şeritler için işlem tekrarlanırken, jelin kurumasını ve kesilmesinin zorlaşmasını önlemek için %1 Asetik asit kullanılabilir.

Metin protokolünde açıklandığı şekilde jel içi tripsin sindirimi ve peptid ekstraksiyonuna veya DNA çöktürme işlemi için kullanılacak konsantre fraksiyonu 500 µL işaretine kadar SDS ekstraksiyon çözeltisi ile tamamlayarak DNA çöktürme işlemine devam edin. Bu adım, sadece çözeltinin hacmini artırarak çalışmayı kolaylaştırmak içindir. Ardından, MPC protein çöktürme reaktifi gibi bir protein çöktürme reaktifinden 0,583 hacim ekleyin ve vorteksleyin.

10 saniye boyunca, beyaz bir çökelek oluşur; ardından 4 °C'de 10 dakika boyunca 17.000 xg hızda santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, süpernatantı başka bir 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 0,95 hacim izopropanol ekleyip 30 ila 40 kez ters çevirerek karıştırın; ardından 4 °C'de maksimum hızda 10 dakika santrifüjleyin, süpernatantı dikkatlice dökün ve atın. Daha sonra peleti iki kez 750 µL %70 etanol ile yıkayın.

Pipetleme yaparak mümkün olduğunca çok etanolü uzaklaştırın ve ardından peletin havada kurumasını bekleyin. DNA'yı aşırı kurutmayın; çünkü bu durum, kuruduktan sonra yeniden süspanse etmeyi zorlaştırabilir. Peleti 25 µL düşük T tamponu P8 içerisinde süspanse edin.

Bir çift zincirli DNA analiz kiti ve üretici talimatlarını kullanarak DNA miktarını belirleyin. Ayrıca, DNA kalitesini kontrol etmek için üç mikrolitre DNA'ya agaroz jel elektroforezi uygulayın; peptidler tandem spektrometri analizine tabi tutulmuştur. Örnek başına 23.000'den fazla spektrum oluşturulmuş ve bunlardan peptidler ve proteinler tanımlanmıştır.

Metaproteomların taksonomik ve fonksiyonel bileşimi, blast P ve metagenome analyzer yazılım paketinin kombinasyonu kullanılarak analiz edildi. Veri setinde, alfa proteobakterilere atanan proteinler en yüksek temsil oranına sahipti. Bunların büyük çoğunluğu SAR R 11 kladına atandı.

Alpha Proteobacteria'nın Roter kladı da yüksek oranda temsil edilmiş ve tanımlanmıştır. Bu durum en sık yüzey sularında görülmüştür. Bakteriyel hastalıklarla ilişkilendirilen proteinler yüzey ile klorofil maksimumu arasında eşit dağılım göstermiş, ancak kamçılı bakteri proteinleri klorofil maksimumunda daha yüksek derecede tanımlanmıştır.

Gamma proteobacteria proteinleri su sütunu boyunca eşit şekilde dağılmışken, beta protio bacterial proteinler ağırlıklı olarak yüzeyde bulunmuştur. Bir kez ustalaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde üç günde tamamlanabilir.