Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Bu prosedürün genel amacı, sırasıyla kısa ve uzun süreli kültürlenmiş interferon gama L spot testleri kullanarak hem efektör hem de bellek T hücresi yanıtlarını değerlendirmektir. Merkezi hafıza yanıtının değerlendirilmesi, sığır periferik kan mononükleer hücrelerinin 13 gün boyunca antijenik stimülasyon altında kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Uzun süreli kültür, efektör T hücresi yanıtlarının oluşmasına ve azalmasına izin verir.

İnterlökin iki, bellek T hücrelerinin bakımı için kültürlere eklenir. 13. günde, uzun süreli hücreler IFN gama yakalama antikoru ile kaplanmış L spot plakalarına aktarılır. Uzun süreli hücrelerin bireysel mikobakteriyel antijenlere yanıtı, otolog antijen sunan hücrelerin varlığında veya yokluğunda değerlendirilir.

APC'ler APC'ler, 13. günde yapışma ile taze p BMC'lerden izole edilir. Ek olarak, ex vivo koşullar altında yeni izole edilmiş pbmc'nin yanıtı, efektör yanıtlarının bir korelasyonu olarak değerlendirilir. Çeşitli çalışmalarda, aşılamadan sonra mikobakteriyel antijenlere karşı sığır uzun süreli kültürlenmiş sbot yanıtının aşı etkinliği ile pozitif korelasyon gösterdiği gösterilmiştir.

Ayrıca, uzun süreli T hücresi kültürleri, uzun süreli kültürlenmiş L spot testini gerçekleştirmek için hem insanlarda hem de sığırlarda esas olarak merkezi hafızalı T hücreleri içerir. M Bovis ile enfekte veya aşılanmış hayvanlardan juguler, venipunktur ile 60 ml kan toplanır ve P BMC'ler yoğunluk olarak izole edilir. Gradyan santrifüjleme.

Hücre konsantrasyonu ml başına 4 milyon hücreye ayarlanmalıdır. Tam RPMI Ortamında, 500 mikrolitre mikrobakteriyel antijen, bu durumda TB 10.4 ve antijen 85 A ve PPDB adı verilen em bovis kültürünün saflaştırılmış protein türevi kaplanarak başlanır. Daha sonra, hayvan başına dört kopya ile her hayvandan izole edilmiş 500 mikrolitre pbmc ekleyin.

Tüm kuyuların uyarılması gerektiğini unutmayın. Bu adımda herhangi bir stimülasyon veya mitojen gibi kontrollere gerek yoktur, plakayı sığırların normal sıcaklığının 39 santigrat derecede 13 gün boyunca kuluçkaya yatırın. Üçüncü ve yedinci günlerde, kuyucukların dibindeki hücre tabakasını rahatsız etmemek için dikkatlice pipetleyerek her kuyucuktan 500 mikrolitre atın.

Hacmi, IL Two içeren tam PMI ile doldurun. Plakayı inkübatöre yerleştirin 10. günde, her kuyucuktan 750 mikrolitre süpernatanı atın, 12. günde herhangi bir IL iki olmadan tam RPMI ile doldurun, pipetleyin ve her kuyucuktan bir ml süpernatan atın, IL iki olmadan tam RPMI ile doldurun. Ayrıca, IFM Gamma yakalama antikoru ile kaplanacak L spot plakasını hazırlayın, önce çok kanallı bir pipetleyici kullanarak her bir oyuğa 15 Mikrolitre% 35 alkol pipetleyin, bu adım nokta tanımını artırır.

300 mikrolitre PBS ile altı kez iyice yıkayın. PBS'de ml başına sekiz mikrogramda 100 mikrolitre yakalama antikoru ekleyin. Pipetleme, tüm prosedürler sırasında dikkatli bir şekilde yapılmalı, pipet uçlarının kuyunun altındaki zara temas etmesine veya zarar vermesine izin vermemelidir, plakayı plastik bir torbaya yerleştirin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

13. günde, ilk gün örneklenen aynı hayvanlardan juguler vena ponksiyonu ile 60 ml kan toplayın. Pbmc'yi izole edin ve konsantrasyonu ml başına 2 milyon hücreye ayarlayın. L spot plakasını uygun şekilde etiketleyin Her numune seti için.

Uzun süreli hücreler artı APC'ler, APC'leri olmayan uzun süreli hücreler ve ex vivo hücreler. Ellis spot plakasından yakalama antikorunu atın, ara içeren 300 mikrolitre PBS ile kuyuları yıkayın. Altı kez tekrarlayın, atın, sıvıyı yıkayın ve Pipetleyin.

50 mikrolitre taze izole edilmiş p BMC'ler, uzun süreli hücreler için ayrılan kuyucuklara. Artı APC'ler. L nokta tahlil plakasına paralel olarak akış sitometrisi ile hücrelerin fenotipini değerlendirmek için tam RPMI'nin kuyusu başına 200 mikrolitre ile L nokta plakasının diğer kuyularını bloke edin.

Düzgün bir şekilde etiketlenmiş yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakada 50 mikrolitre taze izole edilmiş hücre. Bu, yanıt veren hücrelerin fenotipini belirlemek için sarı nokta testi ile birlikte gerçekleştirilecek yardımcı bir testtir. Plakaları %5 CO2 inkübatörde 39 Santigrat derecede 90 dakika inkübe edin ve antijen sunan hücrelerin yapışmasına izin verin.

Ayrıca, bu 90 dakikalık inkübasyon adımı sırasında ısıtmak için 200 ml tam RPMI'yi inkübe edin. Uzun süreli kültürlenmiş hücreleri 24 oyuklu plakadan hasat edin. Her hayvandan alınan dörtlü kopyaları tek bir 15 mil konik tüpte birleştirmek.

Tüpleri 400 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı tüp ters çevirme ile atın, hücre peletini yerinden çıkarın ve gerekirse peleti nazikçe yeniden süspanse etmek için beş ml PBS ekleyin. Hücreleri iki kez yıkayın ve ardından hücre konsantrasyonunu ml başına 200.000 hücreye ayarlayın. 90 dakikalık inkübasyondan sonra, LPO plakasını ve tam RPMI'yi inkübatörden alın.

LPO plakasını 30 saniye boyunca bir plaka çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Daha sonra, yapışmayan hücreleri, ılık tam RPMI kuyusu başına 150 mikrolitre plaka ters çevirme pipeti ile çıkarın. Plakayı sallayın ve yıkama sıvısını atın.

Üç kez tekrarlayın, mümkün olduğu kadar çok sıvıyı atın ve her bir antijenin oyuğu başına yüz mikrolitreyi, yapışkan APC'ler içeren uygun oyuklara ekleyin. Daha sonra, uzun süreli kültürlenmiş hücre süspansiyonunun oyuğu başına 100 mikrolitre pipetleyin. ML başına 200.000 hücre, uzun süreli hücreler artı APC'ler olarak etiketlenmiş kuyucuklara.

Bu adımda eklenen uzun süreli hücrelerin, halihazırda kuyuda bulunan APC'lerle aynı hayvandan olduğundan emin olun. APC'leri ve farklı hayvanlardan alınan uzun süreli kültürlenmiş hücreleri karıştırmayın. Ayrıca, uzun vadeli yanıtları değerlendirmek için ml başına 200.000 hücre konsantrasyonunda uzun süreli kültürlenmiş hücre süspansiyonunun oyuğu başına 100 mikrolitreyi APC'ler olmadan kuyucuklara pipetleyin.

Antijen sunumunun yokluğunda, kısa süreli hücrelerin oyuğu başına 100 mikrolitre ekleyin, ayrıca ex vivo yanıt değerlendirmesi için yeni izole edilmiş ve ML başına 2 milyon hücreye ayarlanmış ekleyin. Akış sitometrisi analizi yapılıyorsa, yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakasını yıkayın ve aynı prosedürleri izleyerek uzun süreli taze izole edilmiş hücreleri ve antijenleri kuyucuklara ekleyin. IFN Gamma LPO plakası için kullanılır, Plakaları gece boyunca 39 Santigrat derecede %5 CO2 inkübatörde inkübe eder.

Plakaların düz durduğundan emin olun ve 14. günde plakaları istiflemeyin. Sıvıları kuyulardan atın ve plakaları altı kez yıkayın, ara içeren PBS kuyusu başına 300 mikrolitre ile her seferinde yıkamadan önce ve yıkamalar arasında 10 saniye boyunca plaka çalkalayıcıya yerleştirin. Daha sonra aynı hacimde damıtılmış su ile bir kez ve ara içeren PBS ile altı kez daha yıkayın.

Son olarak, hücreleri PBS kuyusu başına 300 mikrolitre ile iki kez yıkayın. Plakayı kağıt havlulara veya emici pedlere vurarak yıkama sıvısını çıkarın. PBS'de% 1 sığır serum albümini ile seyreltilmiş ml başına beş mikrogramda tespit antikoru başına 100 mikrolitre ekleyin.

Plakaları 39 Santigrat derecede 120 dakika inkübe edin. Bu inkübasyon adımı sırasında, kullanımdan 30 dakika önce veya kuyucuklara tespit antikorunun eklenmesinden 90 dakika sonra üreticinin talimatlarına uyarak VTA leke A BC AP kit standından alkalin fosfataz çözeltisini hazırlayın. 120 dakikalık inkübasyondan sonra ara içeren PBS içindeki reaktifi seyreltin, tespit antikorunu plaka ters çevirme ile atın, ara içeren PBS oyuğu başına 300 mikrolitre ile altı kez yıkayın.

Plakayı kağıt havluların üzerine hafifçe vurarak yıkama sıvısını çıkarın. Daha sonra alkalin fosfataz çözeltisi kuyusu başına 100 mikrolitre ekleyin. Plakaları oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.

Sıvıyı atın ve her plakayı PBS İçeren ara ile altı kez yıkayın. Üreticinin talimatlarını izleyerek vektör mavisi AP alt tabaka üç kitinden alt tabaka Çözeltisini hazırlayın. Reaktifleri pH 8.2'de 0.1 molar tris HCL tamponunda seyreltin.

50 mikrolitre substrat D'yi pipetleyin. Her kuyucuk, mavi renk gelişmeye başlayana kadar yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. Sıvıyı atın ve plakaları bol miktarda damıtılmış su ile yıkayın. Membranı açığa çıkarmak için alt plakayı çıkarın, kuyucukların arkasını yıkayın ve plakanın kurumasını bekleyin.

Bir immünospot görüntü analizörü kullanarak yanıtı ölçün veya yanıt ölçülene kadar plakaları karanlıkta oda sıcaklığında tutun. Reaksiyonun yüksek stabilitesi nedeniyle, substrat kalitesi birkaç yıl boyunca korunur. Akış sitometrisi ile fenotip ve sitokin yanıtı değerlendirilirken, yuvarlak alt 96 üzerine kaplanmış hücrelerin standart boyama prosedürlerini gerçekleştirin, APC'lerin varlığında veya yokluğunda kuyu plakası temsilcisi TCM, enfekte hayvanlardan ve enfekte olmayan hayvanlardan insanlı ex vivo IFN gama L spot yanıtları gösterilir.

M bovis'e spesifik yanıtlar PBDB veya ESAT altı, CFP 10 antijenik stimülasyonu ile değerlendirilir. Plakaların alt kısmındaki lekeler, sarı nokta testinin renkli ürünüdür. Her nokta tipik olarak tek bir sitokin üreten hücreyi temsil eder ve enfekte hayvanlardan alınan hücrelerle IFN gama üreten T hücresinin kantitatif bir ölçümünü sağlar.

Nokta oluşturan hücreler veya SFC'ler olarak sunulan uzun süreli IFN gama L spot yanıtları açıkça görselleştirilir: antijen stimülasyonuna yanıt olarak IFN gama üretimi çok az görülür veya hiç görülmez, enfekte olmayan sığırlardan alınan hücrelerde ve enfekte olmayan sığırlardan alınan hücrelerde uyarılmamış hücrelerde görülür. Sağlam T hücresi yanıtı, gösterildiği gibi yabani ot mitojenini dürtmeye yanıt olarak ortaya çıkmalıdır TCM ve PPDB ve ESAT altıya ex vivo yanıtlar. CCFP 10, tüm 3M bovis ile enfekte hayvanlardan tespit edildi ve kontrol hayvanından çok az veya hiç TCM ve ex vivo yanıtlar tespit edilmedi.

Kültürlenen uzun süreli hücreler tarafından büyük ölçüde azaltılmış tepkilerin gösterdiği gibi, enfekte hayvanlar tarafından optimal TCM yanıtları için bir APC'lerin varlığı gerekliydi. Otolog APC'lerin yokluğunda, em, bovis ile enfekte ve enfekte olmayan hayvanlardan spot oluşturan hücreler sunuldu. Her bir hayvandan alınan SFC'lerin sayısı, PPDB'ye yanıt olarak çift numunelerde 10 ila altıncı hücrede ortalama SFC sayısı ile hesaplandı, eksi tek başına ortama verilen yanıtlar, enfeksiyon durumuna, APC'lerin varlığına veya yokluğuna ve kültür uzunluğuna bağlı olarak farklılık gösterdi, yani uzun vadeli kültüre karşı ex vivo kültür.