Name: 16S rRNA Hedefleme Digoksin-etiketli DNA probu kullanılarak Parafine gömülmüş dokular içinde Bakterilerin in situ tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Öğrenin parafine gömülmüş dokularda bakterileri in situ tespit etmek için 16S rRNA hedefleyen DIG-etiketli DNA problarını kullanmayı. Bu yöntem periodontal hastalıklar ve kanserlerde bakterilerin rolünü anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Kore Ulusal Araştırma Vakfı hibe (2013R1A1A3005669) ve Kore Sağlık Teknoloji Ar-Ge Projesi, Sağlık ve Refah Bakanlığı hibe (HI13C0016) tarafından desteklenmiştir.

1. Probe Hazırlık <ol><li> Prob PCR amplifikasyonu <ol><li> P. gingivalis spesıfik prob, P. bir 343-bp DNA fragmanını çoğaltmak P. genomik DNA kullanılarak PCR ile gingivalis 16S rRNA gingivalis aşağıdaki primerler: 5&#39;-TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 &#39;ve 5&#39;-ACT ATC CGT CGT GCC TAT TC-3&#39; 10. Aşağıdaki döngü koşulları amplifikasyonlar yapın: 35 döngü 95 ° C&#39;de 30 saniye, 30 saniye için 60 ° C, ve 72 ° &#39;de 5 dakika uzatma ve ardından 1 dakika 20 saniye için 72 ° C C 10,11 için. </li><li> 70 bp&#39;lik bir DNA parçası (5&#39;-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG kullanılarak eubacterial prob yükseltin TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 &#39;bir oligonükleotid aşağıdaki primerler olarak sentezlenir): 5&#39;-CAG CTG GTR CMT GGY-3&#39; 11 ve 5&#39;-AGG GTT GCG CTC GTT-3. Aşağıdaki döngü koşulları amplifikasyonlar gerçekleştirin: 40 döngüleri30 saniye için 30 saniye için 9 4 ° C, 60 ° C ve 1 dakika 72 ° C 11,12 sıcaklıkta 5 dakikalık bir uzatma ve ardından 20 saniye süreyle 72 ° C&#39;de. </li><li> Ve 2 saat boyunca -20 ° C&#39;de inkübe 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve (: 1: 2 oranında 10 de),% 100 etanol ilave edilerek PCR ürünleri (≥500 ul) hızlandırabilir. </li><li> Santrifüj karışım 15 dakika için 14,000 x g&#39;de, TE tamponu, 100 ul pelet tekrar süspansiyon ve 260 nm&#39;de optik yoğunluk ile DNA konsantrasyonu ölçülür. </li></ol></li><li> DIG DNA etiketleme ve saptama kiti kullanılarak DIG-etiketleme <ol><li> 15 ul bir son hacme su ile prob 3 ug karıştırın. </li><li> 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de DNA&#39;yı denatüre ve hızlı bir şekilde buz üzerine soğuk. </li><li> 10x heksanükleotid karışımı 2 ul dNTP etiketleme karışımı 2 ul ve denatüre edilmiş DNA 15 ul Klenow enzimi 1 ul ekle. </li><li> Karıştırın ve 48 saat için 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin ve 65 ° C&#39;de ısıtma ile reaksiyonu durdurun. </li></ol></li><li> DIG DNA etiketleme ve saptama kiti kullanılarak DIG-etiketli prob duyarlılığını kontrol <ol><li> El ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kitte sağlanan pozitif kontrol probu seri dilüsyonları 1 ul naylon membran üzerinde DIG etiketli prob 1 ng ve kuru yük. </li><li> Kısaca 2x SSC tamponu (0.3 M NaCI, 30 mM sodyum sitrat, pH 7.0) &#39;de membran ıslatın ve DNA immobilize etmek için 1 saat boyunca 80 ° C&#39; de membran inkübe edin. </li><li> Kısaca maleik asit tamponu (MAB, 0.1 M maleik asit, 0.15 M NaCI, pH 7.5) membran emmek ve anti-DIG alkalin fosfataz ile birleştirilmiş bayır antikoru seyreltildi (AP) ile inkübe: Resim bloke çözeltisi içinde 6 ml (1 5000) 30 dakika boyunca oda sıcaklığında kiti. </li><li> MABT (MAB% 1 Tween 20 ihtiva eden) ile zarın yıkanması ve üzerine 2 ml saptama tamponu (0.1 M Tris-HCI, 0.1 M NaCI, 0.05 M MgCl2, pH 9.5) ile karıştırılmıştır NBT / BCIP çözeltisi 40 ul geçerlidir 1 dakika için membran. Etiketlenmiş prob duyarlılığı isetatmin edici değil, 1.1.3 den 1.3.4 için adımları tekrarlayın. </li><li> Etiketli prob (OD260) DNA konsantrasyonu ölçülür ve ul ng 100 konsantrasyonunu ayarlamak -1. </li></ol></li><li> DIG-etiketli prob özgünlüğünü kontrol <ol><li> Genomik DNA örnekleri denatüre 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de, belirli bir prob hedef bakteri dahil olmak üzere çeşitli bakteri türlerinin gelen (25 3 ul -1, her numune başına ng) ve hızlı bir şekilde buz üzerinde soğuk. </li><li> El ile oda sıcaklığında 20 dakika için denatüre edilmiş naylon membran üzerine DNA ve kuru yük. </li><li> Kısaca 2x SSC tamponu membran ıslatın ve DNA immobilize etmek için 2 saat boyunca 80 ° C &#39;de membran inkübe edin. </li><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke edici bir solüsyonuyla membran bloke. </li><li> Hibridizasyon tamponu içinde seyreltilmiş probları denatüre ve membran üzerine uygulanır ul -1 1 ng probu ile seyreltilir. </li><li> 1 saat süre ile 45 ° C &#39;de membran inkübe edin. </li><li> Zarın yıkanması Üç2x SSC tamponu ile kere. </li><li> Kısaca MAB membran ıslatın. </li><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke etme çözeltisi içinde 6 ml (2.000 1) ile seyreltildi, anti-DIG AP-konjuge antikor ile inkübe edin. </li><li> MABT ile zarın yıkanması ve 2 ml saptama tamponu ile karıştırıldı NBT / BCIP çözeltisi 40 ul uygulanır. </li><li> Sonda beklenen özgüllük elde değil zaman özgünlüğü görülünceye kadar, melezleme sıcaklığını arttırın. </li></ol></li></ol> İn Situ Hibridizasyon 2. Not: örnekler ve reaktifler kurumayı önlemek ıslak kağıt havlu ile astarlanmış bir nemlendirilmiş oda içinde Bütün inkübasyonlar, gerçekleştirmek için. <ol><li> De-paraffinization ve doku bölümleri rehidrasyon <ol><li> Parafin bloklardan 4 mikron kalınlığında doku bölümleri hazırlayın. Formalin, paraformaldehit ve çinkoya-dayalı sabitleyici bu protokol ile uyumludur. </li><li> DEPC arıtılmış su kullanılarak tüm reaktifler hazırlayın. </li><li> 30 dakika boyunca 60 ° C &#39;de kuru bir fırın içinde ısı slaytlar ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytlar inkübe edin. </li><li> 5 dakika üç kez% 100 ksilen slaytlar daldırın; Taze ksilen, her zaman kullanın. Not: Bir kimyasal davlumbaz, bu de-ağda işlemi yapın. </li><li> Iki kez 5 dakika% 100 etanol içinde slaytlar bırakın, her zaman taze etanol kullanılarak, ve her biri 5 dakika için seri% 90 örnekleri,% 80 ve% 70 etanol çözüm rehidrate. </li><li> 1 dakika süre ile, DEPC ile muamele edilmiş su içinde slaytlar daldırın ve 6 dakika boyunca DEPC ile muamele edilmiş, PBS (pH 7.4) içinde slaytlar yıkayın. </li></ol></li><li> Doku bölümlerinin ön işlemler <ol><li> 20 dakika için 0.1 N hidroklorik asit içinde slaytlar daldırın ve 30 saniye süreyle DEPC ile muamele edilmiş su içinde slaytlar yıkayın. </li><li> Bir mum kalem kullanarak örnekleri çevreleyen bir hidrofobik bariyer çizin. Not: bir hidrofobik bariyer boyutu örneklerinin büyüklüğüne bağlıdır. Bu nedenle, aşağıdaki aşamalarda kullanılan reaktif miktarları örneklerinin boyutuna bağlı olarak, ancak hy doldurmak zorunda değişirdrophobic bariyer (küçük numuneler için 50 ul ve büyük numuneler için 400 ul). </li><li> 30 dakika için 37 ° C &#39;de kuru bir fırında proteinaz K (1-10 ug mi -1 DEPC ile muamele edilmiş, PBS içinde) ve 50-400 ul numune tedavi ve 1 dakika boyunca DEPC ile muamele edilmiş 1 x PBS içinde slaytlar yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca DEPC ile muamele edilmiş, PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde slaytlar bekletin, daha sonra 1 dakika boyunca DEPC ile muamele edilmiş, PBS slaytlar yıkayın. </li><li> 0.1 M trietanolamin-HCl, 20 dakika boyunca% 0.5 asetik anhidrit içeren (pH 8.0) slaytlar ıslatın ve 30 saniye için DEPC ile muamele edilmiş su içinde slaytlar yıkayın. </li></ol></li><li> Prob ve yıkama ile hibridizasyon <ol><li> 20 dakika boyunca 2x SSC tamponu slaytlar bırakın. </li><li> Hibridizasyon tamponu içinde ul -1 1 ng (4x SSC probu ile seyreltilir,% 50 [hacim / hacim] formamid, 1 x Denhardt çözeltisi,% 10 [ağırlık / hacim] dekstran sülfat,% 0.1 [ağr / hac], sodyum dodesil sülfat, 0.4 mg mi -1 salmon sperm DNA&#39;sı). Negatif kontroller için, ile etiketlenmiş prob karışımıolmayan işaretli prob, bir 10-kat fazla miktarda. </li><li> Seyreltilmiş probları denatüre ve doku bölümleri üzerine 50-400 ul uygulayın. Slaytta bir kapak kayma yerleştirin ve oje ile mühür. </li><li> 45 ° C veya en uygun ısıda nemlendirilmiş bir odacık O / N 10 dakika boyunca 90 ° C &#39;de, PCR makinesi ısı slaytlar ve inkübe slaytlar aşama 1.4.11 de tespit edilmiştir. </li><li> 30 dakika boyunca 4 ° C &#39;de slaytlar soğutun kapak slipi kaldırmak ve aşağıdaki gibi, bir seri SSC tamponu slaytlar sokmak: 4x SSC 10 dakika, önceden ısıtılmış (45 ° C) 2 x SSC, 20 dakika, 2 x SSC, 10 için dakika ve 10 dakika süre ile 0.2x SSC. </li></ol></li><li> Anti-DIG AP-konjüge edilmiş antikor ile tespit <ol><li> 5 dakika boyunca MABT slaytlar yıkayın. </li><li> 20 dakika boyunca,% 1 Tween 20 ile bloklama çözeltisi 50-400 ul engeller. </li><li> Çözeltisi (1: 1000) bloke içinde seyreltilmiş anti-DIP-AP antikoru 50-400 ul ekle anld 90 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca MABT slaytlar yıkayın. </li> &lt;li&gt; 5 dakika boyunca% 1 Tween 20 içeren algılama tamponu slaytlar bırakın. </li><li> Μ 1 mM levamisol endojen alkalin fosfataz inaktive edilmesi için 5 dakika için (% 1 Tween 20 içeren saptama tamponu içinde) 50-400 ile tedavi edin. </li><li> (1 bulgulama tamponu içinde seyreltilmiş 100) önceden karıştırılmış NBT / BCIP çözeltisi 50-400 ul dağıtma Her örnek üzerinde ve gelişmiş sinyal tatmin kadar 2 ila 3 saat boyunca oda sıcaklığında nemli bir haznede slaytlar inkübe edin. </li><li> Görselleştirme durdurmak ve 10 dakika için 37 ° C &#39;de% 0.05 bir karşı leke olarak [ağırlık / hacim] metil yeşili 50-400 ul uygulamak için de-iyonize edilmiş su ile slaytlar durulayın. </li><li> % 100 etanol içinde dehidre, de-iyonize su ile slaytlar durulayın ve ksilen batırın. </li><li> Her bir slayt üzerine montaj çözümü 80 ul uygulayın ve kapak slipleri ile kaplayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+human+gingiva.+II.+The+lower+part+of+the+pocket+epithelium+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis.</a> J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).</li>
<li>Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+invasion+of+the+periodontium%3B+an+important+factor+in+the+pathogenesis+of+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).</li>
<li>Saglie, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+bacteria+in+the+oral+epithelium+in+periodontal+disease.+II.+Immunohistochemical+identification+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria.</a> J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).</li>
<li>Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+localization+of+Actinobacillus+actinomycetemcomitans.+in+human+periodontitis.+I.+Light%2C+immunofluorescence+and+electron+microscopic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies.</a> J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).</li>
<li>Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ.+correlative+immuno-identification+of+mononuclear+infiltrates+and+invasive+bacteria+in+diseased+gingiva%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva.</a> J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).</li>
<li>Rautemaa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+localization+of+Porphyromonas+gingivalis.+thiol+proteinase+in+periodontal+tissues+of+chronic+periodontitis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients.</a> Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).</li>
<li>Marttila, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+localization+of+Treponema+denticola.+chymotrypsin-like+proteinase+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis.</a> J. Oral Microbiol. 6, (2014).</li>
<li>Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intracellular+oral+species+within+human+crevicular+epithelial+cells+from+subjects+with+chronic+periodontitis+by+fluorescence+in+situ.+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization.</a> J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).</li>
<li>Abrams, K., Caton, J., Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+comparisons+of+interproximal+gingival+tissues+related+to+the+presence+or+absence+of+bleeding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding.</a> J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Porphyromonas+gingivalis.+and+plasma+cell+dominance+in+gingival+tissues+with+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis.</a> Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyromonas+gingivalis.+and+dextran+sodium+sulfate+induce+periodontitis+through+the+disruption+of+physical+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers.</a> Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).</li>
<li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+bacterial+invasion+and+differential+expression+of+tight+junction+proteins%2C+growth+factors%2C+and+growth+factor+receptors+in+periodontal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions.</a> J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).</li>
<li>Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+re-analysis+of+domain-specific+16S+primers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Review and re-analysis of domain-specific 16S primers.</a> J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).</li>
<li>Hajishengallis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Low-abundance+biofilm+species+orchestrates+inflammatory+periodontal+disease+through+the+commensal+microbiota+and+the+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement.</a> Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).</li>
<li>Axon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer+and+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer and Helicobacter pylori.</a> Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).</li>
<li>Fenhalls, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ.+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+transcripts+in+human+lung+granulomas+reveals+differential+gene+expression+in+necrotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions.</a> Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada bir protokol tarif edilmiştir, DIG etiketli bir DNA probu kullanılarak parafine gömülü doku içindeki bakteri yerelleştirilmesine. Prob bakteriyel 16S rRNA geninin DNA ya da RNA moleküllerini hedef ve 16S rRNA hedefleme problar ya da türe spesifik ya da evrensel olarak dizayn edilebilir. P. spesifik hibridizasyon P. gingivalis -spesifik prob gingivalis ancak diğer ağız bakterileri daha önce 10 gösterilmiştir. Hibridizasyon etkinliği 12 farklı olsa da aksine, eubacte...

Bakteriler gibi periodontitis, pulpitis, Perikoronitis, selülit ve osteomyelit gibi çeşitli ağız hastalıklarının etiyolojisinde rol oynarlar. Hastalığın patojenezinde bakteri rolünü anlamak ve tedavilerin etkisini izlemek amacıyla, doku içindeki bakterilerin yeri önemlidir. periodontitis olan hastalardan alınan dişeti dokusu içinde bakterilerin varlığı Floresan-kullanarak, in situ hibridizasyon (FISH) 8 elektron mikroskobu 1,2, immünohistokimya ve immünofloresan kullanılarak bakterilerin spesifik antikorlar 3-7, ve floresan dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak gösterilmiştir 16S rRNA hedef etiketli oligonükleotid prob. Bununla birlikte, bu yöntemler yaygın nedeni, teknik sınırlama veya zorluklara kullanılmamaktadır. Antikorlar ile karşılaştırıldığında, 16S rRNA hedefleme probları üretmek ve tür spesifikliğini elde etmek kolaydır. BALIK Bact görüntülenmesi için mükemmel bir araç olduğunu kanıtlamıştırBöyle plak biyofilm olarak kendi doğal ortamlarında eria. Bununla birlikte, doku numunelerini, FISH uygulanması nedeniyle çeşitli doku bileşenlerinin otofloresansı sınırlıdır. Bunlar 9 kanama barındırır, örneğin kırmızı kan hücrelerinin kuvvetli otofloresansı genellikle iltihaplı dokulara floresans teknolojisinin uygulanmasını engellemektedir. Iltihaplı diş eti dokularda bakterilerin lokalize etmek için, bu nedenle, digoksigenin kullanılarak bir in situ hibridizasyon metodu (DIG) -etiketli DNA probu geliştirilmiştir ve başarılı bir şekilde 10,11 uygulanır. P kullanarak parafine gömülü dokularda bakteri lokalizasyonu için Burada detaylı bir protokol gingivalis-spesifik ve genel eubacterial sondalar açıklanmıştır. Özellikle içindeki sonuçlar diğer laboratuarlarda yeniden böylece yöntemin standardizasyon odaklanmıştır. Bu protokol histolojik bağlam ve resu içindeki bakterilerin lokalizasyonu veriyorlt son derece tekrarlanabilir. Açıklanan protokol, ya çeşitli dokularda bir türe özel veya genel bir şekilde bakterileri lokalize etmek için de kullanılabilir. Evrensel prob polimikrobial hastalıklarda bakteri tespit etmek ve belirli bir bakteri rolü bilinmemektedir burada hastalıklarda bakteri potansiyel rolünü araştırmak için yararlıdır.

<table><tbody><tr><td>Asetik anhidrit</td><td>Sigma</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>%50 Dekstran sülfat çözeltisi</td><td>Millipore</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>50X Denhardt' s çözümü</td><td>Sigma</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>P159220</td><td></td></tr><tr><td>DIG DNA etiketleme ve tespit kiti</td><td>Roche</td><td>11 093 657 910</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge & trade; Kalem</td><td>Dako</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Vektör</td><td>SP-5000</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Maleik asit</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Metil yeşili</td><td>Sigma</td><td>M6776</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Somon sperm DNA çözeltisi</td><td>Invitrogen</td> <td># 15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat</td><td>Dükkan</td><td>D1420</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Amresco</td><td>227</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamin-HCl</td><td>Sigma</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Araştırma organikleri</td><td>3098T</td><td></td></tr></tbody></table>

16s rrna hedefleme digoksin-etiketli dna probu kullanılarak parafine gömülmüş dokular içinde bakterilerin in situ tespiti

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Periodontitisli hastalardan alınan dişeti biyopsilerinde cep epiteli ve alttaki bağ dokusu içinde bakteri varlığı, elektron mikroskobu, immünohistokimya veya bakteri spesifik antikorlar kullanılarak immünofloresan ve floresan işaretli oligonükleotid probu kullanılarak floresan in situ hibridizasyon (FISH) dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemler teknik sınırlamalar veya zorluklar nedeniyle yaygın olarak kullanılmamaktadır. Burada, DIG etiketli DNA probları kullanılarak parafine gömülü dokulardaki bakterileri lokalize etmek için bir yöntem tanıtılmıştır. Parafine gömülü dokular, patoloji bankalarından temin edilebilen en yaygın biyopsi dokusu şeklidir. Bakteriler türe özgü veya evrensel bir şekilde tespit edilebilir. Bakteri sinyalleri, bakterilerin ayrı formları (kok, çubuk, fusiform ve tüylü form) veya dağınık formlar olarak tespit edilir. Teknik, diğer histolojik bilgilerin elde edilmesini sağlar: epitel, bağ dokusu, enflamatuar infiltratlar ve kan damarları iyi ayırt edilir. Bu yöntem, periodontitis, kanserler ve inflamatuar bağışıklık hastalıkları gibi çeşitli hastalıklarda bakterilerin rolünü incelemek için kullanılabilir.

Şekil 1 hassasiyetini belirlemek için sette bulunan pozitif kontrol probu ile karşılaştırıldığında DIG etiketli probları nokta blotlama. 343 bp P. gingivalis spesıfik sonda 70 bp eubacterial prob 25 kat daha hassastır. P. tespiti için kronik periodontitisli hastalardan elde edilen dişeti dokularının in situ hibridizasyon 2 gösterileri Şekil gingivalis ve Eubacteria. mor gösterilen bakteriyel sinyaller, doku dışında bulunan epitel, lam...

Burada, DIG etiketli 16S rRNA hedefli DNA probları kullanılarak parafine gömülü dokulardaki bakterileri lokalize etmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu protokol, periodontitis, kanserler ve inflamatuar bağışıklık hastalıkları gibi çeşitli hastalıklarda bakterilerin rolünü incelemek için uygulanabilir.

16S rRNA Hedefleme Digoksin-etiketli DNA probu kullanılarak Parafine gömülmüş dokular içinde Bakterilerin in situ tespiti

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Bu prosedürün genel amacı, DIG işaretli 16 s ribozomal RNA hedefli DNA probları kullanarak parafin gömülü dokulardaki bakterilerin lokalizasyonunu sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle PCR amplifikasyonu ve DIG işaretlemesi ile probun hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, doku kesitlerini hedef bölgelerin daha erişilebilir olması ve arka plan bağlanmasının azaltılması için hazırlamaktır.Ardından, hazırlanan doku kesitleri dig işaretli prob ile hibridize edilir. Son olarak, hibridize olan prob, alkalen fosfataz işaretli anti-D dig antikorları ile tespit edilir. Nihayetinde, bu C iki hibridizasyon yöntemi, parafine gömülmüş dokularda bakterilerin varlığını gösterebilir.Bu saptama yönteminin, ING gibi mevcut yöntemlere göre sağladığı alan avantajı, bu yöntemin bakteriyel SHS'yi bazı histolojik yapılar bağlamında saptayabilmesidir. Bu yöntem, periodontitis ve R planet gibi çeşitli inflamatuar durumlar üzerinden patogeneze dair içgörü sağlayabilir. Doku kesitleri kolayca hasar gördüğü için doku hazırlama ve hibrid sindirim aşamalarının yürütülmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik önem taşımaktadır.U bakteri probunu hazırlamak için şablon olarak 70 baz çiftlik bir DNA fragmanı ve probu PCR ile çoğaltmak için iki adet 15 baz çiftlik primer kullanın. Amplikonu bilinen bir konsantrasyondaki tampon çözelti içinde toplayın. Ardından probu bir dig DNA etiketleme ve tespit kiti ile etiketleyin.İlk olarak, üç µg probu 15 µL su ile karıştırın. Probu ısıtma bloğunda 95 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edin. Ardından, denatüre edilen probu buza yerleştirin.Ardından, iki µL 10 XH nükleotid, iki µL DN NTP'ler ve bir µL kanal enzimi ekleyin. Karıştırıldıktan sonra, probu 37 °C'de 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin. Karışımı 65 °C'ye ısıtarak reaksiyonu durdurun.Ardından, işaretlenmiş probun DNA konsantrasyonunu 260 nanometrede ölçün ve konsantrasyonu mikrolitre başına 100 nanogram olacak şekilde ayarlayın. Kiti kullanarak, öncelikle probların duyarlılığını kontrol etmek için bir naylon membrana seri olarak dilüye edilmiş pozitif kontrolün bir mikrolitresini yükleyin. Prob ve dig işaretli prob.Membranın beş dakika boyunca kurumasına izin verin. Kuruduktan sonra, membranı kısaca iki XSSC içine daldırın ve ardından bir saat boyunca 80 °C'lik bir inkübatöre aktarın. İnkübasyon sonrası DNA'yı immobilize etmek için membranı kısaca maleik asit tamponunda bekletin, ardından yarım saat sonra 1:5.000 dilüsyonda AP konjuge antikorlar içeren bloklama tamponuna aktarın.Membranı MABT ile yıkayın. Ardından, 40 µL N-B-T-B-C-I-P'yi iki mililitre deteksiyon tamponu ile karıştırın. Yıkama işleminden sonra, bu karışımı membran üzerine bir dakika boyunca uygulayın.Metin protokolünde açıklandığı gibi parafin uzaklaştırıldıktan ve doku kesitleri rehidre edildikten sonra, bunları in situ hibridizasyon için hazırlamak amacıyla lamları önce 20 dakika boyunca 0.1 normal hidroklorik asit içinde bekletin. Asit banyosundan sonra, lamları 30 saniye boyunca DEPC işlem görmüş su ile yıkayın. Ardından, bir mum kalem kullanarak her lam üzerindeki örneklerin etrafını çizin.Ardından, örneklerin boyutuna bağlı olarak, örneklere 50 ila 400 µL proteinaz K çözeltisi ekleyin. Enzimin 37 °C'de 30 dakika boyunca etki etmesini sağlayın ve ardından lamları DEPC ile işlem görmüş 1X PBS içinde bir dakika boyunca yıkayın. Şimdi lamları, DEPC ile işlem görmüş PBS içindeki %4 paraformaldehite 10 dakika boyunca aktarın.Fiksatif, daha önce olduğu gibi PBS ile yıkanarak uzaklaştırılır. Ardından lamlar, pH 8'de 0,5% asetik asit ve hidrit içeren 0,1 molar trietanolamin hidroklorür içerisinde 20 dakika boyunca bekletilir ve daha önce yapıldığı gibi temiz su ile yıkanır. Şimdi, lamlar önce 20 dakika boyunca 2 XSSC içerisinde bekletilerek in C 2 aşamasına başlanır.Bu sırada, negatif kontrol için işaretli probu hibridizasyon tamponunda mikrolitre başına bir nanogram olacak şekilde seyreltin. İşaretsiz probun 10 katı konsantrasyonunu kullanın. Ardından, probları 90 °C'de 10 dakika ısıtarak denatüre edin ve ardından hızla buz üzerinde soğutun.Ardından, her bir lama, daha önce uygulanan proteinaz K ile aynı hacimde prob dilüsyonu uygulayın. Daha sonra lamları dikkatlice kapatın ve kesitleri oje kullanarak mühürleyin. Şimdi, lamları bir PCR cihazı bloğunda 90 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın ve ertesi güne kadar gece boyunca 45 °C'lik nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın.Slaytları dört derece Celsius'ta yarım saat boyunca soğutun ve ardından lamelleri dikkatlice çıkarın. Dokular hassastır. Son olarak, slaytları oda sıcaklığında bir dizi SSC tamponundan geçirin.İlk olarak, hibritlemiş iki NC lamını beş dakika boyunca MABT ile yıkayın. Ardından, %1 tween 20 içeren bloklama çözeltisinden 50 ila 400 mikrolitre uygulayın ve 20 dakika bekletin. Bloklama inkübasyonundan sonra, 1:1000 oranında seyreltilmiş anti-D dig alkali fosfataz antikoru ve bloklama çözeltisinden 50 ila 400 mikrolitre uygulayın.Primer antikor uygulandıktan sonra 37 °C'de 90 dakika boyunca bağlanmaya bırakın. Lamları 10 dakika boyunca MABT ile yıkayın. Ardından lamları, %1 tween 20 içeren deteksiyon tamponuna beş dakika boyunca yerleştirin.Şimdi her slayda 50 ila 400 µL 1 mM ole tespit tamponu çözeltisi uygulayın ve endojen alkalin fosfatazı inaktive etmek için beş dakika inkübe edin. Ardından, her slayda tespit tamponunda 1:100 oranında seyreltilmiş 50 ila 400 µL N-B-T-B-C-I-P ekleyin ve deneyime bağlı olarak slaytları nemlendirilmiş bir bölmede iki ila üç saat inkübe edin.Slaytları DI su ile durulayın, ardından ağırlıkça hacimce %0,05 konsantrasyonda metil yeşili uygulayın ve karşıt boyanın doku üzerinde 37 °C'de 10 dakika boyunca etki etmesini bekleyin. Slaytları tekrar DI su ile yıkayın ve ardından %100 etanol ileye dehidre edip ardından ksilenle daldırın.Son olarak, 80 µL montaj medyumu uygulayın ve üzerini lamelle kapatın. Lamlar, problar dijital olarak etiketlendikten sonra hazırlandı. Hassasiyetleri, pozitif kontrol probunun dilüsyonu ile karşılaştırıldı.3 43 baz çiftlik p gingivalis spesifik probu, mühendislik ürünü 70 baz çiftlik bakteri probundan 25 kat daha hassastı. Ardından iki prob, kronik periodontitli hastalardan alınan diş eti dokularına yüksek büyütmede uygulandı. Bakteri probu kullanılarak bakterilerin çeşitli şekilleri ayırt edilebildi.p gingivalis spesifik probu yalnızca çubuk şeklindeki bakterileri tespit ederken, farelerin diş eti mukozasına sıkı bağlantıları bozan bir kimyasal olan DSS uygulandı. Bu farelerden alınan doku örnekleri, probları farklı bir bağlamda karşılaştırmak için kullanıldı. Burada, U bakteriyel probu, diğerinin tespit edemediği bakterileri tespit edebildi.U bakteri probu, ardından tümör içeren akciğer doku kesitlerindeki diğer bakterileri tespit etme yeteneği açısından test edildi. Bakteriler, tümörün içinde olduğu kadar dışında da tespit edildi. Etiyolojisi bilinmeyen bir hastalık olan oral liken planus hastalarından alınan dokular incelendiğinde, bakteri probu inflamatuar infiltrasyonun gözlemlendiği epitel ve lamina propria hücreleri içinde bakteriyel sinyaller tespit etti.Geliştirildiğinden beri bu teknik, bulaşıcı hastalıklar alanındaki araştırmacıların, bu prosedürü takiben hem insanlarda hem de hayvanlarda bakterilerin dokulara istilasını incelemesine yardımcı olmuştur. Dokular içerisinde bakterilerin ne tür hücrelerde barındığı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, immünokimyasal saptama veya hücre belirteci büyümesi gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

in-situ-detection-bacteria-within-paraffin-embedded-tissues-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Kaynak: Choi, Y. S. ve diğerleri. Parafinli dokularda bakterilerin yerinde tespiti, 16S rRNA'yı hedefleyen digoksin etiketli DNA probu kullanılarak. J. Vis. Exp. (2015).Bu video, bakteriyel DNA'yı hedefleyen digoksin etiketli DNA probları kullanılarak fare diş eti dokusu kesitlerinde bakterilerin yerinde tespitini göstermektedir. Bölüm prob ile kuluçka edilir. Digoksine özgü alkali fosfataz ile konjuge edilmiş antikorlar eklenir. Endojen fosfatazlar inaktive edilir ve substrat eklenmesiyle...

Fare diş dokusu kesitlerinde bakterilerin yerinde tespiti

Bu video, idrar yolu ile enfekte olmuş bir hastadan alınan deparafinlenmiş mesane dokusundaki bakterilerin görselleştirilmesini göstermektedir. Bakteriyel 16s ribozomal RNA'lar ile hibritlenmiş floresan etiketli prob, dokuyla ilişkili bakterileri ve dağılımlarını ortaya çıkararak, numune içindeki yoğunlukları hakkında değerli uzamsal bilgiler sağlar.

Mesane Biyopsi Kesitlerinde Bakterilerin Floresan In Situ Hibridizasyon ile Görüntülenmesi

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Bu videonun amacı klinik ortamda nadir mutasyonları tespit etmek formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) referans standart hücre hatları ve dijital damlacık PCR (ddPCR) analizden otomatik DNA ekstraksiyon gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. FFPE örneklerde mutasyonları tespit edilmesi FFPE örneklerinde ddPCR klinik faydasını ortaya koyar.

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

Burada, dağınık şekilde ve geçici kene cesaret bir değiştirilmiş bütün-mount In situ hibridizasyon yaklaşım kullanarak uygun microbiota varlığı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Bu iletişim kuralı, parafin içinde gömülü ve cam slaytlar kesitli yetişkin mercan örnekleri in situ hibridizasyon gerçekleştirileceği hedeftir. Bu bir RNA Anti-anlamda prob dokulara parafin katıştırılmış uzamsal ifade görselleştirmek için kullanılan bir nitel yöntemidir.

Situ Parafin gömülü yetişkin mercan örnekleri için hibridizasyon teknikleri

Bu protokol, hasta biyopsilerinde doku ilişkili bakterilerin situ hibridizasyon ve konfokal mikroskopide 16S rRNA ile tarafsız olarak saptanması içindir.

Situ Hibridizasyonda 16S rRNA Floresan ile Mesane Biyopsilerinde Doku Dağı Bakterilerin In Salgılanması

Bu kolaylaştırılmış protokol, karmaşık doku örneklerindeki bakterileri tespit etmek ve görüntülemek için, dokuyu sabitlemekten floresan in situ hibridizasyonlu mikropları boyamaya kadar bir iş akışını detaylandırıyor.

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Hücre dışı bakteriler ve Orsay virüsü ve mikrosporidia (mantarlar) gibi hücre içi patojenler de dahil olmak üzere bağırsak mikropları genellikle vahşi Caenorhabditis nematodları ile ilişkilidir. Bu makalede, C. elegans nematodlarını kolonize eden ve/veya enfekte eden mikropların tespiti ve nicelleştirilmesi ve laboratuvarda kontrollü enfeksiyonlardan sonra patojen yükünün ölçülmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

Bu protokol, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) doku örneklerinde gen amplifikasyonunu görselleştirmek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar.

Floresan In Situ Hibridizasyon ile Formalinle Sabitlenmiş Parafine Gömülü Numunelerde Gen Amplifikasyonunun Sağlam Tespiti

Öğrenin parafine gömülmüş dokularda bakterileri in situ tespit etmek için 16S rRNA hedefleyen DIG-etiketli DNA problarını kullanmayı. Bu yöntem periodontal hastalıklar ve kanserlerde bakterilerin rolünü anlamaya yardımcı olur.

16S rRNA Hedefleme Digoksin-etiketli DNA probu kullanılarak Parafine gömülmüş dokular içinde Bakterilerin in situ tespiti

Daha fazla video keşfet