16S rRNA Hedefleme Digoksin-etiketli DNA probu kullanılarak Parafine gömülmüş dokular içinde Bakterilerin in situ tespiti

Bu prosedürün genel amacı, DNA problarını hedefleyen DIG etiketli 16 s ribozomal, RNA kullanarak parafine gömülü dokulardaki bakterileri lokalize etmektir. Bu, önce probun PCR amplifikasyonu ve DIG etiketlemesi ile hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, doku kesitlerini daha erişilebilir hedef bölgelere ve daha az arka plan bağlanmasına sahip olacak şekilde hazırlamaktır.

Daha sonra, hazırlanan doku kesitleri kazı etiketli prob ile hibritlenir. Son olarak, hibritleştirilmiş prob, anti-D dig antikorları olarak etiketlenmiş alkalin fosfataz ile tespit edilir. Sonuçta, bu C iki hibridizasyon yönteminde parafine gömülü dokulara sahip bakterilerin varlığını gösterebilir.

Bu tespitin ING gibi mevcut yöntemlere göre alan avantajı, bu yöntemin bazı histolojik yapılar bağlamında bakteri SHS'sini tespit edebilmesidir. Bu yöntem patogenez hakkında bilgi sağlayabilir, ancak periodontitis ve R planet gibi çeşitli enflamatuar olacaktır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü doku hazırlıkları ve hibrit sindirim adımlarının yürütülmesi zordur, çünkü doku bölümleri kolayca zarar görür.

U bakteri probunu yapmak için 70 baz çifti, şablon olarak DNA fragmanı ve probu PCR ile amplifiye etmek için iki adet 15 baz çifti primeri kullanın. Amplikoyu bilinen bir konsantrasyonda tamponda toplayın. Ardından probu bir kazı DNA etiketleme ve tespit kiti ile etiketleyin.

İlk önce probun üç mikrogramını 15 mikrolitre suya karıştırın. Probu ısı bloğunda 95 santigrat derecede 10 dakika boyunca denatüre edin. Sonra denatüre probu buzun üzerine koyun.

Daha sonra, iki mikrolitre 10 XH nükleotid, iki mikrolitre DN NTP ve bir mikrolitre kanal enzimi ekleyin. Karıştırıldıktan sonra, probun 24 ila 48 saat sonra 37 santigrat derecede inkübe etmesine izin verin. Karışımı 65 santigrat dereceye ısıtarak reaksiyonu durdurun.

Daha sonra etiketli probun DNA konsantrasyonunu 260 nanometrede ölçün ve konsantrasyonu mikrolitre başına 100 nanograma ayarlayın. Kiti kullanarak, önce bir naylon membran üzerine probların hassasiyetini kontrol edin, bir mikrolitre seri olarak seyreltilmiş pozitif kontrol yükleyin. Prob ve kazı etiketli probu.

Membranı beş dakika kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra, zarı kısaca iki XSSC'ye daldırın ve ardından bir saat boyunca 80 derecelik bir inkübatöre aktarın. İnkübasyondan sonra DNA'yı hareketsiz hale getirmek için, zarı kısaca maleik asit tamponuna batırın, daha sonra yarım saat sonra bir ila 5.000 seyreltmede AP konjuge antikorlarla konsantre edilmiş bloke edici tampona aktarın.

Membranı MABT'de yıkayın. Sonra 40 mikrolitre N-B-T-B-C-I-P'yi iki mililitre algılama tamponuna karıştırın. Banyodan sonra, bu karışımı bir dakika boyunca zara ekleyin.

Parafini çıkardıktan ve doku bölümlerini metin protokolünde tarif edildiği gibi yeniden sulandırdıktan sonra, bunları C iki hibridizasyon için hazırlayın, önce slaytları 20 dakika boyunca 0.1 normal hidroklorik aside batırın. Asit banyosundan sonra, slaytları DEPC ile arıtılmış su ile 30 saniye boyunca yıkayın. Daha sonra bir balmumu kalemi kullanarak her slayttaki örnekleri ana hatlarıyla belirtin.

Daha sonra, boyutlarına bağlı olarak örneklere 50 ila 400 mikrolitre proteinaz K çözeltisi ekleyin. Enzimin 37 santigrat derecede 30 dakika çalışmasına izin verin ve ardından slaytları DEPC ile muamele edilmiş bir XPBS'de bir dakika boyunca yıkayın. Şimdi slaytları 10 dakika boyunca DEPC ile muamele edilmiş PBS'de% 4 paraform aldehite aktarın.

Sabitleyiciyi daha önce olduğu gibi PBS ile yıkayın. Daha sonra slaytları pH sekizde 0.1 molar trietanolamin hidroklorür içinde% 0.5 asetik ve hidrit ile yıkayın 20 dakika sonra, slaytları daha önce olduğu gibi temiz suyla yıkayın. Şimdi, slaytları önce 20 dakika boyunca iki XSSC'ye daldırarak C iki'de başlayın.

Bu arada, negatif bir kontrol için etiketli probu hibridizasyon tamponunda mikrolitre başına bir nanograma seyreltin. Etiketsiz prob probunun konsantrasyonunun 10 katını kullanın. Daha sonra probları 90 derecede 10 dakika ısıtarak ve ardından buz üzerinde hızlı bir şekilde soğutarak denatüre edin.

Daha sonra, her slayta daha önce uygulanmış olan proteinaz K ile aynı hacimde prob seyreltmesi uygulayın. Daha sonra kaymayı dikkatlice kapatın ve oje kullanarak bölümleri kapatın. Şimdi, slaytları bir PCR makine bloğunda 90 santigrat derecede 10 dakika ısıtın ve ertesi gün gece boyunca 45 santigrat derece nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın.

Slaytları yarım saat boyunca dört santigrat derecede soğutun ve ardından kapak fişlerini dikkatlice çıkarın. Dokular kırılgandır. Son olarak, slaytları oda sıcaklığında bir dizi SSC tamponundan geçirin.

İlk olarak, NC iki hibritleştirilmiş slaytı MABT'de beş dakika boyunca yıkayın. Daha sonra 50 ila 400 mikrolitre bloke edici solüsyonu 20 dakika boyunca %1 ara 20 olarak uygulayın. Blok inkübasyonundan sonra, 50 ila 400 mikrolitre bir ila 1000 anti-D dig alkalin fosfataz antikoru ve bloke edici solüsyon uygulayın.

Birincil uygulandıktan sonra 37 santigrat derecede 90 dakika bağlanmasına izin verin. Slaytları MABT'de 10 dakika yıkayın. Ardından beş dakika boyunca slaytları %1 ara 20 ile algılama arabelleğine koyun.

Şimdi her slayta 50 ila 400 mikrolitre bir milimolar ole tespit tamponu çözeltisi uygulayın ve endojen alkalin fosfatazı etkisiz hale getirmek için beş dakika inkübe edin. Daha sonra, algılamada seyreltilmiş 50 ila 400 mikrolitre N-B-T-B-C-I-P ekleyin. Her slayta bir ila 100 arasında tamponlayın ve slaytların deneyime dayalı olarak nemlendirilmiş bir odada iki ila üç saat inkübe etmesine izin verin.

Slaytları DI su ile durulayın, ardından hacimce ağırlıkça %0,05 oranında metil yeşili uygulayın ve karşı lekenin doku üzerinde 10 dakika çalışmasına izin verin. 37 santigrat derecede. Slaytları tekrar DI suyla yıkayın ve ardından %100 etanol ile kurutun, ardından ksilene daldırın.

Son olarak, 80 mikrolitre montaj ortamı ve kapak kayması uygulayın. Problardan sonraki slaytlar kazı etiketli hale getirildi. Duyarlılıkları, pozitif kontrol probunun seyreltilmesi ile karşılaştırıldı.

3 43 baz çifti p gingivalis spesifik prob, tasarlanmış 70 baz çifti bakteri probundan 25 kat daha hassastı. İki prob daha sonra kronik periodontitisli hastaların diş eti dokularına yüksek büyütme ile uygulandı. Bakterilerin çeşitli şekilleri, bakteri probu kullanılarak ayırt edilebilirdi.

P gingivalis'e özgü prob sadece çubuk şeklindeki bakterileri tespit ederken, farelerin gingival mukozasına sıkı bir bağlantı bozucu kimyasal DSS uygulandı. Bu farelerden alınan doku örnekleri, probları farklı bir bağlamda karşılaştırmak için kullanıldı. Burada, U bakteri probu, diğerinin tespit edemediği bakterileri tespit edebildi.

U bakteri probu daha sonra tümör içeren akciğer dokusu bölümlerindeki diğer bakterileri tespit etme yeteneği açısından test edildi. Bakteriler tümörün içinde olduğu gibi tümörün dışında da tespit edildi. Etiyolojisi bilinmeyen bir hastalık olan oral liken planuslu hastalardan alınan dokuları incelerken, bakteri probu, inflamatuar infiltrasyonun gözlendiği epitelyal ve lamina propria hücreleri içinde bakteri sinyalleri tespit etti.

Geliştirilmesinden bu yana, bu teknik, bulaşıcı hastalıklar alanındaki araştırmacının hem insanlarda hem de hayvanlarda dokulara bakteri istilasını keşfetmesine yardımcı olmuştur. İmmünokimyasal saptama, hücre markörüne büyüme gibi diğer yöntemler, ne tür hücrelerin dokulardaki bakterileri barındırdığı gibi ek soruları yanıtlamak için ED olabilir.