Tasarım ve Yapay Ekstrasellüler Matrix İnşaatı (aECM) Proteinler gelen Escherichia coli Cilt Doku Mühendisliği

Bu prosedürün genel amacı, yapay ECM proteinlerinin veya elastin benzeri tekrarlar içeren bir ECM'nin yapımında ve üretiminde yer alan adımları göstermektir. Bu, önce A ECM proteinlerini kodlayan rekombinant genlerin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, rekombinant genler bakteri konakçılarına yerleştirilir.

Bu noktada, rekombinant proteinler bakteri konakçılarında eksprese edilir ve daha sonra hücre lizizi yoluyla protein ekstraksiyonunu takiben hasat edilir. Son adım, elastinin benzersiz faz geçiş davranışından yararlanan ters geçiş döngüsü veya ITC kullanarak proteinleri saflaştırmaktır. Polipeptitler gibi.

Santrifüjleme döngüleri dört santigrat derece ve 37 santigrat derecede yapılır. Sonuç olarak, rekombinant proteinleri tanımlamak ve saflıklarını belirlemek için jel elektroforezi ve western blot teknikleri kullanılır. Bu tekniğin afinite sütunları gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, büyük miktarda proteini nispeten ucuza çıkarabilmemizdir.

Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi tüm ligament tasarımıyla başlayın. Oligomerler elde edildikten sonra, istenen gen dizisini elde etmek için DNA oligomerlerini anilleyin. İlk olarak, DNA oligonükleotidlerini DNA oligo tamponu içinde mikrolitre başına bir mikrogramlık bir nihai konsantrasyona çözün.

Toplam 40 mikrolitrelik bir karışım elde etmek için 32 mikrolitre DNA'ya ve diz çökme tamponuna her bir bağdan dört mikrolitre ekleyin. Daha sonra sıcak bir plaka kullanarak bir bardak su kaynatın ve karışımı beş dakika daldırın. 95 santigrat derecede, kabı çıkarın ve tüm kurulumu gece boyunca bir strafor kutuda kademeli olarak soğutun, oligomerler artık diz çökmüş ve sindirime hazırdır.

37 santigrat derecede üç ila dört saat boyunca Protokol Özeti metninde açıklandığı gibi al oligomerlerini ve konak vektörlerini ayrı ayrı sindirmek için karşılık gelen kısıtlama enzimlerini ekleyin. Sindirim ürünlerini bir agaroz jel üzerinde çalıştırdıktan ve DNA'yı saflaştırdıktan sonra, sindirilmiş DNA ekini plazmit vektörüne T four ligaz ile bağlayarak ilgilenilen geni sırayla birleştirin. Metin protokolünde bulunan tarifi kullanarak, ligasyon karışımını oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Ardından, Ali'nin ısı şokunu kullanarak hücreleri dönüştürün. 50 mikrolitre yetkin hücreyi temiz, önceden soğutulmuş mikro santrifüj tüplerine koparmak. Ligasyon karışımından beş mikrolitreyi hücrelere pipetleyin, karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

Karışımı 20 dakika buz üzerinde bırakın. Daha sonra hücre karışımını içeren mikro santrifüj tüpünü iki dakika boyunca 42 santigrat derece su banyosuna daldırın ve iki dakika boyunca buza geri dönün. Mikro santrifüj tüpüne 500 mikrolitre SOC ortamı ekleyin ve bir saat çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, 50 ila 500 mikrolitre hücre ligasyon karışımını, oda sıcaklığına önceden ısıtılmış ampisilin içeren iki kez YT burgu plakasına yayın. Plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin. Ertesi gün, temiz pipet uçları kullanarak burgu plakasından DNA kolonilerini toplayın.

Kolonileri iki kez beş mililitre içinde büyütün. Gece boyunca 37 santigrat derecede ampisilin içeren YT ortamı, ertesi gün çalkalayarak gece boyunca. Her koloni için DNA plazmitlerini çıkarmak için üreticinin protokolüne göre bir plazmit izolasyon kiti kullanın.

Rekombinant plazmitin metin protokolünde açıklandığı gibi bakteriyel ekspresyon konakçısına dönüştürülmesinden sonra 50 mikrolitre su ile DNA olan elute seçildi. Dönüştürülmüş burgu plakasından bir pipet ucu ile bir koloni seçin, aşılayın. Bir test tüpünde hem ampisilin hem de kloramfenikol antibiyotik içeren 10 mililitre steril, müthiş et suyu veya TB ortamı.

Bu başlangıç kültürünü gece boyunca 37 santigrat derecede 225 RPM'de çalkalayarak inkübe edin. Daha sonra 10 mililitre başlangıç kültürünü bir litre taze ve steril TB ortamına aktarın. Üç litrelik bir erlin Meyer şişesinde aynı antibiyotiklerle desteklenmiştir.

Kültürü 37 santigrat derecede inkübe edin ve iki ila üç saat boyunca 225 RRP M'de çalkalayın. Kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometrede veya OD 600'de gözlemleyin ve bir mililitre kültürü okumak için boş bir Q vet'e pipetleyerek 0,6 ila 0,8'e ulaştığını doğrulayın. Daha sonra, IPTG ile kültürü bir milimolar nihai konsantrasyona indükleyin ve dört saat daha 225 RPM'de çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kültürü bir litrelik santrifüje, şişelere aktararak ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 12.000 Gs'de santrifüjleyerek hücreleri hasat edin. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletlerini tartın ve mililitre başına 0.5 gramda 10 tamponda yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse hücre kültürünü gece boyunca eksi 80 santigrat derecede dondurun.

Ertesi gün, donmuş hücre kültürünü oda sıcaklığında bir su banyosunda veya buz üzerinde çözdürün. L'ye hücreler deoksi ribonükleaz, bir ribonükleaz a ve fenil metil süen florür ekler. Çözeltiyi çözerken, çözeltiyi yavaş karıştırarak homojenize edin.

Tüm yeniden süspanse edilmiş hücreler çözüldükten sonra, sudaki protein çözünürlüğünü çok dikkatli bir şekilde artırmak için çözeltiyi pH 9.0'a ayarlayın. Homojen bir kıvam elde etmek için buz üzerinde karıştırılarak damla damla altı N sodyum hidroksit ilave edilir. Daha sonra, iki milimetre çapında düz bir uç ve beş saniyelik bir darbe kullanarak, buz üzerinde 20 dakika boyunca ultrasonik bozulma ile hücreleri bitleyin.

Hücre çözeltisini dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 12.000 Gs'de santrifüjleyin. Supernat'ı temiz, boş bir şişeye aktarın ve daha sonra saflaştırma için dört santigrat derecede saklayın. Bu arada, hücre peletini 10 tampon ile tekrar süspanse edin ve 20 mikrolitre hücre lizatından tasarruf edin.

SDS sayfa karakterizasyonu için, hücre lizizini tamamlamak için yeniden askıya alınmış hücre peletini eksi 80 santigrat derecede yeniden dondurun. Donma, çözülme ve sonikasyon işlemini üç defaya kadar tekrarlayın. Hücre lizatını daha önce harmanlayın ve yüksek tuz koşullarında farklı sıcaklıklarda santrifüjleme döngülerinin gerçekleştirildiği ITC kullanarak A ECM proteinlerini saflaştırmaya devam edin.

Hücre lizatını 50 mililitrelik santrifüje, şişelere bölün ve dört santigrat derecede iki saat boyunca 40.000 G'de santrifüjleyin. Peletten temiz bir ayrım elde etmek için pipetleme yaparak süpernatanı çıkarın. Süpernatanı temiz santrifüj şişelerinde toplayın ve bir azı dişinin nihai konsantrasyonuna kadar sodyum klorür ekleyin.

Çözeltiyi 225 RPM'de çalkalanarak iki saat boyunca 37 santigrat dereceye ısıtın. Sonraki santrifüj. 37 santigrat derecede iki saat boyunca 40.000 Gs'de süpernatant.

Boşaltma işleminden sonra, süpernatant metal bir spatula kullanarak peleti ezer ve pelet uçlarını buzda yeniden süspanse eder. Soğuk otoklavda damıtılmış su, pelet tamamen eriyene kadar manyetik bir karıştırma çubuğu ve plaka kullanarak gece boyunca dört santigrat derecede kuvvetlice karıştırılır. 37 santigrat derecedeki pelet beyaz olana kadar bu döngüleri tekrarlayın, bu noktada gece boyunca suda çözülebilir ve santrifüjlenebilir.

Protein çözeltisini elde etmek için, protein çözeltisini dört santigrat derecede damıtılmış suya karşı diyalize ederek tuzdan arındırın, suyu SDS sayfası için 20 mikrolitre saflaştırılmış proteinden tasarruf ettikten sonra iki ila üç gün boyunca gece boyunca her dört saatte bir veya sekiz saatte bir değiştirin. İndüklenen numunede tahmin edilen moleküler ağırlıkta yoğun bir protein bandı bulunur. Ayrıca, laminin beş A ECM'ye karşılık gelen 22 kilodaltonluk bir moleküler ağırlığa sahip saflaştırılmış bir protein numunesi içeren SDS sayfa jeli de gösterilmiştir.

A ECM proteinlerinin tahmini saflığı yaklaşık %90 ila %95'tirBu değer, hedef proteinin bant yoğunluklarının ve SDS jeli üzerinde bulunan diğer protein bantlarının oranlarının karşılaştırılmasıyla elde edilmiştir. Son olarak, saflaştırılmış proteinin gerçekten A ECM proteinleri olup olmadığını belirlemek için burada Western blotlama yapıldı. Üç A ECM proteininin protein saflığı, bir SDS sayfa jeli ile gösterilir ve western blotlama için nitroselüloz membranın bir görüntüsü ile karşılaştırılır.

Analiz, at turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş anti hekza histidin etiket antikorları kullanılarak etiketlenmiş hedef proteinler kollajen dört A ECM ve laminat beş A ECM'nin varlığını ortaya koymaktadır. A ECM proteinlerinin nihai verimleri litre başına 60 miligram ile litre başına 120 miligram arasında değişmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, özel uygulamanız için elastin ışık alanları içeren proteinleri nasıl daraltacağınızı ve saflaştıracağınızı iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.