Name: Susturulması BRCA2 Kültür İnsan hücrelerinde Roman BRCA2 düzenlenmiş Biyolojik Fonksiyonları Belirlemek İçin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Keşfedin BRCA2 gen susturma yöntemini siRNA transfeksiyonu ve Western blot ile insan hücre hatlarında. Bu teknik, yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerin verimli tespiti için kanser biyolojisi araştırmalarında değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, FIRB-Merit hibeleri RBNE08YFN3_005 ve RBNE08HWLZ_012 ve İtalya Ekonomi ve Maliye Bakanlığı tarafından "FaReBio di Qualità" Projesi için CNR'ye desteklenmiştir.

1. siRNA çözümleri hazırlayın <ol><li> (50 uM son konsantrasyon siRNA) RNaz içermeyen su, 100 ul BRCA2 siRNA kurutuldu pelet 5 karıştırılmış (CTRL) nmol ve 5 nmol yeniden süspanse edin. Bu siRNA stok ve 10 ul alikotları -20 ° C&#39;de saklanmalıdır. </li><li> SiRNA stoktan 10 ul bir kısım alın ve 10 uM siRNA çalışma çözeltisi elde etmek için RNaz içermeyen su içinde 40 ul ekle. Bu seyreltme, kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklanmalıdır. NOT: siRNA çalışma çözüm / dondurma geçmesi 3 kat daha fazla çözülme olmamalıdır. </li></ol> İnsan epitelyal hücre hattı olduğunu 2. Tohum <ol><li> 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde doku kültürü plakaları içinde hücre mono tabakaları olarak büyüyen insan epitelyal hücre hatları büyüme ortamı çıkarın. </li><li> Bir kez RT PBS ile plaka hücreleri (100 mm tabak için 10 ml PBS) yıkayın. </li><li> Plaka hücreleri ayırmak için,% 0.25 tripsin ve 2 ml / 0.53 mM EDTA çözeltisi ekleme ve hücre tipine bağlı olarak 3-5 dakika inkübe edin. </li><li> Müstakil hücreleri toplamak önce,% 10 fetal sığır serumu içeren tam büyüme ortamı 2 ml eklenerek tripsin nötralize eder. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüpe hücreleri aktarın. </li><li> Sallanan kepçeli rotor içinde 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 320-330 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Antibiyotikler-içermeyen ortamdan 5 ml hücre pelletleri yeniden süspanse edin. </li><li> Bir Bürker odasında mikroskop altında ya da imalatçının talimatlarına uygun olarak, otomatik bir sayma sistemi kullanarak hücreleri sayın. </li><li> 6-delikli plakalardaki hücreler 24 saat (de 0.5-1 x 10 her biri için ortam 2 ml 6 hücre) sonra yaklaşık% 80 konfluent olarak tohumu. Optimal hücre sayısı özel hücre çizgileri, büyüme oranına bağlı olarak değişebilir tohumlanır edilmesi. NOT: antibiyotikler olumsuz transfe verimliliği engel olacak çünkü bu noktada ortamda antibiyotik katmayınction. Bu BRCA2 siRNA transfeksiyon, yüksek verim elde etmek için, düşük bir kültür geçitlerin (&lt;10) en hücreleri olması çok önemlidir. </li></ol> SiRNA ile 3. Transfect hücreleri <ol><li> Yirmi dört saat sonra, hücreler kaplama sonrası, transfeksiyon ilk tur devam edin. <ol><li> Indirgenmiş serum ortamı 130 ul lipid bazlı 10 siRNA belirli transfeksiyon reaktif 6 ul sulandırmak. </li><li> Indirgenmiş serum ortamı 130 ul 10 uM siRNA (30 pmol) 3 ul sulandırmak. </li><li> Seyreltildi transfeksiyon reaktifi ile seyreltildi siRNA birleştirin ve oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> İnkübasyon sırasında, hücrelerden orta kaldırmak ve taze ortam (antibiyotiksiz), 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış 2 ml ekleyin. </li><li> Hücrelere siRNA transfeksiyon reaktifi komplekslerinin 250 ul (bu miktar, 6 gözlü bir plakanın tek oyuk için) ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde hücreleri inkübe76;% 5 CO2 C. </li></ol></li><li> 24 saat sonra, adım 3.1.2 şu değişiklikler 3.1.1-3.1.5 adımları tekrarlayarak transfeksiyon ikinci tur devam: düşük serum ortamı 130 ul 10 uM siRNA (50 pmol), 5 ul seyreltilir. <ol><li> Analizden önce 37 ° C&#39;de 1-2 gün süreyle inkübe hücreleri. NOT: transfeksiyonları ve ikinci turda yüksek bir siRNA / transfeksiyon reaktif oranına kullanımının iki tur BRCA2 sessizliğini yüksek verim elde etmek için gereklidir. </li></ol></li></ol> Immunoblotting analizi için 4. Hücreleri, <ol><li> Iyonik-olmayan, denatüre edici olmayan deterjan oktilfenoksipolietokisetanol% 1, 5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM sodyum ortovanadat, 10 mM sodyum flüorür, 2 mM fenilmetilsülfonil fluorür, 10 ug içeren PBS (pH 7.4), taze liziz tamponu / ml löpeptin, 10 | ig / ml aprotinin. Buz üzerinde tutun. </li><li> Hücreler ve w orta çıkarınlevhanın soğuk PBS (2 ml / oyuk) ile bir kez bunları kül. Herhangi bir PBS taşınmasını önlemek için, tamamen plaka çıkarın. </li><li> Her bir oyuğa liziz tamponu içinde 200 ul ekle. NOT: hücreler, diğer analizler için de kullanılabilir hücreleri trypsinize aşama 2,1-2,6 tarif edildiği gibi ve uygulamaya göre, uygun tampon / ortam içinde hücreler tekrar süspansiyon gerekir ise kullanılır. </li><li> Yavaşça eşit lizis tamponu dağıtma ve bir döndürücüde 4 ° C de 15 dakika inkübe etmek plaka döndürün. </li><li> Bir hücre kazıyıcı kullanılarak buz üzerinde, bir mikrosantrifüj tüpü içinde, hücre lizat toplayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 25 dakika boyunca 17.900 x g&#39;de santrifüje ve yeni bir tüp içinde supernatant toplamak. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir ticari olarak temin edilebilen protein deneyi kullanılarak protein konsantrasyonu ölçümü. </li></ol> 5. BRCA2 immunoblotting analizi <ol><li> 20x Tris-Asetat SDS çalışan b 50 ml seyreltilmesi ile çalışan tampon hazırlayınUffer (50 mM Trişin, 50 mM Tris baz,% 0.1 SDS, pH 8.24) damıtılmış su 950 ml. </li><li> Aşağıda örnek hazırlayın: 20 nihai bir hacme kadar 15 toplam hücre lizatı ug, 4x numune tamponu içinde 5 ul pH 8.4 lityum dodesil sülfat içeren, 10x Örnek indirgeyici madde (0.5 M DTT) 2 ul ve lizis tampon eklemek ul. NOT: Bu protokol, (5 ug kadar), aynı zamanda, toplam proteinlerin daha düşük bir miktarda kullanarak, normal hücre çizgilerinde BRCA2 saptanmasını sağlar. </li><li> 10 dakika boyunca 55 ° C&#39;de numune denatüre. NOT: 55 ° C kullanmak çok önemlidir. BRCA2 proteini ısıya 11 olduğu için, daha yüksek sıcaklıklar, denatüre edici tam boy (390 kDa), BRCA2 proteininin tutarlı bir azalmaya neden olur. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre elektroforetik bölmeyi ayarlayın. </li><li> Örnekler ve precasted jeli üzerinde yüksek molekül ağırlıklı ön-lekeli protein standardı 10 ul (Tris-Asetat% 3-8) yük ve ab 120 V çalıştırmak2 saat 12. 55 kDa mavi işaretleyici precasted jel ayrılmadan önce elektroforetik akışını durdurur. </li><li> 20x Transfer tamponu, 50 ml% 100 metanol, 100 ml ve 850 ml su ile birlikte Transfer tamponu hazırlayın. </li><li> 5 dakika boyunca% 100 metanol içinde ıslatarak PVDF membranı (0.45 mikron gözenek büyüklüğü) aktive damıtılmış su ile yıkayın ve en az 5 dakika için transfer tamponu içinde dengeye. Kullanılana kadar 4 ° C &#39;de transfer tampon maddesi transfer cihazının sünger bekletin. </li><li> Elektroforetik çalışma bittiğinde, aşağıdaki sırayla (aşağıdan yukarıya) transfer yığınında sandviç monte: transfer tamponu doymuş üç süngerler, tek 3MM sınıfı kağıt levha transfer tamponu, jel, aktif PVDF membran, tek 3mm doymuş Transfer tamponunda doymuş sınıf kağıt levha, üç süngerler transfer tamponu 13,14 doymuş. 4 ° C&#39;de gece boyunca mA 4 ° C ya da 180 ° C&#39;de 4 saat 350 mA&#39;da cihazı ve aktarım proteinleri içine yığın yerleştirin. NOT: yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin tam transferini sağlamak üzere 4 saat veya gece için (üretici ve çoğu aktarım protokolleri tarafından önerilen) olmak BRCA2 çok büyük bir protein o 1 saat transfer süresini uzatmak için çok önemlidir. Buna ek olarak, uzun bir aktarım zaman, bu aşırı ısınmayı en aza indirmek ve sandviç Sökme kolaylaştırmak için 4 ° C &#39;de soğuk bir odada blotting işleminin gerçekleştirilmesi için çok önemlidir. Yarı kuru transfer sistemleri büyük proteinlerin aktarımı için iyi değildir. </li><li> Aktarma işleminden sonra (30 ul anti-BRCA2 tavşan poliklonal antikoru ile 4 ° C&#39;de bir gece boyunca% 5 yağsız kuru süt ve probu içeren TBS-Tween% 0.25 içinde oda sıcaklığında 1 saat (TBS-T) için bloke TBS ile zarın yıkanması [: 300 (h / h) sulandırma 1] 9 ml TBS-T +% 5 yağsız kuru süt içinde seyreltilmiş 200 ng / ml). </li><li> Daha sonra TBS 10 ml seyreltilmiş bayır turpu peroksidazı ile konjuge edilmiş anti-tavşan ikincil antikoru ile 1 ul, 1 saat boyunca filtre inkübe, TBS-T ile, membran üç defa (10 dk) yıkayın-T +% 5 yağsız kuru süt. Bundan sonra, TBS-T ile membranı üç defa (10 dk) yıkayın. </li><li> Gelişmiş kemilüminesans (ECL) Western Blot saptama reaktif maddesi kullanılarak, üretici talimatlarına göre BRCA2 proteini ortaya çıkarmak için ECL tarafından immunodeteksiyon gerçekleştirin. Yüksek çözünürlüklü ECL filmlerinde immunochemiluminescent bantları gözünüzde canlandırın. </li><li> 10 anti-tubulin antikoru 1000 (10 ul: β-tubulin bir monoklonal antikor kullanılarak 1 seyreltilmiş göre yükleme kontrolü olarak, aynı filtre üzerinde, β-tubulin (55 kDa) gibi bir ev bakıcısı geni için bir antikor ile immunodeteksiyon gerçekleştirme oda sıcaklığında 1 saat ml TBS-T +% 5 yağsız kuru süt). Yaban turpu peroksidazı ile konjuge edilmiş anti-fare yerine anti-tavşan sekonder antikor kullanılması haricinde, yıkama ve BRCA2 (5,10-5,11) için tarif edildiği gibi sekonder antikoru inkübe edin. </li><li> (Immunochemiluminescent bantları ile etkilendim filmlerin dijital görüntü elde ve özel görüntü analiz yazılımı tarafından bant yoğunluğunu analiz, örneğin., ImageJ). </li></ol>

<ol><li>Thorslund, T., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA2%3A+a+universal+recombinase+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BRCA2: a universal recombinase regulator.</a> Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).</li>
<li>Yoshida, K., Miki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+BRCA1+and+BRCA2+as+regulators+of+DNA+repair%2C+transcription%2C+and+cell+cycle+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage.</a> Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).</li>
<li>Martin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+mutations+in+BRCA1+and+BRCA2+in+breast-ovarian+families+from+a+breast+cancer+risk+evaluation+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic.</a> J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).</li>
<li>Castro, E., Eeles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+BRCA1+and+BRCA2+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer.</a> Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).</li>
<li>Vencken, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensitivity+and+outcome+of+BRCA1-+and+BRCA2-associated+ovarian+cancer+patients+after+first-line+chemotherapy+compared+with+sporadic+ovarian+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients.</a> Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).</li>
<li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434, 917-921 (2005).</li>
<li>Arbini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+depletion+sensitizes+cancer+cells+to+PARP+inhibitors+by+translational+and+post-translational+repression+of+BRCA2%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2.</a> Oncogenesis. 2, e82(2013).</li>
<li>Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AURKA+and+BRCA2+expression+highly+correlate+with+prognosis+of+endometrioid+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma.</a> Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).</li>
<li>Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+BRCA2+decreases+anoikis+and+its+heterologous+expression+sensitizes+yeast+cells+to+acetic+acid-induced+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death.</a> Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).</li>
<li>Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-based+gene+delivery+systems%3A+pharmaceutical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives.</a> Pharm Res. 14, 853-859 (1997).</li>
<li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+BRCA2%3A+temperature+sensitivity+of+detection+and+cell-cycle+regulated+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression.</a> Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. ' <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Western+blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Hunter, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+hypoxia+and+homologous+recombination+repair+dysfunction+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. , (2014).</li>
<li>Drew, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitor+AG014699+in+human+cancers+with+mutated+or+methylated+BRCA1+or+BRCA2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2.</a> J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28ADP-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434, 913-917 (2005).</li>
<li>Ihnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+the+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitor+rucaparib+for+the+treatment+of+sporadic+human+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer.</a> Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).</li>
<li>Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brca2+Deficiency+Leads+to+T+Cell+Loss+and+Immune+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction.</a> Mol Cells. , (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Kadın ve erkek meme kanseri, yumurtalık kanseri, prostat kanseri, pankreas kanseri ve melanom 3,4 dahil olmak üzere birçok kanser türleri, risk artışına BRCA2 geni kurşun germline mutasyonlar, çok sayıda çalışma biyolojik işlevini anlamak için yapılmıştır Çünkü BRCA2 protein. Bu çalışmaların çoğu nedeniyle BRCA2 gibi dev bir protein analiz teknik zorluklar genetik temelli çoğunlukla. BRCA2 protein ekspresyonu susturma ve analiz edilmesi için burada tarif edilen metot, biyolojik tahliller, geniş bir s...

BRCA2 (Meme Kanseri yatkınlık geni-2) gen rekombinaz enzimi Rad51 1 işlevini düzenleyen DNA çift iplikli sonları onarımında önemli bir rol oynayan bir tümör baskılayıcı protein kodlayan. BRCA2 aynı zamanda transkripsiyonun modülasyonu ve hücre döngüsü kontrol 2 implike edilmiştir. BRCA2 geninin germline mutasyonlar için diğer kanser türleri 3,4 otozomal dominant erkeklerde meme ve kadınlarda yumurtalık kanseri ve prostat kanseri olan yatkınlığı, hem de yatkınlığı neden olur. Ancak, bastırmak ya da DNA hasarına neden olan 5-7 kemoterapötik ajanların kanser hücrelerinin daha hassas hale getirebilir BRCA2 fonksiyonunu azaltmak kanser, BRCA2 mutasyonları gelişmekte riski rağmen. Sporadik kanserler o BRCA2 protein düşündüren, BRCA2 proteininin azaltılmış düzeylerinin bazı kanser türlerinde tespit edilmiştir rağmen BRCA2 mutasyonları (&lt;% 3) düşük bir oran sergilemektedirolmayan mutasyon bağımlı mekanizmalar 7,8 ile sporadik kanserlerde tümör oluşumu sırasında kaybolmuş olabilir. Bu nedenle, tam Kanser biyolojisinde bağlamında gibi diğer biyolojik ortamlarda BRCA2 fonksiyonlarını anlamak önemlidir. Memeli hücrelerinde gen yeni işlevleri belirlemek için kullanılan güçlü bir araçtır ifadesini susturma etmektir. Bir örnek olarak, normal epitel hücrelerinin çeşitli susturma BRCA2 sentezleme en son anoikis direnci, kanser hücresi invaziv ve metastatik yeteneği 9 edinilmesi sırasında önemli bir aşama düzenleyici olarak BRCA2 yeni bir fonksiyon belirlenmesine yol açmıştır. Gen susması hücrelerin küçük müdahale (si) RNA ya da özel bir geni hedef alan kısa bir saç tokası (sh) RNA molekülleri ya sokulması ile elde edilebilir. Yüksek siRNA gücü ve kullanım kolaylığı kritik biyolojik süreçler içine yeni anlayışlar kazanma amaçlı deneyler susturmak için onu tercihli aracı yapmak birnd yeni tedavi hedefleri tespit etmek. Ancak, gen ekspresyonunun etkili bir yok etme tüm genler kolaylıkla elde olmayabilir ve hücre türüne bağımlı olarak oldukça değişken olabilir. Hücre içi protein seviyelerinde bir azalma araştırılmaktadır en uygun fenotip olduğu için, gen ürününün analizi immün gen susmasını ölçmek için son derece önemlidir. Bu bağlamda, BRCA2 proteininin bir başka meydan okuma sunuyor: Büyük bir protein (yaklaşık 390 kDa) olan, teknik zorluklar immunoblotting dahil olmak üzere geleneksel biyokimyasal analiz için mevcut. Biz burada insan epitel hücre hatlarında BRCA2 verimli susturulması için ve analiz immün demonte BRCA2 proteininin hızlı ve başarılı tespiti için optimize edilmiş bir protokol rapor.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&nbsp; D-001810-10-05</td><td>ON-TARGETplus Hedeflemeyen Havuz</td></tr><tr><td>Lipofiktamin RNAiMAX Reaktifi&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075">13778075</a></td><td>Transfeksiyon Reaktifi</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Transfeksiyon prosedürü için ortam</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Asetat %3-8 1,5 mm Jel prekast</td><td>Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>Protein elektroforezi için jel</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Örnek tampon&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Protein elektroforezi için reaktif</td></tr><tr><td>NuPAGE Numune Azaltıcı ajan (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>Protein elektroforezi için reaktif</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioksidan</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NP0005</td><td>Protein elektroforezi için reaktif</td></tr><tr><td>HiMark Önceden boyanmış protein standardı</td><td>Life Technologies</td><td>LC5699</td><td>Jel için önceden boyanmış işaretleyici elektroforez</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Cell&nbsp; Sistem</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>EI0002</td><td>Protein elektroforezi/transferi için ekipman</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Asetat SDS Çalışan Tampon</td><td>Ömrü Teknolojileri</td><td>LA0041</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>PVDF membran</td> için <td>Reaktif Western blotting için</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td> Reaktif</tr><tr><td>NuPAGE Transfer Tampon Ömrü</td><td>Teknolojileri</td><td>NP0006-1</td><td>Western blotlama için Reaktif</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 tavşan poliklonal antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-8326</td><td>1:300 seyreltme</td></tr><tr><td>Beta-tubulin monoklonal antikoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4026-100UL</td><td>1:1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Yağsız Süt tozu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70166</td><td>Western blotting için Reaktif</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Western blotting</td></tr> <tr><td>için reaktifSuperSignal West Pico/Femto Kemilüminesan Yüzey</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>Kemilüminesans sistemi</td></tr><tr><td>PNT1A hücreleri</td><td>SIGMA Aldrich (ECACC için)</td><td>95012614</td><td>PNT1A insan, SV40 Nthy hücreleri ile ölümsüzleştirilen normal prostat epiteli</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA Aldrich (ECACC için)</td><td>90011609</td><td>Nthy-ori 3-1 Hücre Hattı insan, tiroid foliküler epitel hücreleri</td></tr><tr><td>Hücre Proliferasyonu Kit I (MTT)</td><td>Hücre proliferasyon testleri için</td> <td>Roche</td><td>11465007001</td> Kiti</tr></tbody></table>

susturulması<em&gt; brca2</em&gt; kültür İnsan hücrelerinde roman brca2 düzenlenmiş biyolojik fonksiyonları belirlemek İçin

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Tümör baskılayıcı protein BRCA2 ve konvansiyonel biyokimyasal analizler tarafından tespit susturma insan BRCA2 proteininin (yaklaşık 390 kDa) büyüklüğü sayesinde büyük bir teknik sorun oluşturmaktadır. Biz insan epitel hücre hatlarında sırasıyla endojen BRCA2 proteini, insan BRCA2 susturmak ve tespit etmek için standart siRNA transfeksiyon ve immunoblotting protokolleri değişiklikler rapor. Anahtar adımlar transfeksiyon reaktif oranı yüksek siRNA ve aynı deney içinde siRNA transfeksiyon birbirini takip eden iki mermi bulunmaktadır. Anti-BRCA2 antikorlar ile analiz immün tarafından değerlendirilecek sürekli olarak insan BRCA2 geninin fazla% 70 susturulması elde standart protokole bu ve diğer değişiklikler kullanma. Buna ek olarak, bunun yerine klasik 70-100 ° C ve immunoblotting prosedür diğer teknik iyileştirmeler 55 ° C&#39;de hücre lizatlarının denatürasyon sağlam BRCA2 proteininin tespiti da WH izinbaşlangıç ​​malzemesinin çok düşük miktarlarda en mevcuttur ya da BRCA2 protein ekspresyon seviyesi çok düşük olduğunda. Insan hücrelerinde BRCA2 etkin susturulması, tümör hücreleri de dahil olmak üzere sağlam BRCA2, hücrelerde BRCA2 fonksiyonunu bozmaya yeni moleküler yollar ve tümör patojenik BRCA2 mutasyonu etkilenebilir hücre fonksiyonlarını incelemek için değerli bir strateji vardır. Verimli susturma ve BRCA2 gibi diğer &#39;büyük&#39; ​​protein analizi için bu protokolün Adaptasyon kolayca ulaşılabilir olmalıdır.

Hücre fonksiyonları üzerine BRCA2 susturma etkisini incelemek üzere bir biyolojik / biyokimyasal tahlil geçmeden önce, ilk adım bir şifreli siRNA (siRNA olmayan hedefleme) BRCA2 siRNA ile yan yana (Şekil 1A kullanarak susturma özgünlüğünü doğrulamak için ). Bu BRCA2 susturma yüksek verim elde etmek için yüksek bir siRNA / transfeksiyon oranı ile siRNA transfeksiyon ikinci tur gerçekleştirmek için önemlidir. Gerçekten de, siRNA transfeksiyon tek aşama performans ya da daha düşük, yok et...

siRNA ile gen susturma, kanser biyolojisini daha iyi anlamak için BRCA2'ye bağımlı biyolojik fonksiyonları anında çıkarımlarla analiz etmek için uygun bir deneysel stratejiyi temsil eder. BRCA2'yi verimli bir şekilde susturmak için bir yöntem, insan hücre hatlarında immünoblotlama yoluyla BRCA2 protein ekspresyonundaki değişiklikleri tespit etmek ve ölçmek için deneysel prosedür ile birlikte sunulmaktadır.

Susturulması<em&gt; BRCA2</em&gt; Kültür İnsan hücrelerinde Roman BRCA2 düzenlenmiş Biyolojik Fonksiyonları Belirlemek İçin

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Bu prosedürün genel amacı, SIR A transfeksiyonu yoluyla B RCA iki ekspresyonunu susturmaktır. Bu işlem, öncelikle SIR a transfeksiyon reaktifi komplekslerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, %80 konfluens düzeyindeki hücre tek tabakasına komplekslerin damla damla eklenmesiyle ilk transfeksiyon aşaması uygulanır. Son olarak, daha yüksek bir SIR, A'ya transfeksiyon reaktifi oranı kullanılarak ikinci bir SIR a transfeksiyonu gerçekleştirilir.Son olarak, hücre monotabakaları buz gibi soğuk PBS ile yıkanır ve hücreler dört derece Celsius'ta deterjan bazlı bir liziz tamponu ile lizize edilir. Nihayetinde, protein düzeyinde B RCA A iki susturulmasını göstermek için Western blotting analizi kullanılır. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerin yanı sıra tümör baskılayıcı B RCA iki gibi proteinlerin optimal tespitine ve etkili gen susturulmasına olanak tanımasıdır. Başlamak için, insan epitel hücre monotabakalarını nemlendirilmiş bir oda içerisinde 37 derece Celsius'ta ve %5 karbon dioksit ortamında büyüttükten sonra, büyüme ortamını uzaklaştırın ve hücreleri yıkamak için oda sıcaklığındaki PBS'yi kullanın.Hücreleri plakadan ayırmak için iki mililitre %0,25 trypsin 0,53 milimolar EDTA solüsyonu ekleyin ve hücre tipine bağlı olarak üç ila beş dakika inkübe edin. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce, %10 FBS içeren iki mililitre komple büyüme ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin. Tüpleri sallantılı kova rotoruna yerleştirin ve 320 ila 330 Gs'de, dört derece Celsius'ta üç dakika santrifüjleyin.Hücreleri saymak için bir Burker kamarası veya otomatik sayım sistemi kullanmadan önce, peletleri yeniden süspand etmek için beş mililitre antibiyotiksiz besiyeri kullanın. Ardından, altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna, iki mililitre antibiyotiksiz besiyeri içinde yaklaşık 0,5 ila 1 × 10⁶ hücre yerleştirin ve %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar 24 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, altı mikrolitre lipid bazlı siRNA spesifik transfeksiyon reaktifini 130 mikrolitre düşük serumlu besiyerinde seyrelterek ilk transfeksiyon aşamasına geçin.10 µM S irna'nın üç µL'sini 130 µL düşük serumlu besiyerinde seyreltin. Seyreltilmiş irna'yı seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile birleştirin ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, hücrelerdeki besiyerini uzaklaştırın ve iki mL taze antibiyotiksiz besiyeri ekleyin.37 °C'de ön ısıtma yapın. Ardından, altı kuyucuklu plaka içerisindeki hücrelerin her bir kuyucuğuna 250 µL siRNA transfeksiyon reaktifi kompleksleri ekleyin. Daha sonra hücreleri, %5 karbondioksit içeren, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edin.24 saat sonra, 10 µM siRNA'nın beş µL'sini 130 µL indirgenmiş serumlu ortamda seyrelttirin ve gösterildiği üzere ikinci transfection turuna geçin. İkinci turda yüksek siRNA konsantrasyonu, B rca'nın yüksek verimlilikle susturulması için gereklidir.İmmünoblotlama analizi için hücre lizatı hazırlamak amacıyla, analizden önce hücreleri 37 °C'de bir ila iki gün boyunca inkübe edin. Burada gösterilen tarife göre taze lizis tamponu hazırlayın. Hücrelerin üzerindeki medyumu uzaklaştırın ve hücreleri yıkamak için kuyuk başına 2 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin.Ardından, plakadaki PBS'yi tamamen uzaklaştırın ve her bir kuyucuğa 200 µL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin. Lizis tamponunun homojen bir şekilde dağılması için plakayı hafifçe döndürün ve bir rotatör üzerinde 4 °C'de 15 dakika inkübe edin. Daha sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak.Hücre lizatını buz üzerinde bir mikro santrifüj tüpüne toplayın, 17.900 Gs'de ve 4 °C'de 25 dakika boyunca santrifüjleyin ve immün blotting analizini gerçekleştirmek için süpernatanı toplayın. 50 ml 20x tris asetat SDS yürütme tamponunu 950 ml distile su ile seyrelterek yürütme tamponunu hazırlayın. Örneği şu şekilde hazırlayın.15 µg toplam hücre lizatı ekleyin. Lityum SDS sülfat pH 8.4 içeren dört x örnek tamponundan 5 µL, 0.5 M DTT'den 2 µL ve toplam hacim 20 µL olacak şekilde liz tamponu ekleyin. Örnekleri 55 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edin.b RCA iki proteini termo-hassas olduğu için bu sıcaklığın kullanılması kritik öneme sahiptir. Ardından, elektroforez hücresini üretici talimatlarına göre hazırlayın. Daha sonra, numuneleri 10 µL yüksek moleküler ağırlıklı yeniden boyanabilir protein standardı ile birlikte önceden dökülmüş bir jele yükleyin ve yaklaşık iki saat boyunca 120 volt değerinde çalıştırın.Bu sırada, 50 mililitre 20 x transfer tamponu, 100 mililitre %100 metanol ve 850 mililitre su ile transfer tamponunu hazırlayın. PVDF membranı %100 metanol içinde beş dakika bekleterek aktifleştirin. Distile su ile durulayın ve en az beş dakika boyunca transfer tamponu içinde dengeleyin.Transfer cihazının süngerlerini, kullanıma kadar 4 °C'de transfer tamponu içinde bekletin. 55 kilodalton mavi işaretleyici önceden dökülmüş jeli terk etmeden önce çalışmayı durdurun ve transfer tamponuna batırılmış üç süngerle başlayarak sandviçi oluşturun. Ardından, transfer tamponuyla doyurulmuş bir adet 3 mm kağıt ekleyin.Ardından jeli, ardından aktive edilmiş PVDF membranı, bunu takiben tamponla ıslatılmış bir adet 3M kalite kağıdı ve son olarak üç adet ıslatılmış süngeri ekleyin. Yığını aparata yerleştirin ve proteinleri 350 miliamperde dört saat boyunca dört santigrat derecede veya 180 miliamperde dört santigrat derecede gece boyunca transfer edin. Transferden sonra, membranı yıkamak için TBS kullanın ve TBST ile %5 yağsız kuru süt ile bir saat boyunca bloklayın.Ardından tamponu, 30 µL anti BCA two tavşan poliklonal antikoru içeren dokuz mililitre TBST süt tamponu ile değiştirin ve 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Membranı her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez TBST ile yıkadıktan sonra, 10 mililitre TBST süt tamponu içinde dilüye edilmiş 1 µL yaban otu peroksidaz konjuge anti tavşan sekonder antikor ile filtreyi bir saat boyunca inkübe edin. Membranı üç kez yıkadıktan sonra, üretici talimatlarını izleyerek KEMMA luminesans immünodeteksiyonu gerçekleştirin.Brca2 susturulmasının özgüllüğünü doğrulamak için bantları yüksek çözünürlüklü ECL filmleri üzerinde görselleştirin. Daha önce belirtildiği gibi, burada gösterildiği üzere Brca2 siRNA'sı ile yan yana rastgele dizili (scrambled) bir siRNA kullanılmıştır; Brca2 susturulmasında yüksek verim elde etmek için yüksek bir siRNA/transfeksiyon oranıyla ikinci bir siRNA transfeksiyon turu gerçekleştirmek önemlidir.Buradaki sonuçlar, hücre tipine bağlı olarak, düşük ve yüksek siRNA'nın transfeksiyon oranını kullanmak arasındaki knockdown verimliliği farkını göstermektedir. En yüksek gen susturma seviyesini elde etmek için gereken optimum minimum süre, örneğin ikinci siRNA transfeksiyon turundan sonra değişkenlik gösterebilir; bu şekildeki figürde gösterildiği üzere, NTHY tiroid hücreleri için 24 saat yeterliyken, PNT1A prostat hücrelerinde etkili BRCA2 knockdown için 48 saate kadar süre gerekmektedir. BRCA2 susturulması, ikinci transfeksiyon turundan sonra yedinci güne kadar oldukça stabildir. Daha önce belirtildiği gibi, hücre lizatlarının 55 °C üzerindeki bir sıcaklıkta denatüre edilmesi, BRCA2 proteininde %50'ye varan kayıpla sonuçlanmaktadır.Bu deneyde, B RCA A iki susturulmuş PNT bir A hücrelerinin PARP inhibitörü rucaparibe olan hassasiyeti, ilaçla 24 saatlik bir işlemden sonra incelenmiştir. Kontrollerle karşılaştırıldığında, B RCA iki eksilmiş PNT bir A hücrelerinde hücre proliferasyonunda zamana bağlı bir azalma gözlemlenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, BRC iki'nin yanı sıra, uzun protein kodlayan genlerin bir CRNA ile nasıl susturulacağı ve protein ürünlerinin optimize edilmiş bir immün bloklama prosedürü aracılığıyla nasıl verimli bir şekilde tespit edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.Bu yöntem, özellikle hücrelerde çok düşük düzeylerde eksprese edildikleri durumlarda, birçok diğer zorlu büyük proteine uygulanabilir.

silencing-brca2-to-identify-novel-brca2-regulated-biological

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz RNAi kullanarak bir hücrenin endojen BRCA1 protein tüketen ve bir kodlama değişiklik içeren bir BRCA1 noktası mutant yerine homolog rekombinasyon DNA hasarı tamir için bir doku kültürü bazlı analiz BRCA1 varyantları test etmek için bir yöntem sağlar.

Endojen Wild-tip BRCA1 Express hücreler kullanarak Homolog Rekombinasyon BRCA1 Mutasyonlar Etkileri belirlenmesi

Östrojen ve mikroRNA'lar hem aracılığıyla sinyal Moleküler meme kanseri gelişiminde ve büyümesinde önemli olan. Östrojen transkripsiyon faktörleri olan östrojen reseptörleri aktive eder. Pek çok transkripsiyon faktörleri microRNA ekspresyonunu düzenleyen ve estrojen ile düzenlenen microRNA farklı büyük ölçekli teknikler kullanılarak profilli olabilir.

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

NGS dizilimi için gDNA zenginleştirme, yapısal mutasyonların incelenmesi için kolay ve güçlü bir araçtır. Bu makalede, DNA hasarının onarımında yer alan 11 genin tam dizisini basitçe analiz etme prosedürünü sunuyoruz.

Whole Sırasının NGS Analiz için bir transpozaz tabanlı Technology tarafından gDNA Zenginleştirme BRCA1 BRCA2 ve 9 Genler

Burada, tümör hücresi metabolizmasının gerçek zamanlı izlenmesi, in vivo tavuk embriyosu koryo-allantoik membran (CAM) metastaz modeli ile birleştirildiğinde, tümör hücrelerini DNA'ya zarar veren kemoterapötiklere duyarlı hale getirme yetenekleri açısından yeni anti-kanser hedeflerini/ajanlarını değerlendirmek için kullanılır.

Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Klinik öncesi testlerden insan denemelerine geçiş yapan yeni ilaç hedeflerinin belirlenmesi bilimsel bir önceliktir. Bu amaçla, burada, gen tükenmesinin kanser hücre hattı sferoidleri üzerindeki etkisini incelemek için işlevsel bir genomik yaklaşımı tanımlıyoruz, bu da insan kanserlerini in vivo olarak daha uygun bir şekilde modelliyor.

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

BRCA1 mutasyonu olan kişilerin kansere yakalanma riski daha yüksektir, bu da BRCA1 varyantlarının işlevinin doğru bir şekilde değerlendirilmesini garanti eder. Burada, brca1 varyantlarının canlı hücrelerde hedeflenen C:G ila T:A dönüşümünü sağlayan CRISPR aracılı sitozin baz editörleri kullanılarak işlevsel olarak değerlendirilmesi için bir protokol açıkladık.

CRISPR Aracılı Temel Editörler kullanılarak BRCA1 varyantlarının fonksiyonel değerlendirmesi

Bu protokol, mikroRNA küme ağ analizi için düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gen düzenleme iş akışını tanımlayan yüksek verimli bir kümelenmiş ve tek bir deneyde 35 kb kadar büyük benzersiz miRNA kümesi üyesi delesyon kombinasyonları taşıyan genetiği değiştirilmiş hücre hatlarından oluşan bir panelin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

MicroRNA Küme Ağ Analizi için CRISPR Gen Düzenleme Aracı

Burada, yüksek, uzun vadeli, kararlı, hedefe yönelik susturma verimliliğine ve düşük genom çapında, hedef dışı aktiviteye sahip tasarlanmış transkripsiyonel baskılayıcıların (ETR'ler) in vitro seçimi için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, aday ETR'lerin başlangıçtaki karmaşık repertuarını, terapötik olarak ilgili ortamlarda daha fazla değerlendirme için uygun olan kısa bir listeye indirgemeye olanak tanır.

In Vitro Hedeflenen Epigenetik Susturma için Tasarlanmış Transkripsiyonel Baskılayıcıların Seçimi

Bu çalışma, melanom hücrelerinde uzun kodlamayan RNA'ları hedefleyen ikili bir CRISPRi sistemi sunmaktadır. Potansiyel terapötik stratejiler için kansere özgü lncRNA etkileşimlerini belirleyerek kombinatoryal gen yıkımı ve sentetik ölümcül taramayı mümkün kılar.

Kanser Hücrelerinde Kodlamayan RNA'lar Arasındaki Sentetik Ölümcül Etkileşimleri Hedeflemek için Çift CRISPR-Girişim Stratejisi

Keşfedin BRCA2 gen susturma yöntemini siRNA transfeksiyonu ve Western blot ile insan hücre hatlarında. Bu teknik, yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerin verimli tespiti için kanser biyolojisi araştırmalarında değerli bir araç sunar.

Susturulması

Daha fazla video keşfet