Susturulması

Bu prosedürün genel amacı, SIR A transfeksiyonu yoluyla B RCA iki ekspresyonunu susturmaktır. Bu işlem, öncelikle SIR a transfeksiyon reaktifi komplekslerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, %80 konfluens düzeyindeki hücre tek tabakasına komplekslerin damla damla eklenmesiyle ilk transfeksiyon aşaması uygulanır. Son olarak, daha yüksek bir SIR, A'ya transfeksiyon reaktifi oranı kullanılarak ikinci bir SIR a transfeksiyonu gerçekleştirilir.

Son olarak, hücre monotabakaları buz gibi soğuk PBS ile yıkanır ve hücreler dört derece Celsius'ta deterjan bazlı bir liziz tamponu ile lizize edilir. Nihayetinde, protein düzeyinde B RCA A iki susturulmasını göstermek için Western blotting analizi kullanılır. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerin yanı sıra tümör baskılayıcı B RCA iki gibi proteinlerin optimal tespitine ve etkili gen susturulmasına olanak tanımasıdır. Başlamak için, insan epitel hücre monotabakalarını nemlendirilmiş bir oda içerisinde 37 derece Celsius'ta ve %5 karbon dioksit ortamında büyüttükten sonra, büyüme ortamını uzaklaştırın ve hücreleri yıkamak için oda sıcaklığındaki PBS'yi kullanın.

Hücreleri plakadan ayırmak için iki mililitre %0,25 trypsin 0,53 milimolar EDTA solüsyonu ekleyin ve hücre tipine bağlı olarak üç ila beş dakika inkübe edin. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce, %10 FBS içeren iki mililitre komple büyüme ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin. Tüpleri sallantılı kova rotoruna yerleştirin ve 320 ila 330 Gs'de, dört derece Celsius'ta üç dakika santrifüjleyin.

Hücreleri saymak için bir Burker kamarası veya otomatik sayım sistemi kullanmadan önce, peletleri yeniden süspand etmek için beş mililitre antibiyotiksiz besiyeri kullanın. Ardından, altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna, iki mililitre antibiyotiksiz besiyeri içinde yaklaşık 0,5 ila 1 × 10⁶ hücre yerleştirin ve %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar 24 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, altı mikrolitre lipid bazlı siRNA spesifik transfeksiyon reaktifini 130 mikrolitre düşük serumlu besiyerinde seyrelterek ilk transfeksiyon aşamasına geçin.

10 µM S irna'nın üç µL'sini 130 µL düşük serumlu besiyerinde seyreltin. Seyreltilmiş irna'yı seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile birleştirin ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, hücrelerdeki besiyerini uzaklaştırın ve iki mL taze antibiyotiksiz besiyeri ekleyin.

37 °C'de ön ısıtma yapın. Ardından, altı kuyucuklu plaka içerisindeki hücrelerin her bir kuyucuğuna 250 µL siRNA transfeksiyon reaktifi kompleksleri ekleyin. Daha sonra hücreleri, %5 karbondioksit içeren, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edin.

24 saat sonra, 10 µM siRNA'nın beş µL'sini 130 µL indirgenmiş serumlu ortamda seyrelttirin ve gösterildiği üzere ikinci transfection turuna geçin. İkinci turda yüksek siRNA konsantrasyonu, B rca'nın yüksek verimlilikle susturulması için gereklidir.

İmmünoblotlama analizi için hücre lizatı hazırlamak amacıyla, analizden önce hücreleri 37 °C'de bir ila iki gün boyunca inkübe edin. Burada gösterilen tarife göre taze lizis tamponu hazırlayın. Hücrelerin üzerindeki medyumu uzaklaştırın ve hücreleri yıkamak için kuyuk başına 2 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin.

Ardından, plakadaki PBS'yi tamamen uzaklaştırın ve her bir kuyucuğa 200 µL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin. Lizis tamponunun homojen bir şekilde dağılması için plakayı hafifçe döndürün ve bir rotatör üzerinde 4 °C'de 15 dakika inkübe edin. Daha sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak.

Hücre lizatını buz üzerinde bir mikro santrifüj tüpüne toplayın, 17.900 Gs'de ve 4 °C'de 25 dakika boyunca santrifüjleyin ve immün blotting analizini gerçekleştirmek için süpernatanı toplayın. 50 ml 20x tris asetat SDS yürütme tamponunu 950 ml distile su ile seyrelterek yürütme tamponunu hazırlayın. Örneği şu şekilde hazırlayın.

15 µg toplam hücre lizatı ekleyin. Lityum SDS sülfat pH 8.4 içeren dört x örnek tamponundan 5 µL, 0.5 M DTT'den 2 µL ve toplam hacim 20 µL olacak şekilde liz tamponu ekleyin. Örnekleri 55 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edin.

b RCA iki proteini termo-hassas olduğu için bu sıcaklığın kullanılması kritik öneme sahiptir. Ardından, elektroforez hücresini üretici talimatlarına göre hazırlayın. Daha sonra, numuneleri 10 µL yüksek moleküler ağırlıklı yeniden boyanabilir protein standardı ile birlikte önceden dökülmüş bir jele yükleyin ve yaklaşık iki saat boyunca 120 volt değerinde çalıştırın.

Bu sırada, 50 mililitre 20 x transfer tamponu, 100 mililitre %100 metanol ve 850 mililitre su ile transfer tamponunu hazırlayın. PVDF membranı %100 metanol içinde beş dakika bekleterek aktifleştirin. Distile su ile durulayın ve en az beş dakika boyunca transfer tamponu içinde dengeleyin.

Transfer cihazının süngerlerini, kullanıma kadar 4 °C'de transfer tamponu içinde bekletin. 55 kilodalton mavi işaretleyici önceden dökülmüş jeli terk etmeden önce çalışmayı durdurun ve transfer tamponuna batırılmış üç süngerle başlayarak sandviçi oluşturun. Ardından, transfer tamponuyla doyurulmuş bir adet 3 mm kağıt ekleyin.

Ardından jeli, ardından aktive edilmiş PVDF membranı, bunu takiben tamponla ıslatılmış bir adet 3M kalite kağıdı ve son olarak üç adet ıslatılmış süngeri ekleyin. Yığını aparata yerleştirin ve proteinleri 350 miliamperde dört saat boyunca dört santigrat derecede veya 180 miliamperde dört santigrat derecede gece boyunca transfer edin. Transferden sonra, membranı yıkamak için TBS kullanın ve TBST ile %5 yağsız kuru süt ile bir saat boyunca bloklayın.

Ardından tamponu, 30 µL anti BCA two tavşan poliklonal antikoru içeren dokuz mililitre TBST süt tamponu ile değiştirin ve 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Membranı her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez TBST ile yıkadıktan sonra, 10 mililitre TBST süt tamponu içinde dilüye edilmiş 1 µL yaban otu peroksidaz konjuge anti tavşan sekonder antikor ile filtreyi bir saat boyunca inkübe edin. Membranı üç kez yıkadıktan sonra, üretici talimatlarını izleyerek KEMMA luminesans immünodeteksiyonu gerçekleştirin.

Brca2 susturulmasının özgüllüğünü doğrulamak için bantları yüksek çözünürlüklü ECL filmleri üzerinde görselleştirin. Daha önce belirtildiği gibi, burada gösterildiği üzere Brca2 siRNA'sı ile yan yana rastgele dizili (scrambled) bir siRNA kullanılmıştır; Brca2 susturulmasında yüksek verim elde etmek için yüksek bir siRNA/transfeksiyon oranıyla ikinci bir siRNA transfeksiyon turu gerçekleştirmek önemlidir.

Buradaki sonuçlar, hücre tipine bağlı olarak, düşük ve yüksek siRNA'nın transfeksiyon oranını kullanmak arasındaki knockdown verimliliği farkını göstermektedir. En yüksek gen susturma seviyesini elde etmek için gereken optimum minimum süre, örneğin ikinci siRNA transfeksiyon turundan sonra değişkenlik gösterebilir; bu şekildeki figürde gösterildiği üzere, NTHY tiroid hücreleri için 24 saat yeterliyken, PNT1A prostat hücrelerinde etkili BRCA2 knockdown için 48 saate kadar süre gerekmektedir. BRCA2 susturulması, ikinci transfeksiyon turundan sonra yedinci güne kadar oldukça stabildir. Daha önce belirtildiği gibi, hücre lizatlarının 55 °C üzerindeki bir sıcaklıkta denatüre edilmesi, BRCA2 proteininde %50'ye varan kayıpla sonuçlanmaktadır.

Bu deneyde, B RCA A iki susturulmuş PNT bir A hücrelerinin PARP inhibitörü rucaparibe olan hassasiyeti, ilaçla 24 saatlik bir işlemden sonra incelenmiştir. Kontrollerle karşılaştırıldığında, B RCA iki eksilmiş PNT bir A hücrelerinde hücre proliferasyonunda zamana bağlı bir azalma gözlemlenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, BRC iki'nin yanı sıra, uzun protein kodlayan genlerin bir CRNA ile nasıl susturulacağı ve protein ürünlerinin optimize edilmiş bir immün bloklama prosedürü aracılığıyla nasıl verimli bir şekilde tespit edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.

Bu yöntem, özellikle hücrelerde çok düşük düzeylerde eksprese edildikleri durumlarda, birçok diğer zorlu büyük proteine uygulanabilir.