Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme Coxiella burnetii Transposon Mutantlar

Bu prosedürün genel amacı, büyük ölçekte tanımlamaktır. COE faktörleri, konakçı hücrelere giriş, bakteriyel replikatif bir niş oluşumu ve kalıcılık dahil olmak üzere bulaşıcı döngünün temel adımlarında yer alır. Bu, önce mutajenez üzerinde transpoze yoluyla bir GF PT ko-mutant kütüphanesi oluşturularak gerçekleştirilir.

Daha sonra, konakçı hücreler izole edilen her mutant ile enfekte edilir. Daha sonra, her mutantın hücre içi replikasyonu, coxiella enfeksiyonuna en zararlı mutasyonları belirlemek için bir mikroplaka okuyucu kullanılarak gerçek zamanlı olarak takip edilir. Son olarak, coxiella ile enfekte olmuş hücreler otomatik mikroskopi ile analiz edilir.

Sonuç olarak, otomatik görüntü analizi, mutasyona uğramış her geni coxiella enfeksiyöz döngüsündeki varsayılan bir işlevle ilişkilendirmek için elde edilen her fenotipin morfolojik karakterizasyonuna izin verir. Bu yöntem, tüm hücre ile etkileşime girmek ve moleküler makinelerini kendi yararına ele geçirmek için gerekli olan belirli bir patojenin temel genlerinin büyük ölçekli tanımlanması gibi, konak patojen etkileşimleri alanındaki temel sorunların ele alınmasına yardımcı olabilir. COE kolonilerinin kaplanması ve izolasyonunun elde edilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.

Gerçekten de, COE, yumuşak ACCM iki aro'dan dikkatlice çıkarılması gereken çok küçük koloniler oluşturur. Bu yöntemin kokal laboratuvar enfeksiyonu hakkında nasıl bilgi sağlayabileceği. Salmonella, burel, mycobacterium vb. gibi diğer hücre içi patojenik bakterilere de uygulanabilir.

Yetkili coxiella'yı transpozon ve transpozaz kaplama plazmitleri ile metin protokolüne göre dönüştürdükten sonra, tek tek mutantları izole etmek için, 10 mililitre erimiş %0.5 aros'u 10 mililitre iki X accm ile karıştırarak alt aroları hazırlayın, ikisi mikrobiyal güvenlik kabininde veya MSC'de ve uygun antibiyotikleri ekleyin, hemen bir Petri kabına dökün ve 30 dakika boyunca üstü açık olarak soğumaya bırakın ve ardından 20 dakika havayla kurumaya bırakın. Üst torba arolarını hazırlamak için, 15 mililitrelik bir polistiren tüpte 1.25 mililitre iki x accm iki ile 0.75 mililitre su karıştırın. Uygun antibiyotikleri ekleyin ve 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra bir ila 100 mikrolitre bakteri kültürü ekleyin ve beş saniye boyunca girdap yapın. Daha sonra, 0,5 mililitre erimiş aros karışımı ekleyin ve hemen alt arosların üzerine dökün. Plakayı 20 dakika soğumaya bırakın.

Kapağı üstüne yerleştirin ve katılaşmaya yardımcı olmak için dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Daha sonra kapağı çıkarın ve altı ila yedi gün boyunca% 5 karbondioksit ve% 2,5 oksijen içeren 37 derece santigrat derece nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarmadan önce plakayı 20 dakika havayla kurutun. Koloniler tespit edilebilir hale geldiğinde, bir mililitrelik pipet ucunun ucunu keserek ve tek koloniler içeren tıkaçları izole etmek için kullanarak bunları toplayın.

Daha sonra bunları 1.5 mililitre accm iki içeren 24 oyuklu bir plakanın kuyularına aktarın. Standart bir eğri hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, oyuk başına beş mikrolitre% 10 Triton X 100 dağıtarak her bir bakteri süspansiyonunu ölçün. Siyah duvarlı ve tabanlı 96 oyuklu bir mikroplakada, her oyuğa 50 mikrolitre bakteri süspansiyonu ekleyin ve 10 dakika boyunca bir plaka çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

Oda sıcaklığında, çift sarmallı DNA kantitasyon reaktifini bir ila 200 seyreltmek için bir XTE tamponu kullanın ve her numuneye 55 mikrolitre seyreltilmiş reaktif ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında iki ila beş dakika inkübe etmeden önce iyice karıştırılmış bir plaka çalkalayıcı ile 96 oyuklu mikroplakada, bir floresan mikroplaka okuyucu ve standart floresein dalga boyları için filtreler kullanarak numunelerin floresansını ölçün. Bakteriyel DNA konsantrasyon grafiğini elde etmek için, daha önce hazırlanmış standart eğrideki floresan okumaları, bakteri konsantrasyonunu elde etmek için DNA konsantrasyonunu coxiella genomunun kütlesine bölün.

Metin protokolüne göre tek primer koloni PCR ve DNA dizilimi gerçekleştirildikten sonra sonuçları mililitre başına genom eşdeğeri olarak ifade edin. Dizi analiz yazılımını kullanarak, Coxiella Burnett I 4 93 NM'nin tam açıklamalı genomunu referansa hizalama işleviyle yükleyin, dizi sonuçlarını blast N kullanarak yükleyin ve hizalayın ve transpozisyon bölgesini belirleyin. Metin protokolüne göre, RPMI ortamında mililitre başına 10 ila beşinci hücreden oluşan bir Vero hücre süspansiyonu hazırladıktan sonra, düz, şeffaf bir tabana sahip siyah 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre süspansiyon dağıtın, plakayı 400 kez G'de santrifüjleyin ve beş dakika boyunca yer açın ve gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Ertesi gün, coxiella mutantlarını içeren oda sıcaklığında 96 oyuklu plakaya düşer ve fenol kırmızısı içermeyen 300 mikrolitre RPMI'de 150 mikrolitre bakteri süspansiyonu seyreltilir ve FBS derin bir kuyu 96 oyuklu plakada, ortamı Vero hücrelerinden çıkarın ve seyreltilmiş coxiella mutantlarının oyuğu başına 100 mikrolitre dağıtın. A'yı negatif kontrol olarak kullanın ve kuyu a'yı iki ve üç'ü pozitif kontroller olarak kullanın, aerosol geçirmez bir santrifüj plaka tutucu kullanarak, plakayı 400 kez G'de ve oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, plakayı iki saat boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, bakteri içeren ortamı, bir floresan mikroplaka okuyucu ve floresein filtreleri ile taze tam RPMI ortamının kuyusu başına 100 mikrolitre ile değiştirin.

Enfeksiyondan sonraki yedinci günde, ortamı plakadan çıkarın ve bir ila 1000 hücre geçirgen floresan boya seyreltmesi içeren taze tam ortam kuyusu başına 50 mikrolitre ile değiştirin. İnkübasyondan sonra hücreleri 30 ila 60 dakika inkübe edin, ortamı PBS inkübatında 30 dakika oda sıcaklığında inkübe etmiş% 4 PFA'lık kuyu başına 50 mikrolitre ile değiştirin. Ardından, kuyuları üç kez yıkamak için PBS'yi kullanmadan önce PFA içeren tamponu çıkarın Son yıkamayı çıkardıktan sonra, her bir oyuğa 50 mikrolitre bloke edici solüsyon dağıtın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra blokaj solüsyonunu oyuk başına 40 mikrolitre, taze bir bloke edici solüsyon ve bir ila 500 anti lamba bir antikor seyreltme ile değiştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ettikten sonra, çözeltiyi çıkarın ve PBS oyuğu başına 100 mikrolitre uygulayarak kuyuları beş kez yıkamak için bir plaka yıkayıcı kullanın. Daha sonra, uygun floresan ikincil antikoru içeren ve mililitre başına beş mikrogramda 3, 3, 2, 5, 8 kancalı bloke edici çözelti başına 40 mikrolitre ekleyin.

Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Numuneleri beş kez yıkayın ve kurumasını önlemek için son PBS yıkamasını kuyucuklarda bırakın. Görüntü elde etmek için, 20 x objektif ve 3 4 88 5 55 ve altı adet 15 nanometre kanal ile donatılmış bir epi floresan otomatik mikroskop kullanın.

Örnek başına en az 5.000 hücre görüntülemek için kuyu başına 21 bağımsız alan elde edin. Ana hücre çekirdeği kanalını referans olarak kullanarak otomatik odaklama uygulayın. Son olarak, elde edilen görüntülerden bir dizi ilgili özelliği tahmin etmek için otomatik görüntü analizini kullanın.

Bu şekil, mutantların yaşayabilirliğini değerlendiren Genler ve büyüme eğrilerinde 16 noktalı ICM Coxe L'de mutantlar üzerinde 38 transpozeyi göstermektedir. Burada. Epitel hücreleri ile inkübe edilen coxiella mutantları için hücre içi büyüme eğrileri, coxiella genomundaki insersiyonlarda transpoze ile ilişkili fenotiplerin kantitatif analizini sağlar. Bu şekilde, konak hücre çekirdeklerini, hücre konturlarını, lizozomları ve coxiella kolonilerini tanımlamak ve karakterize etmek için otomatik görüntü alımı gerçekleştirildi.

Coxiella kolonilerinin hücreler ve lizozomlarla ilişkilendirilmesi, koxiella içeren vakuollerin morfolojik analizine izin verir. Coxiella kolonilerinin konak hücre konturları ile ilişkilendirilmesi, enfekte hücrelerin morfolojik analizine izin verir. Son olarak, dört kanal birleştirilir.

Coxiella kolonilerinin ortalama alanı, coxiella'nın hücre içi replikasyonunu ve/veya bakterilerin konakçı hücreleri istila etme kapasitesini etkileyen mutasyonları tanımlamak için hücre başına koloni sayısına karşı çizilir. Mutantlar üç kümede gözlendi: coxiella'nın hücre içi büyümesini etkileyen mutasyonlar, hücrelerde coxiella içselleşmesi ve önemli olmayan fenotipler. Burada, coxiella kolonilerinin ortalama alanı, gelişiminden sonra coxiella'ya sitotoksisite veren mutasyonları tanımlamak için enfeksiyondan kurtulan konakçı hücrelerin sayısına karşı çizilir.

Bu teknik, bakteriyel enfeksiyonlar alanındaki araştırmacıların konak patojen etkileşimlerini büyük ölçekte keşfetmelerinin yolunu açtı ve bulaşıcı hastalıklara karşı yeni tedavilerin geliştirilmesi için konakçı ve bakteri hedeflerini belirledi.