Eşzamanlı Ex vivo Fonksiyonel Test tarafından In vivo Elektroretinogram Sistemi

Bu prosedürün genel amacı, bir ex vivo adaptör ile birlikte ticari bir in vivo, elektroretinogram veya ERG sistemi kullanarak izole edilmiş bir fare retinasından alınan hücrelerin işlevini değerlendirmektir. Bu, önce bir farenin her iki gözünden retinaların kesilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, retinanın fotoreseptör tarafını yukarı bakacak şekilde bir numune tutucuya monte etmektir.

Daha sonra, numune tutucu in vivo ERG sisteminde bir ısıtma plakasına yerleştirilir ve yerçekimi kontrollü perfüzyona bağlanır. Son adım, numune tutucunun elektrotlarını bir amplifikatöre bağlamak ve ERG yanıtları elde etmek için retinaları ışıkla uyarmaktır. Sonuç olarak, ex vivo ERG, çubuk ve koni aracılı sinyal yollarının farmakoloji ve özel ışık stimülasyon protokolleri kullanılarak nasıl diseke edilebileceğini göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin in vivo, ERG'ler veya tek hücreli kayıtlar gibi diğer mevcut yöntemlere göre ana avantajı, daha yüksek sinyal-gürültü oranı, daha uzun ve daha kararlı kayıtlar ve ayrıca kolay ve kantitatif farmakolojik manipülasyonlar için olanak sağlamasıdır. Ek olarak, bu yöntem, primat ve insan donör retinalarında retina hastalıklarını tedavi etmek için tasarlanmış ilaçların etkinliğini ve güvenliğini taramak için kullanılabilir En az bir gün önceden, kubbelerin üstüne biraz siyah gri filtre kağıdı yapıştırarak numune tutucunun alt kısmını değiştirin. Kubbelerin kenarları boyunca iki bileşenli beş dakikalık epoksi kullanın ve gerekirse bir diseksiyon mikroskobu kullanın Yapıştırıcı kuruduktan sonra filtre kağıdını kubbeye düz bir şekilde bastırın.

Yaklaşık bir aylık kayıt için iyi olacak. Ardından kağıdı çıkarın ve kubbeyi %70 etanol ile temizleyin. Şimdi önce elektrodu hazırlamak için elektrot kanallarını elektrot solüsyonu ile doldurun.

Hava kabarcıkları sokmaktan kaçınmaya çalışın. Ardından pelet elektrotlarını elektrot kanallarına vidalayın. Numune tutucunun üst ve alt parçalarını dört vidayla bağlayın ve perfüzyon hatlarını elektrot solüsyonu ile doldurun.

Ardından, elektrot çiftlerinin uçları arasındaki direnci ve voltajı ölçün. Direnç 100 kilo ohm'un altında ve voltaj 10 milivoltun altında olmalıdır. Kanallar kabarcıksızsa ve elektrotlar iyi durumdaysa, numune perfüzyonu için 400 ila 700 mililitre perfüzyon ortamını bir cam şişeye dökün.

Ayrıca, diseksiyon için 300 mililitre dökün ve buzdolabında saklayın. Ardından perfüzyon tüpünü ısı eşanjörü bloğundan geçirin ve önceden ısıtılmış bloğu ısıtma plakasına yerleştirin. Şimdi şişeyi bir gaz girişi ve bir perfüzyon tüpü girişi olan bir kapakla kaplar.

Gaz girişi bir hava taşına bağlanmalıdır. Önceden ısıtılmış şişeyi, perfüzyon ortamının 37 santigrat derecede tutulacağı yere koyun. Ardından, bir ocus bilim sisteminde yerçekimi güdümlü akışı başlatmak için perfüzyon hatlarını perfüzyon ortamıyla doldurarak astarlayın.

Gürültüyü en aza indirmek için şişeyi Faraday kafesinin içine yerleştirin ve numune tutucudan uzun perfüzyon çıkış hatları kullanın. Numune tutucu ve perfüzyon şişesi seviyesinin oldukça altına yerleştirilmiş olan bu çıkış hatlarını korur ve kalkanı faraday kafesi aracılığıyla amplifikatörün toprağına bağlar. Elektromanyetik gürültünün ERG sinyaline bağlanmasını önlemek için, sıcaklık probunu ısıtma aşamasına takın.

Şimdi regülatörleri kullanarak, çözelti akışını dakikada üç ila beş mililitreye ayarlayın. Son olarak, gerekirse, çözeltiye araba ve gaz ekleyin ve regülatörü hava taşından sabit bir kabarcık akışı için ayarlayın. Büyük bir Petri kabına yaklaşık 200 mililitre soğuk perfüzyon solüsyonu dökerek başlayın, böylece numune tutucunun tüm alt kısmı tamamen daldırılabilir.

12, 12 saatlik bir karanlık ışık döngüsü altında yetiştirilen bir hayvana ötenazi yapın ve ardından kayıtlardan altı ila 12 saat önce karanlığa uyarlanın. Aşağıdaki prosedürlerin tümü loş kırmızı veya kızılötesi ışık altında gerçekleştirilmelidir. Her bir gözü izole ettikten sonra, onları göz ortamına yerleştirin.

Ardından bir gözünüzü kağıdın üzerindeki küçük bir filtre kağıdına aktarın. Cımbızla kavrayın ve yarıktan aura serrata ile yaklaşık aynı seviyede bir yarık açın. Kornea ve lensi çıkarmak için aura serrata boyunca veya ekvatora daha yakın bir yerde kesin.

Daha sonra korneayı ve lens uçlarını çıkarın ve göz kabını tekrar soğuk ortama aktarın. Aynı işlemi diğer gözle de tekrarlayın. Şimdi bir göz kabı ile çalışarak, yukarıdan optik sinire doğru küçük bir kesi yapın.

Makası retina ve sklera arasında tutun, böylece retina mümkün olduğunca sağlam kalır. Daha sonra, iki cımbız kullanarak kesiğin her iki tarafındaki sklerayı kavrayın ve retinayı ayırmak için dokuyu ayırın. Retinayı izole etmek için, optik siniri kesin ve retinayı distal yüzeyine minimum miktarda temas ile çıkarın.

Şimdi, izole edilmiş retinaları numune tutucunun kubbelerine monte edin. İlk olarak, numune tutucunun alt kısmını, diseke retinalarla birlikte petri kabına daldırın. Sonraki slayt.

Retina fotoreseptörü veya dışbükey tarafı kubbe üzerinde yukarı doğru. Ardından, retina filtre kağıdına yapışacak şekilde numune tutucuyu yavaşça kaldırın. Daha sonra diğer retina için işlemi tekrarlayın.

Şimdi karışma gürültüsünü ve sinyal şöntünü önlemek için tutucu plakayı dikkatlice kurulayın. Tutucuyu kuruttuktan sonra, üst kısmı vidalayın ve perfüzyon kanallarını bir iğne kullanarak bir şırıngadan perfüzyon solüsyonu ile doldurun. Numune tutucuyu ısı değişim bloğunun yanına yerleştirin.

Ardından giriş ve çıkış perfüzyon hatlarını bağlayın. Elektrotları ERG amplifikatörüne bağlayarak ve stimülatör kontrol ünitesini numune tutucuya takarak kurulumu tamamlayın. Bir adaptör kullanma Büyük ve yeniden kullanılabilir yanıtlar elde etmek için, retinaların dikkatli bir şekilde diseksiyonu ve montajı yapmak ve ayrıca veri toplamadan önce retinaların üzerinde stabil ve kabarcıksız perfüzyonu sürdürmek önemlidir.

10 ila 20 dakika bekleyin, böylece retina sıcaklığı ve fonksiyonu stabilize eder, flaş tepkileri, farklı standart profüzyon solüsyonları kullanılarak karanlığa uyarlanmış vahşi tip C 57 siyah altı retinadan kaydedildi. Tepki dalga biçimleri ve kinetiği, ames ortamında ve kilit ortamında benzer göründü. Rod fotoreseptörlerinin duyarlılığı da benzerdi.

Öte yandan, bikarbonat veya karbojen tepkisi olmayan yığın tamponlu zil çözeltisinde, genlikler önemli ölçüde daha küçüktü. BWA stabilitesi de sık sık yığının zil sesinde tehlikeye atıldı. 40 mikromolar A PB eklemek, pozitif B dalgasını verimli bir şekilde uzaklaştırdı.

Bu, Mueller hücre aktivitesine atfedilen büyük, yavaş bir negatif dalga ortaya çıkardı ve 100 mikromolar baryum kaldırıldı. Bu bileşen, ex vivo ERG sinyalinin fotoreseptör yanıtını ortaya çıkarır. Bu yöntem, insan retinaları da dahil olmak üzere memelilerde retina sinyalizasyonunun moleküler mekanizmaları ve kör edici hastalıklar hakkındaki soruları yanıtlamak için farmakoloji ve genetik gibi diğer araçlarla birleştirilebilir.