Name: Malarya Protein Biyomarker Histidin Zengin Protein-II Tespiti için İridyum (III) Lüminesans Probe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Öğrenin, fosforesan iridyum probu kullanarak malarya biyobelirteci histidin zengin protein-II'yi nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, hızlı kinetik ve fotobozunmaya karşı dayanıklılık sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma için destek, Bill ve Melinda Gates Vakfı tarafından sağlanmıştır. Küresel Sağlıkta Büyük Zorluklar: Bakım Noktasında Birden Fazla Durumun ve Patojenin Değerlendirilmesine İzin Veren Teknolojiler Geliştirin. K.M.D. bir NSF Lisansüstü Araştırma Bursu (2012095464) tarafından desteklenmiştir.

1. iridyum Synthesis (III) kompleksi <ol><li> [2, -Cl Ir (polipirol)] 2 ve 53.6 mg (50 umol) tartılır ve metilen klorür, 5 ml içinde çözülür. Bir karıştırma çubuğu ile donatılmış 50 ml&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi, bu solüsyonu ekleyin. </li><li> AgOTf 26.2 mg (100 umol) tartılır ve 5 ml metanol içinde çözülür. </li><li> Çözündürüldü için AgOTf [Ir (polipirol) 2, -Cl] 2 çözeltisi ilave edin ve 1 saat karışması sağlandı. Not: Krem renkli bulamaç, sonuçlanmalıdır. </li><li> 1 saat sonra, bir 25 x 95 mm dirhemlik bir ampule silika jel içinden bulamaç filtre edilir ve döner bir buharlaştırıcı (5-10 dakika) kullanılarak geri kalan çözücü buharlaştırılır. </li><li> Çözücünün çoğu çıkarıldıktan sonra, yağlı bir tortu, san bir şişede kalmasını kontrol edin. Bu kalıntıya, ürün yeniden çözülür ve sarı bir katı ürün elde etmek üzere 1-2 gün liyofilize metanolün 1 ml. </li><li> &lt;H Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + ürünü (IR1) karakterizesup&gt; 1 NMR ESI UV-Vis (CDCI3 içinde), daha önce tarif edildiği gibi. 23 </li></ol> Çeşitli Amino Asitler ile IR1 2. etkileşimler <ol><li> Metanol IR1 bir 2 mM solüsyonu (MW 537,10 g / Mol) hazırlayın. Girdap, katının tam olarak çözünmesini sağlamak için. </li><li> HEPES, aşağıdaki amino asit ve biyomoleküllerin 100 uM çözeltiler His, İle, Lys, Ser, Val deneyin tuzlu su (HBS, 100 mM HEPES, 137 mM NaCI, pH 7.4), Ala, Asp, Cys, tamponlu hazırlayın. </li><li> Siyah 96 oyuklu bir plakaya her bir amino asit, 100 ul pipet. Bir boş olarak hizmet etmek üzere plakaya HBS&#39;de 100 ul ekle. </li><li> Her bir örnek için, 2 mM IR1 çözeltinin 2.5 ul ilave edin ve 10 dakika boyunca, bir plaka karıştırıcısı üzerinde plaka sallayın. </li><li> 10 dakika sonra, 96 oyuklu bir plaka okuyucusu (365 ex / 400-700 em) kullanarak numune emisyon spektrumlarına sahip olur. <ol><li> Enstrüman plaka koyun ve yeni bir deneme kurmak için plaka okuyucu yazılımını açın. </li><li> Yeni exp ayarlaeriment 365 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve en üst pozisyonda optik ile 9 nm bir yarık genişliğine sahip bir floresan tarama okuyun. </li><li> 5 nm&#39;lik bir adım büyüklüğü 300-700 nm emisyon okuyun. </li><li> Veri analizi için veri verir. </li></ol></li><li> Berrak bir 96-çukurlu plaka ve görüntü UV transilluminator kullanılarak emisyon örnekleri aktarın. </li></ol> BNT-II ile IR1 3. Titrasyon <ol><li> HBS&#39;de BNT-II (MW 8233,6 g / mol) &#39;in bir 1 mM stok solüsyonu olarak metanol içinde IR1 bir 2 mM çözelti hazırlayın. </li><li> Stok solüsyonu, HBS 100 mcM BNT-II 1 ml hazırlamak. Numune karışık olduğundan emin olmak için ependorf tüp Vortex. </li><li> Seri olarak 1.56 uM BNT-II &#39;nin nihai bir konsantrasyona kadar HBS&#39;de yarı yarıya 100 uM BNT-II seyreltin. </li><li> HBS 96 oyuklu bir plakanın kuyularına, boş olarak hizmet veren, üç kopya halinde, her seyreltme oranından 100 ul ekle. Her numune için, 2 mM IR1 2.5 ul ekleyin. </li><li> Shbir plaka karıştırıcısı üzerinde 10 dakika boyunca plaka ücadele. </li><li> Çalkalamadan sonra, 96 oyuklu bir plaka okuyucu kullanılarak 510 nm&#39;de (365 nm&#39;de uyanm) emisyon yoğunluğunun okuyun. <ol><li> Enstrüman plaka koyun ve yeni bir deneme kurmak için plaka okuyucu yazılımını açın. </li><li> 510 nm, 365 nm ve emisyon dalga boyunda bir eksitasyon dalga boyunda bir flüoresan bitiş noktası okumak için yeni bir deney seti. Üst pozisyonda optik, 9nm hem dalga boyları için yarık genişliğini ayarlayın. </li><li> Plaka okuma ve analiz için veri ihracat. </li></ol></li><li> Berrak bir 96-çukurlu plaka ve görüntü UV transilluminator kullanarak titrasyon örnekleri aktarın. </li></ol> Biolayer İnterferometre kullanma IR1 / BNT-II Sistemi 4. Gerçek zamanlı Kinetik Analizi <ol><li> Kinetik tampon 200 ul ilave et; siyah 96 oyuklu plakanın birinci sütunda 8 oyuklara (KB 1x Fosfat% 0.02 Tween-20 ile tamponlanmış tuzlu su) ve plastik sensör içine plaka eklemetutucu. Dikkatli bir şekilde ipuçları tampon kuyu içerisinde süspanse edilir, öyle ki plastik tutucu ilk sütun 8, Ni (II) NTA biyosensörler aktarın. Interferometri enstrümanın sol tarafında plastik tutucu yerleştirin. </li><li> KB BNT-II &#39;nin, bir 0.5 uM çözeltisi 2 ml hazırlayın. </li><li> KB IR1 bir 10 uM solüsyon 500 ul hazırlayın ve seri KB cinsinden 0.156 mcM aşağı yarıya sulandırmak. </li><li> Yeni bir siyah 96 oyuklu bir plaka, bir pipet kolon A ve C sınırlarındaki 8 çukurlara KB 200 ul </li><li> Aynı plaka, sütun B&#39;de kuyulara 0,5 um BNT-II çözeltisi pipet 200 ul </li><li> Pipet kuyu D1 boş olarak KB ile başlayan kolon D içine IR1 her seyreltme, 200 ul. Kuyu sütununda aşağı aralıklı toparlanma seviye 1 konsantrasyonunda artış böylece dilüsyonları ekleyin. </li><li> Ön ıslatma sensörleri içeren plaka sağ cihazda bu plaka koyun. </li><li> Biolayer interferometri yazılımında, temel Kinet kurmakplaka, tahlil ve sensör ipuçları tanımlayarak ic deneyi. <ol><li> Plaka tanımlamak için, ekrandaki bir sütun seçin sağ tıklatın ve kuyular için uygun bir tanım seçin. Sütun D. sütun B sütunları A ve C için &quot;Buffer&quot;, &quot;Load&quot; ve &quot;Sample&quot; seçiniz </li><li> (&quot;Add&quot; düğmesine tıklayın) aşağıdaki adımları ekleyerek sonraki sekmesinde tahlil tanımlayın: Dengeleme (Özel), 60 saniye; Yükleniyor, 120 sn; Baseline, 60 saniye; Dernek, 120 sn; ve ayrışma, 300 sn. Dengelenme adımı seçin ve (B sütununu), Temel (sütun C), Derneği (kolon D) ve Ayrışma (sütun C) Loading sütun A. tekrarlayın çift tıklayın. Ni (II) NTA sensörleri seçin. </li><li> Bir sonraki sekmeye geçmek ve sensörler plastik sensör tutucu A sütununda olduğunu onaylayın. </li><li> Bir dosya adı eklemek, deney doğru özetlenen Onayla &quot;gecikme deneyi&quot; işaretli olduğundan emin olun ve basın &quot;gidin.&quot; NOT: kinetik deney özetlenen sonra programlandığı gibi enstrümanın otomatik doğası nedeniyle, adımlar meydana gelecektir. </li></ol></li><li> Kinetik çalışma tamamlandıktan sonra, verilen işleme yazılımı verileri işlemek. <ol><li> Soldaki panelinin alt kısmının ilgi dosya ile klasörü çift tıklatın. Ardından, panelin üst kısmında &quot;Kinetik&quot; başlığı altında gelen klasörü çift tıklatın. İşleme sekmesine geçin. </li><li> Sensör seçimi ekranını açmak için soldaki Çıkarma kutusunu işaretleyin. Sağ de A4 tıklayın ve Referans Well iyi türünü değiştirin. </li><li> Y ekseni hizalama yanındaki kutuyu işaretleyin ve seçilen adım Baseline olduğundan emin olun. Başlangıçta son beş saniye (yaklaşık 55-60 sn) olmak üzere zaman aralığını belirtin. </li><li> Inter-adım Düzeltme için kutuyu işaretleyin ve Ayrışma için Hizala&#39;yı seçin. Savitzky-Golay Filtreleme kutusunun işaretli ve basın &quot;Süreç Verileri emin olun! ̶1 &#39;dir; </li><li> Analiz sekmesine geçin. &quot;Dernek ve Ayrılma&quot; analiz adımlar için ve Model 1 olduğu seçim olduğundan emin olun: 1. Yerel Tam uyum seçiniz ve basın &quot;Fit Curves!&quot; </li><li> Tablodaki tüm eğrileri vurgulayın ve doğru bir renk tüm eğrileri ayarlamak için tıklatın. Sonraki, renk ve Rmax Sensör Unlinked göre gruplandırılmış Global (Full) uyum seçin. Basın &quot;Fit Curves!&quot; Küresel kinetik verileri elde etmek. </li></ol></li></ol> 5. On-boncuk IR1 ile BNT-II Algılama ve rcHRP-II <ol><li> 1 mi Tween ile HBS&#39;de BNT-II ve rcHRP-II &#39;nin bir 1 uM her bir çözelti hazırlayın (HBST; HBS% 0.025 Tween 20). </li><li> Seri olarak 15.6 nM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar HBST yarı yarıya her protein seyreltin. </li><li> Pipet yüksek konsantrasyon aşağı sütunu düşük sırayla seyreltileri ile beyaz bir 96-çukurlu plaka içinde üç kopya halinde her seyreltme oranından 100 ul,,,. </li><li> Pipet 50 um Ni 10 ul (IIHer bir seyreltme içine) NTA manyetik agaroz parçacıklar. <ol><li> Parçacıklar askıya kalmak emin olmak için her pipetleme sonra manyetik parçacıklar içeren ependorf tüp Vortex. </li></ol></li><li> 15 dakika parçacıklarla örnekleri inkübe için, bir plaka karıştırıcısı üzerinde plaka koyun. </li><li> Bu inkübasyon süresinden sonra, 96 oyuklu bir plaka mıknatıs üzerinde plaka yerleştirmek ve parçacıklar çözeltinin dışarı çekmek için 30 saniye bekle. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, özgün örnek çekin ve atık olarak atın. Mıknatıstan plakasını sökün. </li><li> Her bir kuyunun çok kanallı pipet kullanarak HBST 200 ul ekleyin. Manyetik parçacıkların yıkamak için yukarı ve aşağı birkaç kez tampon Pompa. </li><li> Geri mıknatıs üzerine plaka koyun ve parçacıklar çözümün çekin için 30 saniye bekleyin. </li><li> Çok kanallı pipet kullanarak, tampon 200 ul koparmak ve atık olarak atın. Mıknatıstan plakasını sökün. </li><li> Yineleyin 5.8 Throug adımlarıH 5.10, iki katı parçacıkların üç yıkamadan tamamlayın. </li><li> 2 mM IR1 2.5 ul ve ardından her bir oyuğa içeren manyetik partiküllere HBST 100 ul ekle. </li><li> 1 saat boyunca, bir plaka karıştırıcısı üzerinde IR1 ile parçacıklar inkübe edin. </li><li> 1 saat sonra, 96-çukurlu bir plaka okuyucusu kullanılarak 510 nm&#39;de (365 nm&#39;de uyanm) emisyon yoğunluğunun okuyun. <ol><li> Enstrüman plaka koyun ve yeni bir deneme kurmak için plaka okuyucu yazılımını açın. </li><li> 510 nm, 365 nm ve emisyon dalga boyunda bir eksitasyon dalga boyunda bir flüoresan bitiş noktası okumak için yeni bir deney seti. Üst pozisyonda optik, 9 nm her iki dalga boyları için yarık genişliğini ayarlayın. </li><li> Plaka okuma ve analiz için veri ihracat. </li></ol></li><li> Berrak bir 96-çukurlu plaka ve görüntü UV transilluminator kullanarak titrasyon örnekleri aktarın. </li></ol>

<ol><li>Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+of+Care+Diagnostics%3A+Status+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Point of Care Diagnostics: Status and Future.</a> Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).</li>
<li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+tracking+fluorescence+microscopy+in+mitochondria+reveals+highly+dynamic+but+confined+movement+of+Tom40%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40.</a> Scientific Reports. 1, (2011).</li>
<li>Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Biosensors+and+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">DNA Biosensors and Microarrays.</a> Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).</li>
<li>Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Lighting+up+cells%3A+labelling+proteins+with+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores.</a> Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+protein+detection+using+enzyme-labeled+gold+nanoparticle+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes.</a> Analyst. 135, 327-331 (2010).</li>
<li>Almeida, M., Carabineiro, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+nanogold+in+human+tropical+diseases%3A+research%2C+detection+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gold+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy.</a> Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).</li>
<li>Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Trends+in+the+Use+of+Transition+Metal%E2%80%93Ligand+Complexes+for+Applications+in+Electroluminescent+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">New Trends in the Use of Transition Metal–Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices.</a> Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+centered+ligand+field+excited+states%3A+Their+roles+in+the+design+and+performance+of+transition+metal+based+photochemical+molecular+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Coordination+Chemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices.</a> Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).</li>
<li>Lamansky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Phosphorescent+Bis-Cyclometalated+Iridium+Complexes%3A+Synthesis%2C+Photophysical+Characterization%2C+and+Use+in+Organic+Light+Emitting+Diodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).</li>
<li>Ho, M. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+structure+and+oxygen-sensing+properties+of+Iridium%28iii%29-containing+coordination+polymers+with+different+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations.</a> Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).</li>
<li>McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclometalated+Iridium%28III%29+Aquo+Complexes%3A+Efficient+and+Tunable+Catalysts+for+the+Homogeneous+Oxidation+of+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).</li>
<li>Ma, D. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Selective+Luminescent+Switch-On+Probe+for+Histidine%2FHistidine-Rich+Proteins+and+Its+Application+in+Protein+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).</li>
<li>Ma, D. -L., He, H. -Z., Leung, K. -H., Chan, D. S. -H., Leung, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Luminescent+Transition-Metal+Complexes+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).</li>
<li>Leung, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Metal-Based+Inhibitor+of+Tumor+Necrosis+Factor-%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-α.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).</li>
<li>You, Y., Nam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photofunctional+triplet+excited+states+of+cyclometalated+Ir%28iii%29+complexes%3A+beyond+electroluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence.</a> Chemical Society Reviews. 41 (21), 7061-7084 (2012).</li>
<li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+Iridium%28III%29+Complexes+with+Tunable+Emission+Color+as+Phosphorescent+Dyes+for+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Organometallics%22%5BJournal%5D)">Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging.</a> Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nonemissive+Iridium%28III%29+Complex+That+Specifically+Lights-Up+the+Nuclei+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).</li>
<li>Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histidine-rich+glycoprotein%3A+A+novel+adaptor+protein+in+plasma+that+modulates+the+immune%2C+vascular+and+coagulation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%2C+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems.</a> Immunology, & Cell Biology. 83, 106-118 (2005).</li>
<li>Panton, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+partial+characterization+of+an+unusual+protein+of+Plasmodium+falciparum%3A+histidine-rich+protein+II%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).</li>
<li>Schneider, E. L., Marletta, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+Binding+to+the+Histidine-Rich+Protein+II+from+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum.</a> Biochemistry. 44, 979-986 (2004).</li>
<li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropical+infectious+diseases%3A+Diagnostics+for+the+Developing+World%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World.</a> Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).</li>
<li>Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-Antigenic+Peptides+of+Histidine-Rich+Protein+II+of+Plasmodium+falciparum%3A+Dendrimeric+Biomineralization+Templates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates.</a> Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).</li>
<li>Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterizations+of+cyclometalated+iridium%28III%29+solvento+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes.</a> Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).</li>
<li>Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Resource+Method+for+Extracting+the+Malarial+Biomarker+Histidine-Rich+Protein+II+To+Enhance+Diagnostic+Test+Performance%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance.</a> Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).</li>
<li>Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drivers+of+biodiagnostic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drivers of biodiagnostic development.</a> Nature. 462, 461-464 (2009).</li>
<li>Li, M. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+electrochemiluminescence+of+a+new+water-soluble+iridium%28iii%29+complex+for+determination+of+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics.</a> Analyst. 136, 205-210 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Mikropartikül tabanlı tanılama araçları modern tanı teknolojinin ön plana gelmek gibi, doğrudan parçacığın yüzeyi üzerinde hedef biyomoleküllerin tespiti önemli bir avantajdır. ELISA ve PCR gibi geleneksel moleküler tanı yöntemleri, şöyle ki algılama 25 arasında çok düşük limitler elde edilebilir, avantajlıdır. Ancak, bu deneyler geniş reaktifler ve uzun protokoller gerektirir. Bu deney süresi ve reaktif koşulları (Şekil 5) olmadan, ELISA tipi bir sandviç etkileşimleri taklit etmek için tasarlanmıştır. Tipik bir ELISA için antikorların maliyeti numune başına $ 0,20-0,30 ise ek olarak, numune başına IR1 prob maliyeti, peni civarında olduğu tahmin edilmiştir. Yukarıda tarif edilen yöntemler, sıtma belirteç saptanması için bir cyclometalated iridyum prob dayandığı bu sondanın, diğer algılama yöntemlerinin ortak arıza modu (örn. Fluorofor quenchi duyarlı olmayacaktırNG ve antikor / enzim parçalanma). Histidin metal bağlanma özellikleri açısından benzersizdir. özetlenen işleme metal ihtiva eden kompleksleri ile, tipik bir ELISA sandviç antikorları değiştirerek bu fenomenin yararlanır. Ni (II), NTA, parçacığın yüzeyi üzerinde rcHRP-II &#39;yi yakalar ve IR1 proteinin varlığını işaret eder. tahlilde en kritik adım manyetik partiküller numune ve sonda ile karıştırmak için izin veriyor. 96 oyuklu bir plaka ELISA, biyomoleküllerin ve reaktifler de alt kısmının, iki boyutlu bir yüzey ile dengeye ulaşır. Manyetik parçacıklar nedeniyle mevcut bağlanma siteleri azaltacaktır onların yoğun demir-oksit çekirdek, çözümün dışında yerleşmek eğilimi var. Bu nedenle, parçacıklar maksimum bağlanma sağlamak için deney süresince karıştırılmalıdır. Hastalığın teşhis için bir ayıraç tasarlarken, akılda hasta numunesinin formu gibi bir belirteç fizyolojik konsantrasyon tutmalıdır. Içinmalarya, hastanın kanında pf HRP-II konsantrasyonu, yüksek nanomolar düşük pikomolardan değişebilir. Bu deney, enfeksiyonun daha yüksek seviyeleri için klinik olarak anlamlı iken, tespit limiti, düşük pikomolar HRP-II pf sirküle olan asemptomatik hastaların tespit etmek için geliştirilmiş olması gerekiyor. Yukarıda ana hatları çizilen yöntemler, in &quot;Çalıştırma&quot; IR1 tarafından üretilen sinyal histidin varlığında meydana gelir. Sıtma biyomarker histidin açısından zengin iken, insan serum albümini ve histidin bakımından zengin glikoproteinin gibi serum proteinleri, prob ile, bir sinyal tepkisine neden olacaklardır. Bu da yanlış pozitif tanılara yol açacak. Bu yararlı bir aşama olması ile ilgili protein hızlı bir hasta numunesinden elde edilebilir parçacığın yüzeyi üzerinde protein yakalama yapar. Ayrıca, iki fonksiyonlu prob tasarımı sağlam bir moleküler tanıma elemanına çiftler histidin zengin peptid (yani. Aptamer olduğunu) Tahlile özgüllük bir tabaka eklenebilir. peptid aptamer bağlanmadan önce iridyum yüklenmiş olacaktır. Aptamer hedef özgüllük elde ederken böyle bir tasarımda, istikrarlı IR1 prob hala kullanılabilir. Bu kompleks matris (örn., Plazma ya da bütün kan) yerli HRP II algılamak ve spesifik olmayan bağlanma etkilerini azaltmak için prob uygulanması için izin verecektir. Daha hızlı bir tanısal testlerin sinyalini geliştirmek için, deney pf HRP II elektrokimyasal okuma 26 ile RDTs tespit edilebilir bir elektrokemilüminesan (ECL) sistemi içine dahil edilebilir. Bu yeni nesil iridyum probu büyük ölçüde hastalık biyobelirteçlerinin tespiti için bizim on-boncuk ELISA testi artıracaktır.

Kolorimetrik ve floresan etiketleme biyokimyasal moleküllerin tespiti ve takibi için önemli bir yöntemdir ve 1,2 işler. En yaygın fluoresan işaretleyiciler, düşük molekül ağırlıklı organik boyalar 3,4, ancak bu moleküller her zaman ideal optik özelliklere sahip değildir. Floresan boyalar genellikle küçük Stokes kaymalar, ve üst üste binen uyarma ve emisyon spektrumlarına sahip olabilir, ışıkla ağartma yatkındır. Kolorimetrik markalama genellikle bağışıklık miktar 5,6 yararlı olan güçlendirilmiş bir sinyal enzimatik etiketler, kullanımı ile elde edilir. Bu enzimler aynı zamanda fotosensitivite, reaksiyon koşulları ve kısa alt-tabaka raf ömrü dahil olmak üzere kendi dezavantajları vardır. Bu özellikler masraflı belirteçleri kullanarak iyi kontrollü şartlar altında yapılması gereken immün ve protein etiketleme yöntemleri gerektiren eğilimindedir. Yayıcı geçiş metali kompleksleri, alternatif etiketleme yaklaşımı FO olarak araştırılmıştırBiyokimyasal algılama r. Özellikle, (III), 7-9 oksijen 10 algılama organik ışık yayan diyotlar (OLED) kapsamında incelenen 11 kataliz ve protein / hücre 12-14 boyama olmuştur Ir cyclometalated. Yüksek fotostabilite ve kuantum verimliliği sondaları bu sınıf biyomolekülün tespiti 15,16 için iyi bir aday olun. Bu, daha önce formun, (III) kompleksleri Ir cyclometalated olduğu tespit edilmiştir [Ir (Cı ^ K) 2 (Solv) 2] +, geri dönüşü olmayan histidin bağlanan ve mavi-yeşil bir sinyal yanıtı 12,17 neden olabilir. Bu kompleksler solvento halde olmayan yayım, ancak histidin çözücü moleküllerini değiştirir ve metal merkezine bağlandığı zaman, uzun dalga UV ışınımı sonrasında yoğun bir fosforlu sinyali bırakın. Bu sinyal, yalnızca ligand ikamesi sonra oluşur ve metal ligand yük transferi aktivasyonu yoluyla zemin durumuna rahatlatıcı bir üçlü devlet elektronun sonucu (3 ML olduğunuBT) ve ligand merkezli transferi (3 LC) 8,15 yolaklarıyla. Bu kompleksler, potansiyel olarak histidin bakımından zengin proteinleri için algılama sondalar olarak kullanılabilir. Histidin bakımından zengin proteinler ve regülasyon seviyeleri karaciğer sirozu, kanser ve trombik bozukluklar da dahil olmak üzere, pek çok hastalıkta önemlidir. Özellikle 18 Plasmodium falciparum Histidin zengin protein II (pfHRP-II) &#39;sıtma paraziti enfeksiyonu için iyi olarak geçerliliği biyomarkerdir. Bu protein en çok karakteristik AHHAHHAAD tekrar motifler 19 içinde, 67 kDa ve 34% histidin içerir. Bu histidin tekrarlar ücretsiz metal iyonlarını 19 bağlayabilir ve heme konak kanda 20 kompleksleri. pfHRP-II yaygın immunokromatografik hızlı tanı testleri (RDTs) kullanarak düşük kaynak ortamlarda algılandı ancak bu testler nedeniyle numune koşulları, düşük biyobelirteç konsantrasyonu, kötü üretim standartları ve antikor bozulması 21 genellikle yanlıştır. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; örneğin cyclometalated Ir gibi metal tabanlı fosforlu sondalar (III) &#39;ün yukarıda tarif edilen kompleksler nedeniyle histidin seçici bağlayıcı ve stabil ve etkili bir emisyon özellikleri pfHRP-II&#39; nin tespiti için çekici bir seçenek vardır. Bu yazıda, kullanılması [ir (ppy) 2 (H2O) 2] + (IR1) BNT-II, 22 keşfedilmeden pfHRP-II dallı bir peptid taklidi gibi davranır algılamak için. Bu etkileşimin kinetik biolayer interferometre teknikleri kullanılarak gerçek zamanlı olarak takip edildi. Tahlil ayrıca tespit nanomolar limitleri elde edildi bir on-boncuk ELISA-tipi biçimi, adapte edildi. Bunun yerine, 4-5 saat ve tipik ELISA ile istenen biyolojik reaktifler, antikor içermeyen reaktifler ile, 2 saat altında gerçekleştirilebilir, çünkü bu deney, geleneksel ELISA fazla avantajlar tutar.

<table><tbody><tr><td>Dicholortetrakis(2-(2-piridinil)fenil)diiridyum(III)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>658383</td><td></td></tr><tr><td>gümüş triflorometansülfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176435</td><td></td></tr><tr><td>Silika jel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>L-Amino asitler</td><td>Fisher Scientific</td><td>değişir</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>BNT-II peptit</td><td>Evde sentezlenir</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant HRPII</td><td>İmmünoloji Danışmanları Laboratuvarı a.ş.</td><td>AGPF-55</td><td></td></tr><tr><td>Costar siyah polipropilen 96 oyuklu plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Costar beyaz polipropilen 96 oyuklu plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Grenier siyah polipropilen 96 oyuklu plaka</td><td>VWR</td><td>89089-582</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA manyetik agaroz parçacıkları</td><td>Qiagen</td><td>36111</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA Biyokatman İnterferometri Sensörleri</td><td>ForteBio</td><td>18-5101</td><td></td></tr><tr><td>Octet Red96 Biyokatman İnterferometri Aleti</td><td>ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotek Synergy H4 Mikroplaka Okuyucu</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Biotech Transilluminator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBDLT-88</td><td></td></tr></tbody></table>

malarya protein biyomarker histidin zengin protein-ii tespiti için İridyum (iii) lüminesans probe

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Bu çalışma olmayan bir yayım sentezini ana hatlarıyla cyclometalated Ir (III) kompleksi, Ir (ppy) 2 (H2O) 2 histidine- koordine olduğunda hızlı, uzun ömürlü fosforlu sinyali ortaya çıkarmaktadır + (IR1), manyetik parçacığın yüzeyi üzerinde hareketsizleştirilmiş protein ihtiva etmektedir. IR1 sentezi, yüksek verimlerle, / K tam bir O ve solvatlanmış kompleks iki eşdeğer olarak Ir (III) &#39;ün kloro-köprülü dimer cyclometalated ebeveynin bölme içerir. Özgünlüğünü teyit etmek için, sentezlenmiş prob ilave edildiğinde çeşitli amino asitler koordinasyon aktivitesi için problandı ve sadece histidin sinyal karşılığını ortaya çıkardı. BNT-II, sıtma belirteç Histidin zengin protein II (pfHRP-II) &#39;in bir dallı peptit taklidi gibi davranır kullanarak, iridyum prob HRP II tespiti için bir araç olarak doğrulanmıştır. L-Histidin / IR1 kıyasla söndürme etkisi BNT-II / IR1 titrasyonu dikkat çekildi, ancak bu sterik engel ve tri atfedilmiştirdevlet su verme plet. Biolayer interferometri BNT-II ile IR1 etkileşimi gerçek zaman kinetiklerini belirlemek için kullanılmıştır. Sistem optimize sonra, prob kullanılarak rcHRP-II &#39;nin tespit limiti çözeltisi içinde 12.8 nM olduğu tespit edilmiştir. Bu protein, bir 50 um, manyetik agaroz parçacık yüzeyi üzerinde immobilize edildi, algılama sınırı 14.5 nM idi. Sağlam sinyali, bu inorganik prob tepki olarak çözelti içinde kullanım esnekliği ya da bir yüzey üzerinde immobilize, diagnostik kullanım görüntülemeye, çeşitli uygulamalarda doğru elverişli olabilir.

Şekil 1, metal merkezine çözünmeyen AgCl şeklinde klorür çökelmesi ile ana dimer klorid köprünün IR1 solvento kompleks ilgili bölme sentezi ve su moleküllerinin birlikte gösterildiği gibi. IR1 oluşumu, H 1 NMR ve ESI ile teyit edilmiştir. 365 nm&#39;de uyarıldığında, ayrıca metal ligandı yük transferi karakteristik UV-görünür bant ve π-π * geçişler daha IR1 oluşumunu doğrulamak, spektrum tahsis edilmiştir. Bu kompleks sergilemeyen bir yayıcı karaktere solvatlanmış. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> Şekil 1:. Bölgesinin IR1 Dichlorotetrakis (2- (2-piridinil) fenil) Klorür köprüsü bölme reaksiyon sentezi ve karakterizasyonu diiridium (III) Akuo kompleksi Ir oluşturmak için (ppy) 2 (H2O) 2 </sub&gt; + (IR1). Ilave edildikten sonra, L-His sulu tampon içinde Akuo kompleksi, lüminesan sinyal açılır. Kompleksi sentezlenmiş ve karakterize edilmiştir kez daha önce benzer bir iridyum analog 17 kullanılarak tarif edildiği gibi, bir amino asit seçiciliği, analiz edilmiştir. Şekil 2A, 365 nm&#39;de uyarıldığında, sadece histidin, 510 nm&#39;de bir sinyal yanıtı ortaya göstermektedir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> Şekil 2: Amino Asit Seçiciliği ve histidin bakımından zengin peptitler ile IR1 Titrasyonu (A), 50 uM ile, çeşitli amino asitler (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His), 200 uM etkileşimi. HBS IR1. Spektral taramalar siyah 96 oyuklu bir plaka içerisinde 365 nm&#39;lik bir uyarma dalga boyunda 400-700 nm alınmıştır. Tüm amino asitler b nispi floresans birimleri Sinyal (RFU)esides histidin (kesikli siyah iz) yok denecek kadar azdı. BNT-II (▪) ve rcHRP-II (♦) ve (B), nanomolar konsantrasyonlarda HBS&#39;de IR1 ile titre edildi. histidin bakımından zengin peptitler 365 nm ışık ile uyarma sonrasında 510 nm&#39;de emisyon okumadan önce çözelti içinde 15 dakika için sonda ile inkübe edilmiştir. Algılama limiti Y 3σ boş = x değeri olarak hesaplandı. Histidin koordine edildiğinde Ir singlet uyarılmış durum (1 MLCT / 1 LC) (III) Bioconjugate üçlü uyarılmış duruma (3 MLCT) için sistemler arası geçiş uğrar çünkü iridyum probunun fosforesans Bu &quot;on-switch&quot; oluşur Metal merkezine. Bu prob BNT-II Plasmodium falciparum Histidin Zengin Protein II (HRP-II pf) sıtma belirteç mimik bir peptid uygulanmıştır. IR1 ile BNT-II &#39;nin, bir titrasyon olarak, konsantrasyon bağımlı bir sinyal tepkisi gözlendi ( <strong&gt; Şekil 2B). Rekombinant HRP-II (rcHRP-II) &#39;de çözelti içinde benzer bir tepki sergiledi. çözelti içinde BNT-II ve rcHRP-II &#39;nin tespiti sınırları, sırasıyla 54.8 nM ve 12.8 nM idi. Biolayer interferometre teknikleri kullanarak, BNT-II bağlanmasını IR1 Kd bir Ni (II), NTA yüzeyi üzerinde hareketsiz 2.05 uM (Şekil 3) olduğu bulunmuştur. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> Şekil 3:. Bir Ni (II), NTA, cam sensörünün yüzeyi üzerinde BNT-II bağlanmasını IR1 çeşitli konsantrasyonlarda kinetik analizi için BNT II Biolayer interferometri ile IR1 gerçek zamanlı Kinetik Analizi. KB (Bölge A) sensörleri dengelenmesinden sonra, sensörler 0.5 uM BNT-II (Bölge B) ile yüklenir. Peptit sensörleri üzerinde yüklendikten sonra, bir temel öncesinde BNT-II (Bölge D) IR1 dernek ölçme (Bölge C) kuruldu. SonraDerneğin bir süre, sensörler ayrışma (Bölge E) ölçmek için KB geri yerleştirilir. Bütün kinetik analiz süreci az 30 dakika sürer. Bir manyetik parçacık platformuna çözeltisi tabanlı testte geçtiğinde, sistem içinde parçacığın ilave karmaşıklığı göz önüne alınması gerekiyordu. Görüldüğü gibi, yukarıda tarif 24 Siyah floresan plakalar çözüm tahlil için çalıştı. Bu parçacıklar verimli sıtma biyogösterge pf HRP-II bağlamak olduğunu, daha önceki çalışmalar ile bilinen, ancak beyaz plakalar üzerinde parçacık algılama platformu için daha uygun idi Şekil 4A. Beyaz bir levha, ışık ve böylece parçacığın yüzeyine bağlanmış IR1 ile daha iyi bir emiş sağlayan geri numune içine yansıtılmaktadır. Üzerinde parçacık tahlilde, rcHRP-II &#39;nin tespit limiti 14.5 nM (Şekil 4B) olduğu belirlenmiştir. rcHRP-II için tespit limiti solüsyonu-in ve on-boncuk statis vardıBir eşleştirilmemiş t-testi (p = 0,731) dayalı olarak an- aynı. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> Şekil 4: a. Siyah 50 um Ni yüzeyinde BNT-II&#39;ye bağlanan IR1 alınan sinyal arasındaki üzerinde boncuk BNT-II ve HRP-II Saptanması (A) fark (II), NTA, manyetik agaroz parçacıkları 96- de beyaz 96-kaynak plaka (kesikli çizgi) karşı plaka (düz çizgi). parçacıklar 365 nm ışık ile ikaz edilmiş ve emisyon 510 nm&#39;de ölçülmüştür. RcHRP-II &#39;nin (B)&#39; titrasyon manyetik parçacıklar üzerinde hareketsiz ve IR1 ile tespit edildi. Algılama limiti va olarak hesaplanmıştırx Lue y 3σ boş = olduğunda. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> Şekil 5: IR1 ile rcHRP-II üzerinde boncuk Algılama şematik temsili Ni (II), NTA parçacıklar ve IR1 ile etiketlenmiş yüzeyine bağlaması, HRP-II &#39;nin genel şeması.. tanecikler, 15 dakika boyunca bir histidin açısından zengin peptid ile inkübe edilir. Bu inkübasyon süresinden sonra, parçacıklar HBST çözeltiden parçacıkları çekmek için, bir mıknatıs kullanılarak yıkanır. Son olarak, peptid bağlanan parçacıklar önce, 365 nm ışık ile uyarma sonrasında 510 nm&#39;de emisyon okuma 1 saat boyunca IR1 ile inkübe edilir.

Sağlam tespit reaktifleri, yeni sıtma teşhis araçları geliştirmek için giderek artan bir gereklilik göstermektedir. Histidin açısından zengin bir sıtma proteini biyobelirteç varlığında uzun süreli ışıldayan sinyal yayan bir iridyum (III) probu tasarlanmıştır. Proteinin çözelti içinde veya manyetik bir parçacık üzerinde hareketsiz hale getirilerek tespit edilmesi, uygulamada esneklik sağlar.

Malarya Protein Biyomarker Histidin Zengin Protein-II Tespiti için İridyum (III) Lüminesans Probe

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

Bu prosedürün genel amacı, fosforezan bir iridyum probu kullanarak bir örnekteki histidin açısından zengin malal protein biyobelirtecinin varlığını tespit etmektir. Bu işlem, öncelikle siklo metillenmiş iridyum kompleksinin sentezlenmesiyle gerçekleştirilir. Ana dimer kompleksinin hızlı klorür köprüsü ayrışmasının ardından, siklo metillenmiş iridyum kompleksi izole edilebilir ve saflaştırılarak analizde kullanılabilir.İkinci adım, spesifisitesini sağlamak amacıyla probun çeşitli amino asitlerle olan etkileşimlerini doğrulamaktır. Sadece histamin için fosforesan sinyali yalnızca histamin varlığında aktif hale gelir ve lüminesans spektroskopisi ile gözlemlenir. Ardından, bir kavram kanıtı olarak, çözeltideki tespit sınırlarını belirlemek için iridyum probu, sıtma biyobelirteci olan histidin bakımından zengin protein iki'nin (histidine rich protein two) bir peptid mimiği ile titre edilir.Ek olarak, probun peptid ile etkileşim kinetiği biyokatman interferometrisi kullanılarak açıklanmaktadır. Son adım, rekombinant histidin zengin proteini nikel NTA manyetik partiküllerinin yüzeyine immobilize etmek ve probu kullanarak proteinin saptama sınırını değerlendirmektir. Nihayetinde, proteinlerin yeni bir fosforesan iridyum probları sınıfı kullanılarak katı bir destek yüzeyinde nasıl saptanabileceğini göstermek için lüminometre ve spektroskopi kullanılmıştır.Bu tekniğin, floresan protein işaretleme ve immünassaylar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, probun dayanıklı olmasıdır. Hızlı bir birleşme kinetiğine sahiptir ve fotobeyazlamaya karşı hassas değildir. Ayrıca, bu teknik immünassayların aksine uzun sürelere ihtiyaç duymaz.Bu tekniğin uygulamaları, sıtma enfeksiyonunun teşhisine kadar uzanmaktadır. Bunun nedeni, Plasmodium SRO enfeksiyonunun Histidin zengin protein iki adlı protein biyobelirtecinin yüksek histidin içeriğidir. Bu yöntemle ilgili fikri ilk kez, canlı hücreleri boyamak için siklometilasyonlu iridyum probu kullanan bir makalenin yayınlandığını fark ettiğimizde edindik.Bu makalede, probun canlı hücreye girdiği ve histon zengin proteinlere bağlanarak çekirdekleri aydınlattığı belirtilmiştir. Mal biyobelirtecinin doğası, yani histon zengin protein 2 göz önüne alındığında, hedef proteinimizi tespit etmek için bu probu kullanmaya karar verdik. Analizin karmaşıklığı ve bu hedef proteinin partikül üzerinde tespit edilmesi için gereken çok sayıda yıkama ve transfer adımı nedeniyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. Başlangıç için, 53,6 mg ana iridyum dimerini tartın ve 5 mL metilen klorür içinde çözün.Bu çözeltiyi, içinde manyetik karıştırıcı bulunan 50 mililitrelik bir Lummi balonuna ekleyin. Ardından 26,2 miligram gümüş FL tartın ve beş mililitre metanol içerisinde çözün. Çözünmüş gümüş FL'yi ana iridyum dimer çözeltisine ekleyin ve bir saat boyunca karıştırın.Bir saat sonra krem rengi bir bulamaç oluşmalıdır; bulamacı silika jel üzerinden bir filtre kolbuna süzün. Filtrelenen ürünü 25 x 95 mm'lik bir DRAM şişesine aktarın ve kalan çözücüyü bir döner evaporatör kullanarak 5 ila 10 dakika boyunca uçurun. Çözücünün çoğu uzaklaştırıldıktan sonra, şişede yağlı sarı bir kalıntı kaldığını kontrol edin.Bu kalıntıya, ürünü çözmek için bir mililitre metanol ekleyin. İridyum probunun çeşitli amino asitlerle olan etkileşimlerini incelemek için, sarı bir katı elde etmek üzere bir ila iki gün bekletin ve ürünü metin protokolünde açıklandığı şekilde karakterize edin. Her bir amino asit çözeltisinden 100 mikrolitreyi siyah bir 96 kuyucuklu plakaya pipetleyin.Kör numune olarak hizmet etmesi için plağa 100 µL tamponlu salin veya HBS ekleyin. Ardından, her örneğe hazırlanan 2 mM iridyum prob çözeltisinden 2,5 µL ekleyin ve plağı bir plaka çalkalayıcıda 10 dakika boyunca çalkalayın. 10 dakika sonra, 96 kuyucuklu plaka okuyucu kullanarak örneklerin emisyon spektrumlarını elde edin.Bunu yapmak için, plakayı cihaza yerleştirin ve yeni bir deney kurmak için plaka okuyucu yazılımını açın. Ardından, numuneleri şeffaf bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve sıtma biyobelirteci, histamin zengin protein iki BNT iki'nin dallanmış peptit mimiği ile iridyum probunun titrasyonunu gerçekleştirmek için UV trans-illuminatör kullanarak emisyonun görüntüsünü alın. İlk olarak, HBS içinde 1 mM BNT iki stok çözeltisi hazırlayın.Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi BN T iki çözeltisini seri şekilde dilüe edin. HBS'yi körleme olarak kullanarak, her bir dilüsyondan 100 µL'yi üç tekrar şeklinde bir 96 kuyucuklu plakadaki kuyucuklara ekleyin; her örneğe 2,5 µL iki mM iridyum probu ekleyin. Plağı bir plaka çalkalayıcıda 10 dakika boyunca çalkalayın ve çalkalama işleminin ardından, bir 96 kuyucuklu plaka okuyucu kullanarak 510 nm'de emisyon yoğunluğunu okuyun.Son olarak, örnekleri şeffaf bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve biyokatman interferometrisi kullanarak gerçek zamanlı kinetik analiz gerçekleştirmek için UV transilüminatör kullanarak titrasyonun görüntüsünü alın. İlk olarak, siyah bir 96 kuyucuklu plakanın ilk sütunundaki sekiz kuyucuğa 200 µL kinetik tampon ekleyin. Plakayı plastik sensör tutucuya yerleştirdikten sonra, uçları tamponlu kuyucukların içinde asılı kalacak şekilde sekiz nikel-A biyosensörünü plastik tutucunun ilk sütununa dikkatlice aktarın.Ardından, interferometri cihazının sol tarafındaki plastik tutucuya yeni bir siyah 96 kuyucuklu plaka yerleştirin; aynı plakanın birinci ve üçüncü sütunlarındaki tüm sekiz kuyucuğa 200 µL KB ekleyin, ikinci sütundaki kuyucuklara ise 200 µL 0,5 µM BNT iki çözeltisi ekleyin. Daha sonra, A4 kuyucuğundaki boş örnek olarak KB ile başlayarak, iridyum probun her bir dilüsyonundan 200 µL'yi dördüncü sütuna ekleyin. Dilüsyonları, sütun boyunca aşağıya doğru iridyum prob konsantrasyonu artacak şekilde ekleyin.Bu plakayı, biyokatman interferometrisi yazılımında ön ıslatma sensörlerini içeren plakanın sağındaki konuma yerleştirin. Plakayı tanımlamak için plaka analizi ve sensör uçlarını belirleyerek temel bir kinetik deney düzeneği kurun; ekrandaki bir sütunu seçip sağ tıklayın ve uygun tanımı seçin. Kuyucuklar için tampon seçeneğini belirleyin.Birinci ve üçüncü kolonlar için, ikinci kolon ve numune için yükleme yapın. Dördüncü kolon için, önce denge ekle seçeneğine tıklayarak sonraki sekmede analizi tanımlayın. 60 saniye yükleme 120 saniye.Asosiyasyon 120 saniye ve disosiyasyon 300 saniye. Denge adımını seçin ve birinci sütuna çift tıklayın. Ardından aynı işlemi yükleme için ikinci sütuna, temel hat için üçüncü sütuna, asosiyasyon için dördüncü sütuna ve disosiyasyon için üçüncü sütuna uygulayın.Son olarak, nikel NTA sensörlerini seçin. Deneyin doğru şekilde tanımlandığını onaylayın. Bir dosya adı girin.Gecikme deneyinin işaretli olduğundan emin olun ve başlat düğmesine basın. Kinetik çalışma tamamlandığında, iridyum probu ile BNT iki ve rekombinant HRP ikisinin boncuk üzerindeki tespitini gerçekleştirmek için verileri sağlanan işleme yazılımında işleyin. Metin protokolünde açıklandığı şekilde BNT iki ve rekombinant HRP iki için seri dilüsyonlar hazırlayın.Ardından, her bir dilüsyondan 100 µL'yi, en düşükten en yüksek konsantrasyona doğru bir sütun boyunca sıralayarak beyaz bir 96 kuyucuklu plakaya üç paralel şeklinde pipetleyin; her dilüsyon kuyucuğuna 10 µL 50 µm nikel NTA manyetik parçacık ekleyin. Pipetleme sırasında manyetik parçacıkların süspansiyon halinde kaldığından emin olun. Parçacıklar çökmeye başlarsa pipetleme yoluyla veya vorteksleyerek karıştırın, ardından örneklerin parçacıklarla inkübe edilmesi için plakayı 15 dakika boyunca bir plaka çalkalayıcıya yerleştirin. Bu inkübasyon süresinin sonunda, plakayı 96 kuyucuklu bir mıknatısın üzerine yerleştirin ve parçacıkların solüsyondan ayrılması için 30 saniye bekleyin.Çok kanallı bir pipet kullanarak, plakayı mıknatıstan çıkardıktan sonra orijinal örneği çekin ve her kuyucuğa 200 µL tweenli HBS veya HBST ekledikten sonra atık olarak bertaraf edin. Manyetik partikülleri yıkamak için çok kanallı pipeti kullanarak tamponu birkaç kez yukarı ve aşağı pompalayın. Plakayı tekrar mıknatısın üzerine yerleştirin ve partiküllerin solüsyondan ayrılması için 30 saniye bekleyin.Çok kanallı pipet kullanarak 200 µL tampon çözeltiyi çekin ve atık olarak boşaltın. Parçacıkların toplam üç kez yıkanması işlemini tamamlamak için yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlamadan önce plakayı mıknatıstan ayırın. Ardından, manyetik parçacıklar içeren her bir kuyucuğa 100 µL HBST ve ardından 2,5 µL 2 mM iridyum prob çözeltisi ekleyin.Partikülleri iridyum probu ile birlikte bir tabla sarsıcısında bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, 96 kuyucuklu plaka okuyucu kullanarak 510 nanometrede emisyon yoğunluğunu okuyun.Siklo metillenmiş iridyum probunun sentezi ve karakterizasyonunun ardından, çeşitli amino asitlerin kompleksle reaktivitesi test edilir. Probun titrasyonu sonucunda yalnızca histidin, bağıl floresans birimleri cinsinden bir sinyal yanıtı oluşturur. Çözeltideki iki histamin içeren peptit ile konsantrasyona bağlı bir yanıt gözlemlenir.Bu yanıt, geniş bantlı UV ışığı altında burada görülebilir. Nikel NT.A cam sensör yüzeyindeki BNT ikiye bağlanan çeşitli konsantrasyonlardaki iridyum probunun kinetik analizi için kullanılan biyotabaka interferometrisi, iridyum probunun histidin içeren peptidlere karşı mikromolar afiniteye sahip olduğunu ortaya koymaktadır.Protein manyetik bir partikül yüzeyine immobilize edildiğinde, prob kullanılarak histidin zengini protein için saptama sınırı benzer bulunmuştur. Çözeltide olduğu gibi, proteinin bu şekilde işaretlenmesi, teknikte uzmanlaşıldıktan sonra doğrudan partiküllerin yüzeyinde görselleştirilebilir. Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında iki saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedür uygulanırken, manyetik protein bağlı partiküllerle yapılan yıkama ve transfer aşamalarında dikkatli olunması önemlidir. Bağlanmamış proteinlerin yıkanarak uzaklaştırılması, immobilize edilmiş P-F-H-R-P twos'un doğru şekilde tespit edilmesi için kritik öneme sahiptir; antikor-antijen etkileşimleri yoluyla bağlı proteini spesifik olarak hedefleyecek bir moleküler tanıma elementi tasarlayarak. Geliştirilmesinin ardından, sağlam iridyum probun kullanılmaya devam edilmesi, partikül yüzeyine bağlı proteinlerin daha hassas ve spesifik bir şekilde tespit edilmesine olanak tanıyacaktır.Bu tekniğin, tanı alanındaki araştırmacıların yalnızca sıtmanın değil, diğer bulaşıcı hastalıkların tespitinde de dayanıklı olan bu tür reaktiflerin kullanımını keşfetmelerine ön ayak olma potansiyeli bulunmaktadır.

iridium-iii-luminescent-probe-for-detection-malarial-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Manyetik modülasyon biyoalgı sistemi hızla DNA molekülleri ve proteinler gibi biyolojik testleri, hassas ve kolayca tespit etmek için kullanılmaktadır.

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

SiO Kantitatif, yüksek verimli, gerçek zamanlı ve etiket ücretsiz biyomoleküler algılama (DNA, protein,...

Biyomoleküler Algılama istihdam İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensörü (IRIS)

43 kadar moleküler hedeflere eş zamanlı olarak algılanması için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi açıklanmıştır. MPCR / RLB Uygulamaları mikrobiyal yazarak ve klinik örneklerde birden fazla patojenlerin tespiti içerir.

Multiplex PCR ve Reverse Line Blot Hibridizasyon Testi (mPCR / RLB)

Neredeyse tüm S. içeren protein mikrodiziler kullanarak cerevisiae proteom paralel protein-protein etkileşimleri, binlerce hızlı tarafsız sorgulama için incelenir. Bu yöntem, protein-küçük molekül, translasyon sonrası modifikasyon ve yüksek verimlilik Diğer tahliller için kullanılabilecektir.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

Burada RNA / protein etkileşimleri analiz etmek için bir protokol mevcut. elektroforetik hareketlilik kayma deneyi (EMSA), yerli jel elektroforez sırasında RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA ayırıcı geçiş dayanmaktadır. Bir radyo-etiketli bir RNA probu kullanarak, RNA / protein kompleksleri otoradyografi ile görselleştirilebilir.

IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

Yüksek çözünürlüklü erime analizi heterojen nüfus içinde tek nükleotid polimorfizmlerinin ayırt yeteneği sunarken, mutant alel amplifikasyon önyargı, bir numune içinde nispeten düşük oranlarda bulunan allel tespit kabiliyetini artırabilir. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü erime analizinin duyarlılığını artırmak geliştirmeleri açıklanır.

Yöntemler sıtma Tek Nükleotid Polimorfizm Genotipleme Erime Yüksek Çözünürlük Duyarlılığının Artırma

Burada, IRF3 transkripsiyon faktörünün fosforilasyona bağlı aktivasyonunun ayrıntılı bir analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz. Bu, yüksek çözünürlüklü bir SDS-PAGE ve çoklu fosfospesifik antikorlar kullanılarak immünoblotlara bağlı bir doğal PAGE'nin kombinasyonu ile elde edilir.

Bir Yüksek Çözünürlüklü Yöntem IRF3 fosforilasyonu bağımlı Aktivasyon Monitör

Burada, bir protokol için Plasmodium falciparum miktar virüslü sulu kırmızı kan hücrelerinde bir zayıflatılmış toplam yansıma kızılötesi Spektrometre ve çok değişkenli veri analizi kullanarak ve algılama mevcut.

Algılama ve miktar için Plasmodium falciparum içinde sulu kırmızı kan hücreleri tarafından toplam yansıma kızılötesi spektroskopi zayıflatılmış ve çok değişkenli veri analizi

Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), geniş bir çalışma aralığında düşük intra ve inter-assay hatası ile yüksek nicel, doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üreten endojen ve eksojen olarak uygulanan MeCP2 protein varyantlarının kantitatif tespiti için yeni bir yaklaşımdır. Burada, 96-iyi formatta MeCP2-ECLIA için protokol açıklanmıştır.

MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test

Burada, X-ışını uyarılmış lüminesans kimyasal görüntüleme (XELCI) ile implante edilmiş tıbbi cihazların etrafındaki kimyasal bilgilerin yüksek çözünürlüklü optik tespiti için bir protokol sunuyoruz. Bu yeni görüntüleme tekniği, implantla ilişkili enfeksiyon biyokimyasının incelenmesini sağlayan laboratuvarımızda geliştirilmiştir.

Yüksek Uzamsal Çözünürlüklü İmplantla İlişkili Enfeksiyonların X-ışını ile Kimyasal Görüntülenmesi Uyarılmış Lüminesans Doku Yoluyla Kimyasal Görüntüleme

Mevcut protokol, bir NIR-II optik görüntüleme cihazı kullanan bir farenin ayrıntılı, gerçek zamanlı NIR-II floresan görüntüleme işlemini tanımlamaktadır.

Vasküler ve Tümör Görüntüleme için Parlak Bir NIR-II Floresan Probu

Öğrenin, fosforesan iridyum probu kullanarak malarya biyobelirteci histidin zengin protein-II'yi nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, hızlı kinetik ve fotobozunmaya karşı dayanıklılık sağlar.

Malarya Protein Biyomarker Histidin Zengin Protein-II Tespiti için İridyum (III) Lüminesans Probe

Daha fazla video keşfet