Öğrenmenin Ayrık Aşama sırasında Kemirgenler uzaktan suskunluğu Sinir Aktivitesi Bir Yöntem

Bu prosedürün amacı, hayvanlar öğrenme ve hafıza görevleriyle meşgul olurken, ayrı beyin bölgelerindeki nöronal aktiviteyi geçici ve uzaktan susturmaktır. Bu, önce bir tasarımcı reseptörü ve bir raportör içeren a, a, V'nin infüzyon için bir şırıngaya yüklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, sıçan beynindeki ilgi alanına bir V aşılamaktır.

Daha sonra, biyolojik olarak inert tasarımcı ilaç klozapin ve oksit hazırlanır ve sistemik olarak sıçana enjekte edilir. Son adım, duyusal bir ön koşullandırma paradigması kullanarak davranışsal test yapmaktır. Sonuç olarak, sıçan beyin dokusu üzerindeki immünofloresan mikroskobu, tasarımcı reseptörünün yerleşimini doğrulamak için kullanılır.

Bu yöntem, motivasyon, dikkat, öğrenme ve hafızanın düzenlenmesi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere davranışsal sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir Bu videoda kullanılan virüs boyunca adeno ile ilişkili virüslerle çalışmak için tüm kurumsal önlemlerin izlendiğinden emin olun, biyogüvenlik seviyesi bir bileşik olarak sınıflandırılır. % 10'luk bir çamaşır suyu çözeltisi hazırlayın. Dekontamine edici bir atık yeri, ağartıcı solüsyon içeren bir bega ve steril 10 mikrolitrelik bir şırınga.

Çalışma alanında, a V alikotu içeren mikro santrifüj tüpünü, en az dört mikrolitre a V içeren 10 mikrolitrelik bir şırınga olan standart bir tezgah mengenesine yerleştirin. Şırıngada, boş virüs tüpünü %10 çamaşır suyu içeren behere atın.

Atık kabına ilave %10 çamaşır suyu ekleyin ve dekontamine sıvı atığı kurumsal yönergelerde belirtildiği şekilde atmadan önce atığın 30 dakika bekletin. Emici tezgah kağıdını stereotaksik cihazın altına ve özel bir virüs işleme alanı olarak belirlenmiş bitişik bir alana yerleştirerek cerrahi alanı hazırlayın. Anestezi indüklendikten sonra dakikada bir litre oranında% 3 isof, flor ve oksijen vardı.

Kürkü gözlerin arasından kulakların hafifçe arkasına kadar traş edin. Tıraştan sonra, sıçan stereotaksik bir aparatla sabitlenmiş olarak sıçanı üç dakika boyunca indüksiyon odasına geri koyun. Gözleri oftalm merhemle kapatın ve Betadine ile temizleyerek kesi bölgesini hazırlayın.

Cildin 2,4 santimetrelik orta hat kesisini yaptıktan sonra, kafatasının üzerinde, gözlere yaklaşık iki milimetre kordondan başlayarak, kafatasını ortaya çıkarmak için cildi geri çekin ve ardından bgma ve lambda net bir şekilde görünene kadar kafatasındaki zar dokusunu temizleyin. Kafatasının düz olduğundan emin olduktan sonra, matkabı bgma'ya yerleştirin, koordinatları sıfırlayın ve ardından matkabı istenen medial, lateral ve anterior posterior koordinatlara getirin. 0,9, 0,7 veya 0,5 milimetre matkap ucu kullanarak bir delik açın.

İnfüzyon pompasını virüsü dakikada 0,2 mikrolitre hızında verecek şekilde ayarlayın. La şırıngayı stereotaksik cihazın infüzyon koluna yerleştirin ve şırıngayı istenen koordinata indirin. Virüslerin teslimi tamamlandıktan sonra istenen miktarda virüsü vermek için pompayı kullanın.

İzlenen iğneye geri akışı önlemek için şırıngayı 10 dakika yerinde bırakın, şırıngayı dakikada yaklaşık beş milimetre hızında yavaşça kaldırın. Ardından bir sonraki koordinata geçin ve tüm koordinatlar a a v ile infüze edilene kadar prosedürü tekrarlayın. Yarayı kapattıktan ve onaylanmış protokole göre postoperatif analjezi sağladıktan sonra, fareyi yatak takımı, kapak ve uygun işaretler bulunan temiz bir kafese yerleştirin.

Sıçan anesteziden tamamen kurtulduğunda, onu muhafaza odasına geri koyun. Tasarımcı reseptörünün yeterli ifadesini sağlamak için davranışsal teste başlamadan önce üç veya daha fazla hafta bekleyin. Bu şekil, duyusal ön koşullandırma paradigmasının üç aşamasını, ön koşullandırma aşamasını, koşullandırma aşamasını ve test aşamasını göstermektedir.

Tasarım ilacı olan klozapin ve oksit veya CNO, nöral aktiviteyi susturmak için kullanılır Tasarım reseptörünü aktive ederek, CNO, testin herhangi bir aşamasından önce enjekte edilebilir. Burada, CNO, ön koşullandırma seanslarının her birinden 30 dakika önce enjekte edilir. Protokolün yazılı bölümündeki talimatlara göre, mililitre klozapin ve oksit çözeltisi başına taze bir miligram hazırladıktan sonra, davranışsal testten 30 dakika önce CNO intraperitonealini kilogram başına bir miligram dozunda enjekte edin.

Uygun davranış oturumu için bilgisayar kodunu başlatın. 30 dakika geçtikten sonra, sıçanları test odalarına yerleştirin ve sıçanlara işitsel ve görsel uyaranların verilmesinden oluşan 12 karma çalışma sunarak 4 64 dakikalık ön koşullandırma seansının ilkine başlayın. Denemelerin altısında, 10 saniye boyunca ön koşul uyaranı bir ton sunulur, hemen ardından diğer altı denemede yanıp sönen ışık uyaranının beş saniyelik bir sunumu gelir.

Beyaz gürültüyü, yayınlanmamış uyaranı 10 saniye boyunca tek başına sunun. Ön koşullandırma aşamasının tamamlanmasından sonra, art arda beş gün boyunca gerçekleştirilecek olan koşullandırma seanslarına başlayın. Sıçanlara, görsel uyaranın verilmesinden, beş saniye boyunca yanıp sönen ışıktan ve hemen ardından 2 45 miligram gıda peletinin verilmesinden oluşan sekiz deneme sunun.

Bu süre, kondisyon seansları tamamlandığında yedi dakika süren denemeler arası aralıkları içerir. 78 dakikalık tek test oturumunu, sıçanlara yalnızca işitsel uyaranların verilmesinden oluşan 12 karışık çalışma sunarak gerçekleştirin. Denemelerin altısında.

Ton uyaranını, ön koşul uyaranını 10 saniye boyunca tek başına sunun. Diğer altı denemede, beyaz gürültüyü, eşleşmemiş uyaranı 10 saniye boyunca tek başına sunun. Davranışsal görevin tamamlanmasının ardından, fareleri derhal odalardan çıkarın ve onları hayvan kolonisine geri koyun.

Şartlandırma ve test aşamasından elde edilen verileri, protokolün yazılı bölümündeki ayrıntılı talimatlara göre analiz edin. Etiketli muhabire veya raportör proteinine yönelik immünohistokimya yaptıktan sonra, tasarımcı reseptörün ve/veya raportörün beklenen kontrol ve / veya raportörün yerini ve ekspresyonunu belirlemek için leke bölümlerini mikroskopi ile inceleyin ve deneysel sıçanlar benzer şekilde yanıp sönen ışık uyaranı ile yiyecek arasındaki Pavlovian İlişkisini öğrendi. Kondisyon seansları sırasında.

Oturumlar, her iki grup da kondisyon seansı sırasında yiyecek ödülü almak için motive edildi. Buna karşılık, kritik test oturumu sırasında, deney fareleri, ön koşullandırılmış ve havalandırılmamış işitsel uyaranlar arasında ayrım yapamadı, oysa kontrol fareleri, ön koşul uyaranının sunumlarına yanıt olarak daha fazla yiyecek kabı davranışı gösterdi. Bu nedenle, deneysel sıçanlar değil, kontrol duyusal ön koşullandırma etkisini gösterdi.

Bu görüntü, gelişiminden sonra kemirgen beyninde ilgilenilen bölgeye a v infüzyonunun yerinin histolojik doğrulamasını göstermektedir. Bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, belirli beyin bölgelerinin ve/veya hücre tiplerinin in vivo olarak karmaşık davranışlara katkılarını keşfetmelerinin yolunu açtı.