Name: Öğrenmenin Ayrık Aşama sırasında Kemirgenler uzaktan suskunluğu Sinir Aktivitesi Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Öğrenin: Sıçanlarda belirli beyin bölgelerindeki nöron aktivitesini geçici olarak susturma yöntemi. Farmakogenetik ve davranışsal testlerle öğrenme süreçlerini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu protokol kısmen türediği yazının katkılarından dolayı Robinson ve ark., 12 yazarları teşekkür ederim.

hayvanların kullanımı Oberlin College Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve komite kullanın ve Laboratuvar Hayvanları 21 Bakım Kılavuzu ile uyumlu ve Kullanımı vardır. Viral İnfüzyon 1. Hazırlık Not: Bu protokol BSL-1 önlemleri kullanır. BSL-2 önlemleri, tek kullanımlık laboratuvar önlüğü, eldiven, ayakkabı kapakları, göz korumaları ve maske (N95 tipi) kullanıldığında gereklidir. BSL-2 bileşikleri işleme Tüm bireylerin yerel halk sağlığı kurumu tarafından partikül solunum test uyması gerekir. Kullanım ve viral vektörlerin depolama ek ayrıntılar için Lowery &amp; Majewska (2010) 22 Bkz. <ol><li> 20 ul mikrosantrifüj tüpler ilk kullanımda, kısım ve mağaza kullanılmayan virüs üzerine tekrarlanan donma ve çözülme önlemek için. </li><li> Gereksiz nesneler kaldırarak ve% 70 etanol ile yüzeyi sterilize edilerek çalışma yüzeyini hazırlayın. Bir 1 hazırlayınAAV atık dekontaminasyon için% 0 çamaşır suyu çözeltisi. Çalışma yüzeyi üzerine çamaşır suyu çözeltisi ve steril bir 10 ul şırınga dolu bir behere koyun. Kurulması sırasında ezilmiş buz ile bir kapta AAV ile ependorf tüp yerleştirin. </li><li> Standart bir tezgah yardımcısı içine virüs ile ependorf tüp yerleştirin. AAV en az 4 ul ile 10 ul şırınga yükleyin. Yükleme sırasında mikrosantrifüj tüp alt karşı şırınga ucu eğmemeye özen gösterin. Şırınga AAV solüsyonu 4 ul hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. </li><li> % 10 çamaşır suyu içeren beher boş virüs tüp atınız. Tedarikçi tarafından belirtilen virüsün kullanılmayan kısımlarını saklayın. </li><li> Atık konteynerine ek% 10 çamaşır suyu ekleyin ve atık dekontamine sıvı atık atmadan önce 30 dakika boyunca bekletin. </li><li> Kurumsal rehberlere tarafından talimat olarak bir biyolojik tehlike kapta tüm koruyucu ekipman ve plastik atıkların bertaraf edin. Deco% 10 çamaşır suyu kullanarak virüs ile temas geldi herhangi bir ekipman veya yüzeyleri ntaminate. </li></ol> 2. Cerrahi <ol><li> Stereotaksik aparat altında ve özel bir virüs taşıma alanı olarak belirlenen bir komşu uzayda emici tezgah kağıdı koyarak cerrahi alan hazırlayın. <ol><li> Cerrahi aparat yakın adanmış virüs taşıma alanında% 10 çamaşır suyu atık kabını yerleştirin. </li></ol></li><li> Anestezi istikrarlı bir seviyede neden ve cerrahi sıçan hazırlar. <ol><li> Bilinç ve brüt maksatlı hareket eksikliği kaybı olana kadar izofluran gazı (1 ila 3% aralığı) ve oksijen (% 100 yaklaşık 1 L / dk) bir karışımını içeren bir indüksiyon odasına sıçan yerleştirin. Cerrahi prosedür boyunca izofluran anestezisi koruyun. </li><li> 6 derin anestezi elde edildikten sonra, biraz kulakların arkasında gözleri arasından sıçan tıraş. </li><li> Bir indüksiyon odasına geri sıçan yerleştirinEk 1-3 dk. </li><li> Izofluran anestezi sistemi stereotaksik cerrahi burun konisi bağlı olduğundan emin olun. Stereotaksi için izofluran akışını başlatmak için izofluran boru üzerine musluğunu açın. Yukarıda belirtilen seviyelerde izofluran ve oksijen koruyun. </li><li> Isırık bar üzerine ağız güvence ve kulak çubukları güvence altına alarak bir stereotaksik aparat sıçan yerleştirin. </li><li> Kesi öncesinde cerrahi siteye göz gözler için yağlayıcı ve betadin uygulayın. </li></ol></li><li> Gözleri kaudal yaklaşık 2 mm başlangıç ​​kafatasının dorsal yüzeyi üzerinde bir deri 2.4 cm&#39;lik orta hat kesi olun. Kafatası açığa çıkarmak için cildi çekin. Periyodik kurumasını önlemek için dokuların cerrahi sitenin marjları üzerinde steril% 0.9 steril tuzlu su aşılamak. </li><li> Bregma ve lambda kadar kafatası temizle membranöz doku açıkça görülebilir. </li><li> Kafatası dorsal-ventral koordinatları ölçerek düzeyi olduğundan emin olunBregma ve lambda de. Bregma ve lambda dorsal-ventral koordinatlar fazla 0.04 mm farklılık kadar buna göre stereotaksik cihaz ayarlayın. </li><li> Şu anda,% 2 ila 2.5 izofluran gazı azaltır. </li><li> Koordinatlar rezero, bregma matkap dönün ve sonra istenen medial-lateral için matkap taşımak ve ön-arka koordinat. </li><li> Bir delik delin bir 28 G infüzyon şırınga için uygun bir boyut deliği üreten bir 0.9 mm matkap ucu kullanarak koordinat. </li><li> 0.2 ul / dakikalık bir oranda virüs sunmak için infüzyon pompası olarak ayarlayın. Stereotaksik cihazın infüzyon koluna şırınga yerleştirin ve koordine istenen içine şırınga indirin. Virüs istenen miktarda (0.1 ul 0.8 arasındadır). Örneğin, 4 dakika boyunca AAV 0.8 ul sağlar. Not: İdeal infüzyon hacmi ve ilgi her bölgede virüsün yayılmasını tipik belirlemek için pilot çalışmalar yapmak. <ol><li> Virüsün teslim eş sonra10 dk iğne yolu içine geri akmasını önlemek için mplete yerinde şırınga bırakın. Yavaşça yaklaşık 5 mm / dakikalık bir oranda bir şırınga kaldırın. Tüm koordinatları AAV ile aşılanmış edilene kadar tekrarlayın. </li></ol></li><li> Cerrahi zımba ve kat topikal antibiyotik merhem ile yara yara kullanarak kapatın. </li><li> Post-operatif ağrı yönetimi için kurumsal yönergeleri izleyin. </li><li> Yatak, bir kapak ve uygun tabela ile bir kafeste sıçan yerleştirin ve hayvan tesis sıçan dönün. <ol><li> BSL-2 önlemler altında çalışan ise, kurumsal kurallar tarafından belirlenen süre (genellikle 48-72 saat) için yatak toplamak. Bir biyolojik tehlikeli atık kabına yatak yerleştirin. </li><li> Güvenli bertarafı için kurallar tarafından belirtilen tüm AAV-kontamine malzemelerin imha ediniz. </li></ol></li></ol> 3. Davranış Aparatı Not: duyusal ön şartlandırma cihazı, standart edimsel koşullanma cham oluşurber paslanmaz çelik ızgara zemin ile (12 &quot;L x 9.5&quot; W x 11.5 &quot;H), 2 pleksiglas yanaklar ve 2 metal duvarlar. <ol><li> 2 Hz parladı zaman görsel uyaranın ev ışık olarak hizmet alüminyum duvarlarının birinde ve bir 2.8 W ışık monte edin. Işitsel uyaranlara teslim odasının bir hoparlör monte (10 sn, 1500 Hz, 78 dB saf ses ve 10 sn 78 dB beyaz gürültü). <ol><li> Gıda kap içine 45 mg gıda pelet teslim etmek için bir gıda hazneyi kullanın. Gıda fincan içinde, kızılötesi fotoseller sırasında ve uyaranlara ve gıda ödülleri sunumların ardından, daha önce gıda fincan harcanan toplam zamanı algılar. </li><li> Ev egzoz hayranları ile donatılmış ses azaltıcı dolapları odaları (22 &quot;W x 22&quot; H x 16 &quot;D) (~ 68 dB). </li><li> Veri edimsel odasına kontrol etmek ve elde etmek için Med Associates yazılım ile PC bilgisayar kullanın. Klima oturumları sırasında, presenta sırasında gıda fincan kafa ile harcanan toplam zaman hakkında veri toplamakIşık uyarıcı (5 sn çağında) ve tion ve gıda ödül (5 sn çağı) sunumu sırasında. Deney oturumu sırasında, (işitsel uyaranlar sonlandırılır 10 sn dönem başında) işitsel uyaranların sunum tepki olarak gıda fincan harcanan toplam zaman hakkında veri toplamak. </li></ol></li></ol> Duyu Önkoşullama Paradigma 4. Bakış <ol><li> Ameliyatın sonra, yavaş yavaş gıda serbestçe beslendikleri vücut ağırlığının% 85 sıçan sınırlar. Uygun bir yiyecek kısıtlaması paradigma için veteriner personel danışın. Not: 3-faz duyusal ön şartlandırma paradigması, Şekil 2&#39;de tasvir edilmiştir. </li><li> Önkoşullama Sessions (Faz 1; Günlük 64 dakika eğitimler 4 gün üst üste genelinde yürütülen): <ol><li> Işitsel ve görsel uyaranlara teslim oluşan 12 karışmış çalışmalar ile mevcut sıçanlar. Arası deneme aralıkları dahil her a sonra ortalama 4.5 dakika (aralık 4,0 dk 5,0) olduğunuuditory sunumu. </li><li> 10 saniye boyunca denemeler, mevcut bir ton (ön şartlandırılmış uyaran) ile 6 günü, yanıp sönen ışık uyaran bir 5 sn sunumu hemen ardından. </li><li> Diğer 6 çalışmalarda üzerinde 10 saniye boyunca yalnız beyaz gürültü (eşleşmemiş uyaran) sunuyoruz. </li></ol></li><li> Klima oturumları (Faz 2, 5 ardışık gün boyunca yapılan günlük 64 dk eğitimler): <ol><li> 5 saniye görsel uyaranın (yanıp sönen ışık uyaran) teslim oluşur 8 çalışmalar ile mevcut sıçan iki 45 mg gıda pelet teslim hemen ardından. Arası deneme aralıkları dahil her yargılamadan sonra ortalama 7 dakika (aralık 6.0 dk 8.0). Bazen fareler hafif yiyecekler dernek öğrenmek için 5&#39;ten fazla klima oturumları gerektirir. </li></ol></li><li> Deney Session (Faz 3; tek 78 dakika oturumu): <ol><li> Yalnız işitsel uyaranların teslim oluşan 12 karışmış çalışmalar ile sıçan sunun. Ave arası deneme aralıkları dahilöfke 4.5 dakika (aralık 4,0 dk 5.0) Her işitsel sunumdan sonra. </li><li> Çalışmaların, 6, 10 saniye boyunca tek başına ton uyaran (ön şartlandırılmış uyaran) sunuyoruz. </li><li> Diğer 6 çalışmalarda üzerinde 10 saniye boyunca yalnız beyaz gürültü (eşleşmemiş uyaran) sunuyoruz. </li></ol></li><li> Şartlandırılarak uyarıcı olarak beyaz gürültü ve eşleşmemiş uyarıcı olarak sesi almak sıçanların ikinci seti ile çalışmayı tamamlayarak uyaranlara dengelemek. </li></ol> 5. Farmakolojik ve Davranış Prosedürü <ol><li> Davranışsal alete güç açın ve uygun davranış oturumu için Med-PC kodunu yükleyin. Tel ve programın davranış cihaz ses zayıflatma dolapları monte edilmiş fanları güç açıldığında açın böyle. </li><li> Klozapin, N-oksit (CNO) bir 1 mg / ml çözelti hazırlamak için, 15 ml konik bir tüp içine CNO 5.0 mg ağırlığında ve steril% 0.9 SalI 5 steril su ml ya da 5 mlne. Çözelti kadar Vortex açıktır. <ol><li> CNO çözeltisi içine çözülmez veya CNO daha konsantre çözeltiler, örneğin DMSO 23 gibi çözündürücü bir ajan eklemek istendiğinde. Spesifik olarak,% 0.5 DMSO ile CNO bir 1 mg / ml çözelti hazırlamak CNO 5.0 mg ağırlığında ve 15 ml konik tüp DMSO 25 ul ekleyin. Fiske yavaşça içeriği tüpün tabanında kalmasını sağlamaktır. Çözelti berraklaştığında, steril su 5 ml ya da steril% 0.9 tuzlu su içinde 5 ml ekleyin. CNO çözeltilerini hazırlamak için ayrıntılı talimatlar DREADD wiki kaynak sayfa 25 mevcuttur. </li><li> Uygulandığı her gün yeni CNO çözeltisi hazırlayın. </li></ol></li><li> 1 mg dozunda intraperitonal olarak enjekte edilir CNO / yaklaşık 30 dakika önce davranış testi kg. Örneğin, 1 mg / ml CNO çözeltisi 0.2 ml ile 200 g sıçan enjekte edilir. CNO yönetiminin dozu ve zamanı ders önce yayınlanan raporlara 2,12 dayanarak seçildi.<ol><li> (Faz 1, enjeksiyonların 4 gün toplam) her ön hazırlık oturumu öncesinde CNO 30 dakika enjekte ama tüm sonraki davranış oturumlar öncesinde araç yönetmek. </li></ol></li><li> 30 dakika sonra, davranış testi odalarına sıçanlar yer ve uygun davranış oturumu için bir bilgisayar kodu başlatır. </li><li> Davranışsal görevin tamamlanmasının ardından hemen odalarından fareler kaldırmak ve hayvan koloni sıçanları dönün. </li></ol> Davranış Verilerin 6. Analizleri Not: Tüm davranışsal oturumlar için bağımlı değişken gıda fincan kızılötesi fotosel kesintisi ile tespit edilen sıçan kafası gıda fincan içinde olan süredir. (sn) veriler toplandı ve bilgisayar yazılımı tarafından kaydedilir. <ol><li> Davranış etmeyin Preconditioning aşamasında üretilen veriler üzerinde analiz eder. </li><li> Klima oturumları için: Her farelerin a analizbility 5 davranışsal seans boyunca görsel uyaranın sunumu sırasında gıda fincan davranışını karşılaştırarak hafif yiyecekler dernek öğrenmek için. Özellikle, / oturum 8 çalışmaların her biri için 5 sn ışık çağında sırasında gıda fincan harcanan ortalama zamanı hesaplamak (yani, süresi / sıçan her 5 sn 8 çalışmaların ortalama). Ortalama kontrol ve 5 günlük oturumlar her biri için deneysel değerleri (Şekil 3A bakınız) öneririz. <ol><li> Yukarıdaki 5 saniye ışık yılı için belirlenen aynı hesaplama ile 5 davranışsal oturumları arasında gıda ödül (5 sn çağı) teslimi sırasında gıda fincan davranışını karşılaştırarak gıda ödül elde etmek için farelerin motivasyonunu analiz edin. Bu değerler, görsel uyaranın sunumu sırasında edinilen daha tutarlı yüksek olacaktır (Şekil 3B). </li></ol></li><li> Test oturumu için: pres yanıt farelerin yiyecek fincan davranışını açıklayan bir ayrımcılık oranını hesaplamakHer işitsel uyaran entations. <ol><li> Özellikle, her sıçan için, 6 sunumlar her Aşağıdaki gıda fincan harcanan ortalama süre toplamına duyusal koşullanan uyaran 6 sunumlar (yani, sesi) her Aşağıdaki gıda fincan harcanan ortalama süre bölmek duyusal ön şartlandırılmış uyaran (örneğin, ton uyaran) artı eşleştirilmemiş uyaran (yani, beyaz gürültü uyarıcı) 6 sunumlar her Aşağıdaki gıda fincan harcanan toplam süre ortalama. Her dönem süresi 10 saniyedir. Not: 0.5 veya daha büyük bir ayrımcılık puanı sıçan duyusal önkoşullanma paradigma doğasında dernekleri öğrendiğini göstermektedir. </li></ol></li></ol> AAV Yerleştirme ve İfade 7. Doğrulama <ol><li> Uyutmak ve transcardially% 4 paraformaldehid kullanarak sıçan serpmek. Nedeniyle floresan etiketlerin kullanılması, min 2 saat bir post-fiksasyon süresini aşmamakhadde indirgenmesi kaybı antijenisite ve flüoresan sinyal korumak için. </li><li> 2 günlük bir minimum ya da beyin, beyin kavanozun dibine batar dek fosfat tamponlu tuzlu su (1x) ve% 20 sukroz çözeltisi 30 ml ihtiva eden bir beyin kavanoz içine aktarılması ile perfüze beyinleri kurutmak. </li><li> Ilgili bölgenin tamamını rostro tamamı boyunca koronal beyin kesitleri (20-40 um) yapmak için, bir donma kayar mikrotom kullanın. </li><li> Tasarımcı reseptörü ve / veya muhabir 12 konumunu ve ifadesini anlamak için etiketli reseptör veya raportör proteine ​​yönelik immunhistokimya yürütün. Bir immünohistokimya boyama protokolü DREADD wiki kaynak sayfa 25 sağlanır. </li><li> Sulu montaj orta 100-200 ul kullanarak SuperFrost-artı slaytlar ve lamel üzerine bölümleri monte edin. </li><li> AAV yerleştirme ve protein ifadesini 12,24 doğrulamak için beyin dokusu üzerinde floresan mikroskobu gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G-protein+coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li>
<li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+%28Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs%29%3A+Chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.Toxicol%22%5BJournal%5D)">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).</li>
<li>Weiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+M1+muscarinic+receptor+agonism+of+N-desmethylclozapine+in+the+unique+clinical+effects+of+clozapine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharm.+%28Berl%22%5BJournal%5D)">The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine.</a> Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).</li>
<li>Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+NJ+%22amnesia+and+the+hippocampal+system%22">amnesia and the hippocampal system</a>. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).</li>
<li>Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+memory%3A+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network).</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).</li>
<li>Agster, K. L., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+efferents+of+the+perirhinal%2C+postrhinal+and+entorhinal+cortices+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat.</a> Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).</li>
<li>Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+anatomical+systems+embedded+within+the+primate+medial+temporal+lobe%3A+implications+for+hippocampal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).</li>
<li>Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functional+circuitry+between+retrosplenial+and+postrhinal+cortices+during+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning.</a> J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).</li>
<li>Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticohippocampal+contributions+to+spatial+and+contextual+learning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning.</a> J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).</li>
<li>Kaut, K. P., Bunsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+lesions+to+the+rat+hippocampus+or+rhinal+cortex+on+olfactory+and+spatial+memory%3A+retrograde+and+anterograde+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Cogn.+Affect.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings.</a> Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).</li>
<li>Brogden, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Psychol%22%5BJournal%5D)">Sensory preconditioning.</a> J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).</li>
<li>Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+silencing+of+neurons+in+retrosplenial+cortex+disrupts+sensory+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning.</a> J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+guidelines+for+research+involving+recombinant+or+synthetic+nucleic+acid+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Available+from%3A+http%3A%2F%2Foba.od.nih.gov%2Frdna%2Fnih_guidelines_oba.html%22%5BJournal%5D)">NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules.</a> Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).</li>
<li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Virol%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).</li>
<li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Gene Ther. 3, 545-565 (2003).</li>
<li>Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-2+%28AAV-2%29+causes+trophoblast+dysfunction%2C+and+placental+AAV-2+infection+is+associated+with+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Path%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia.</a> Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).</li>
<li>Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+in+testicular+tissue+and+in+abnormal+semen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples.</a> Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).</li>
<li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vector+integration+sites+in+mouse+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma.</a> Science. 317 (5837), 477-47 (2007).</li>
<li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li>
<li>Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression+of+Pctk1%2C+Tcf12+and+Ccnd+in+hippocampus+of+rats%3A+impact+on+cognitive+function%2C+synaptic+plasticity+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and.</a> 97 (1), 69-80 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Academy+Press.+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22National+Academy+Press%22%5BJournal%5D)">National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> National Academy Press. , Washington, DC. (1996).</li>
<li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Cavaletti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+in+the+peripheral+nervous+system+of+systemically+administered+dimethylsulfoxide+in+the+rat%3A+a+neurophysiological+and+pathological%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological.</a> 119 (1-2), 1-2 (2000).</li>
<li>Parnaudeau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediodorsal+thalamus+hypofunction+impairs+flexible+goal-directed+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior.</a> Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).</li>
<li>wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).</li>
<li>Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-pathway+striatal+neurons+regulate+the+retention+of+decision-making+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies.</a> J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).</li>
<li>Cassatarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+pharmacogenetic+modulation+of+the+nucleus+accumbens+reduces+ethanol+consumption+in+a+limited+access+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharm%22%5BJournal%5D)">Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm.</a> Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).</li>
<li>Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+versus+delayed+stimulation+of+feeding+by+the+endogenously+released+AgRP+neuron+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22GABA%2C+NPY+and+AgRP.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators.</a> GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).</li>
<li>Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlates+of+compensatory+collateral+sprouting+by+aminergic+and+cholinergic+afferents+in+the+hippocampal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation.</a> Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).</li>
<li>Nelson, R. J., Young, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+in+mice+with+targeted+disruption+of+single+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Behavior in mice with targeted disruption of single genes.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu protokol, belirli bir beyin bölgesi çok fazlı karmaşık öğrenme görevi nasıl katkıda araştırmak için bir farmakogenetik yaklaşım (DREADD) uygulamak açıklamaktadır. Geçici ve uzaktan öğrenme aşamalarında farklı beyin bölgelerinde nöral aktiviteyi susturmak için yeteneği ile, yaklaşımların bu kombinasyon öğrenmenin daha nüanslı ve maskeli formları dahil olmak üzere davranışları geniş bir yelpazede, araştırmak için bir platform sağlar. Bu protokol açıklanan örnekte, retrosplenial korteks (RSC) tasarımcı reseptörü ifade s...

Davranışsal nörobilim alanında heyecan verici bir meydan okuma, karmaşık davranışlar nöral substratlar belirlemektir. Böyle kalıcı lezyonlar, kanüller implantlar yoluyla geçici beyin inaktivasyonu ve optogenetics olarak bir dizi teknik, karmaşık davranışlar alt bileşenleri ayrık beyin bölgelerinin katkıları belirlemek için kullanılmıştır. Bu yaklaşımlar öğrenme sırasında bölgesel özgüllük anlayışımızı haberdar ederken, her teknik sınırlamaları olmadan değildir. Özellikle kalıcı lezyonlar genellikle böylece etkileri paradigma süresince mevcut, davranış testi öncesinde yapılmaktadır. Beyin dokusunda önemli bir hasar üretebilir kısa süreli sinir inaktivatör (örneğin, tetrodotoxin) sunumunu içeren ve hemen önce davranışsal test konularda strese neden olabilir kanülasyon çalışmaları. Bundan başka, kanülasyon yoluyla etkisiz hale getirilmesi çevreleyen doku bölgesi ile sınırlıdırkanül ucu. Optogenetics spesifik beyin bölgelerinde aktivitesi zamansal kontrolü için bir esneklik sunar ise Son olarak, bu maliyetlidir ve teknik olarak zor olduğu. Bu sınırlamalar bir farmakogenetik yaklaşım (Tasarımcı-Reseptörler-Münhasıran-Aktif-by-Designer-İlaçlar, DREADDs) 1,2 kullanılarak aşılabilir. Farmakogenetik kavramı gelişmiş iken önemlisi, tekniğin yürütme basittir. Bir tadil edilmiş inhibitör G-proteine ​​akuple bir reseptör için bir DNA fragmanını içeren bir toksin (örneğin, NMDA, ibotenik asit) ayn beyin bölgeleri içine, bu teknik, bir adeno-bağlantılı virüs (AAV) infüzyonu içerir infüzyonu içeren geleneksel bir stereotaksik cerrahi yöntemlere benzer (hM4Di; tasarımcı reseptörü) standart laboratuar kemirgenler ilgi bölgeye (Şekil 1). viral vektör, bir floresan haberci (mcitrine) içerir. Dahil kezhücrelere, tasarımcı reseptörü (ve raportör protein) maksimum ~ 3 hafta sonra infüzyon ifade edilir ve seçici olarak, aksi biyolojik olarak eylemsiz tasarım ilacın sistemik olarak uygulanması, klozapin-N-oksit ile 2-5 st için aktive edilebilir (CNO) 1 3. Deneyci, belirli beyin bölgelerinde nöral aktivitenin üzerinde kesin, ancak uzaktan kumanda zamansal sahip olduğundan, farmakogenetik birden aşamalarda yürütülen davranışsal paradigmalar ile özellikle de birleştirir. Bu örnekte, retrosplenial korteks katkısı (RSC) uyaran-uyaran öğrenme Pavlov öğrenmedeki rolü ile karşılaştırıldığında, ancak yaklaşımların bu kombinasyon beyin bölgelerinin nasıl katkıda özgü tespit etmeye sorulardan herhangi bir sayı için uygundur Karmaşık davranış. Bu protokolde tarif edilmemiş ise ek olarak, viral ve transjenik yaklaşımlar hücre tipine spesifik DREADD ifade 2 elde etmek için kullanılabilir. IDREADD yaklaşımı kullanıldığında s doğasında deneysel manipülasyonlar, deneysel tasarım ve sonraki kantitatif analiz dikkatli dikkate farmakolojik ve / veya diğer türde içeren davranışsal paradigmalar gereklidir. DREADD yaklaşım yeni Deneyciler mevcut DREADD teknolojisi 2 kapsamlı bir inceleme adlandırılır. Her gün, organizmalar yeni uyaranlara ve olayları ve birbirlerine olan ilişkileri hakkında bilgi edinin. Hatta tanıdık bir ortamda, örneğin ev, biri bu değişikliklerin anlamlı olayların tahmin olabilir, çünkü uyaranlara arasındaki ilişkilerde değişiklikler tespit etmek hızlıdır. Böyle bir uyaran-uyaran (örneğin, ilişkisel) öğrenme birden uyaranların conjoining içerir ve geleneksel medial temporal lobda 4 içinde merkezi bulunduğu hipokampus ile ilişkili olmuştur. Ancak, hipokampus var, ne de tek başına hareket etmez; içinde ve dışında hem kortikal bölgelermedial temporal lob yan hipokampal formasyon 5-7 kritik duyusal bilgi sağlar. Geleneksel kalıcı lezyon çalışmaları hipokampus bağımlı öğrenme kortikal bölgelere (örneğin, retrosplenial postrhinal ve entorinal korteks) bir dizi katılımı için ikna edici bir kanıt sağlar, ancak ayrı aşamalarında belirli bir bölgede rolünü ayırt etme yeteneği sınırlıdır 8-10 öğrenme. Mevcut protokol RSC 3 fazlı duyusal önkoşullamasının paradigma 11,12 tek bir aşamasında RSC susturma yoluyla uyaran-uyaran öğrenme için gerekli olan hipotezini test eder. Kısaca, sıçanlar tasarım reseptörü içerir ve ~ 3 hafta sonra davranış testleri başlamadan önce tasarım madde (CNO) 30 dakika süresince verilir bir AAV infüzyonu yapılan. Mevcut protokolde, deneysel fareler test ilk aşamasında (uyarıcı-uyarıcı lear sırasında CNO alıyorsunuzning oluşur) ve test sonraki 2 aşamalarında aracı alırsınız. Davranışına CNO yanlışlıkla etkilerini kontrol etmek için, tasarım reseptörü (hM4Di) farelere süzülür ve bunun yerine CNO bir araç ile enjekte edilir. Viral infüzyon ve reseptör ifadesinin genel etkileri hesaba katmak için, tasarımcı reseptörü içeren ve CNO yönetmek değil bir kontrol virüsü demlenmeye. AAV, farklı serotiplerin çok sayıda genetik bir malzeme uygulamak üzere kullanılır. rekombinant veya sentetik moleküllerini içeren Araştırma mevcut NIH Kılavuzu transgen potansiyel tümörijenik gen ürünü ya da bir toksin molekülü ya da kodlamak etmez ve yokluğunda üretildiği bu AAV (bütün serotipler) ve rekombinant ya da sentetik AAV yapıları korur Yardımcı virüs, BSL-1 önlemler (Ek B-1. Risk Grubu 1 (RG1) Acenteleri) 13 gerektirir. AAV yapısı, programı ve güvenlik ile ilgili yorumunun sayısı 14,15 mevcuttur. Özellikle, olsaAAV ile çalışırken, kemirgenlerde muhtemel üreme 16,17 ve potansiyel kanserojen mekanizmalar 18-20 ilişkin endişeler nedeniyle, bazı kurumlar BSL-2 önlemlerin kullanılmasını gerektirir. Araştırma Hastalık Kontrol ve ABD&#39;de gen manipülasyonu için viral vektörler kullanılırken Rekombinant DNA Moleküller 13 İçeren Araştırma NIH Rehberi için, Merkezleri yapılacaktır bireysel kurumlarında gözetim komiteleri ile danışarak kullanımdan önce uygun BSL doğrulayın. Kişisel korunma, araştırmacı eğitimi, vektör çevreleme, dekontaminasyon, dekontamine malzemelerin imhası ve enjeksiyon sonrası hayvan barınağı gereksinimleri bu yönergelere göre belirlenir. Buna ek olarak, danışmak ve uygun Kurumsal Hayvan Bakım izleyin ve güvenli kullanım, yönetim ve AAV&#39;nin bertarafını sağlamak için komite kurallarına veya eşdeğer kurumsal gözetim komitesi yönergeleri kullanın.

<table><tbody><tr><td>Erkek, Uzun Evans Sıçanları, 55-60 günlük</td><td>Hilltop Lab Animals Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine</td><td>Virüsü Vektör Çekirdeği</td><td></td><td>Dikkat: Bu bir BSL-1 bileşiği</td></tr><tr><td>rAAV8/hSyn-GFP</td><td>Virüs Vektör Çekirdeğidir</td><td></td><td>Dikkat: Bu bir BSL-1 bileşiği</td></tr><tr><td>Klozapin-N-oksit</td><td>R& D Systems</td><td>4936-10</td><td>Tasarımcı ilaç</td></tr><tr><td>Sıçan Kafesi kapağı (polikarbonat)</td><td>Alternatif Tasarım&nbsp;</td><td>FT 8XL-PC</td><td>İnfüzyondan 48-72 saat sonra hayvan kafeslerini örtmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı (değiştirme)</td><td>Alternatif Tasarım</td><td>FP-R-1018XAD</td><td>Kafes kapaklarıyla birlikte gelen filtre kağıdı</td></tr><tr><td>Masa üstü mengene</td><td>JETS</td><td>2201-265</td><td>AAV içeren mikrosantrifüj tüplerini davlumbazda tutmak için</td></tr><tr><td>Biyolojik tehlike çöp torbaları</td><td>Zımbalar</td><td>113444</td><td>Medline biyolojik tehlike gömlekleri</td></tr><tr><td>Biyolojik tehlike çöp kutusu</td><td></td><td></td> Amazon.com <td>United Solutions 34 galonluk dikdörtgen tekerlekli çöp tenekesi, kanca ve kilit saplı</td></tr><tr><td>Isoflurane, 100 ml</td><td>Patterson Veteriner Malzemeleri A.Ş.</td><td>07-890-8540</td><td>Anestezik</td></tr><tr><td>Dijital ekranlı çift küçük hayvan stereotaksik okuma konsolu</td><td>David Kopf</td><td>Model 942</td><td>Cerrahi ekipman</td></tr><tr><td>Yırtılmayan kulak çubukları, 2'li set (sıçan)</td><td>David Kopf</td><td>Model 955</td><td>Cerrahi ekipman</td></tr><tr><td>Anestezi maskesi (sıçan)</td><td>David Kopf</td><td>Model 906</td><td>Cerrahi ekipman</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı stereotaksik matkap, masa üstü motor kontrolörü, ayak pedalı, el aleti, stereotaksik başlık tutucusu içerir</td><td>David Kopf</td><td>Model 1474</td><td>Cerrahi ekipman</td></tr><tr><td>Mikro matkap çapakları, 0,9 mm</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>19007-09</td><td>Cerrahi malzeme</td></tr><tr><td>Micro4 denetleyicili otomatik şırınga pompası</td><td>David Kopf</td><td>Model UMP3-1</td><td>Cerrahi ekipman</td></tr><tr><td>Pro-animal çıkarılabilir seramik bıçak kesme kiti</td><td>Ahdis</td><td>21420</td><td>Cerrahi malzeme</td></tr><tr><td>Betadine cilt temizleyici</td><td>Perdue Products L.P</td><td>67618-149-04</td><td>Cerrahi malzeme</td></tr><tr><td>Üçlü antibiyotik merhem</td><td>Medline Supply</td><td>53329-087-01</td><td>Cerrahi malzeme</td></tr><tr><td>Puralube veteriner merhem</td><td>Sadece Veteriner Kaynağı</td><td>17033-211-38</td><td>Cerrahi malzeme</td></tr><tr><td>Dino-lite</td><td>Mikroskop</td><td>AD7013MTL</td><td>Geleneksel diseksiyon kapsamına bir alternatif</td></tr><tr><td>Dino-lite sert masa üstü bom standı</td><td>Mikroskop</td><td>MS36B</td><td>Cerrahi ekipman</td></tr><tr><td>28 G 10 & mu; l şırınga</td><td>Hamilton</td><td>80308-701SN</td><td>Cerrahi ekipman</td></tr><tr><td>Ekstra uzun MDF ses azaltma kabini</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-018MD</td><td>22 'G x 22" Y x 16 " D</td></tr><tr><td>Ekstra uzun modüler test odası</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-007</td><td>Davranışsal ekipman</td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik ızgara zemin</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-005</td><td>Davranışsal ekipman</td></tr><tr><td>Ev ışığı</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-215M</td><td>Ev ışığı ve uyaran ışığı olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Modüler pelet dağıtıcı</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-203M-45</td><td>Davranışsal ekipman</td></tr><tr><td>Pelet haznesi, fincan tipi</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-200R1M</td><td>Davranışsal ekipman</td></tr><tr><td>Sıçan Med Associates, Inc</td><td>için kafa giriş dedektörü</td><td>ENV-254-CB</td><td>Davranışsal ekipman</td></tr><tr><td>Tozsuz hassas gıda peletleri, 45 mg</td><td>Bio-Serv</td><td>F0165</td><td>Davranışsal tedarik</td></tr><tr><td>Sıçan odası için kafes hoparlörü</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-224AM</td><td>Davranışsal ekipman</td></tr><tr><td>Programlanabilir ses üreteci</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ANL-926</td><td>Davranışsal ekipman</td></tr><tr><td>Akıllı ctrl 8 giriş/16 çıkış paketi</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-716P2</td><td>Davranışsal ekipman</td></tr><tr><td>Büyük masa üstü dolap ve güç kaynağı</td><td>Med Associates, Inc</td><td>SG-6510D</td><td>Davranışsal ekipman</td></tr><tr><td>PCI arayüz paketi</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-700P2-R2</td><td>Davranışsal ekipman</td></tr><tr><td>MED X Pro 19" monitörlü Intel çekirdek bilgisayar paketi</td><td>Med Associates, Inc</td><td>COM-103V</td><td>Davranışsal ekipman</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (granül), 1 kg</td><td>Elektron Mikrosopisi Bilimler</td><td>19210</td><td>Tehlike: kanserojen, davlumbazda tartın</td></tr><tr><td>Tavşan monoklonal antikoru (HA-Tag)</td><td>Hücre Sinyalleme Teknolojileri</td><td>3724S</td><td>Histoloji reaktifi</td></tr><tr><td>XP Tavşan monoklonal antikoru (GFP)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>2956S</td><td>Histoloji reaktifi</td></tr><tr><td>Anti-tavşan IgG</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>4412S</td><td>Histology,</td></tr><tr><td>Superfrost artı slaytlar sağlar</td><td>VWR uluslararası</td><td>483111-703</td><td>Histoloji malzemeleri</td></tr></tbody></table>

Öğrenmenin ayrık aşama sırasında kemirgenler uzaktan suskunluğu sinir aktivitesi bir yöntem

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

Bu protokol hayvanların öğrenme ve bellek işlerle meşgul iken geçici ve uzaktan ayrık beyin bölgelerinde nöronal aktivitenin susturmak açıklamaktadır. yaklaşım birleştiren farmakogenetik (Tasarımcı-Reseptörler-Münhasıran-Aktif-by-Designer-İlaçlar) bir davranış paradigma (duyusal önkoşullama) ile öğrenmenin farklı biçimlerde ayırt üzere tasarlanmıştır. Spesifik olarak, viral kaynaklı dağıtım, bir genetik olarak tadil edilmiş inhibe edici G-protein bağlı reseptör kemirgen içinde ayrı bir beyin bölgesine (tasarımcı Reseptör) ifade etmek için kullanılır. Tasarımcı reseptör ekspresyon düzeyleri yüksek olduğunda Üç hafta sonra, bir farmakolojik ajan (Tasarımcı İlaç) önce belirli bir davranış oturuma sistemik 30 dakika uygulanır. ilaç tasarım reseptörü için afiniteye sahiptir ve bu nedenle tasarım reseptörünü eksprese eden nöronların inhibisyonu ile sonuçlanır, ancak aksi takdirde, biyolojik olarak inerttir. beyin bölgesi (2-5 saat susturulmuş vin kalırding) doz ve uygulama yoluna. Davranışsal paradigmanın tamamlayan beyin dokusu doğru yerleştirme ve reseptör ifadesi için değerlendirilir. Bu yaklaşım, davranış belirli bileşenleri tek tek beyin bölgelerinin katkı belirlenmesi ve davranışsal paradigmaların bir dizi boyunca kullanılabilir için özellikle yararlıdır.

Davranış Sonuçlar Deneyin tamamlanması üzerine, bölgeye özgü geçici inaktive etkinliği nicel ve nitel olarak değerlendirilmelidir. Mevcut örnek CNO RSC nötr uyarıcılara 12 arasında dernek oluşumu için gerekli olan hipotezini test etmek Preconditioning oturumları sırasında RSC nöral aktiviteyi azaltmak için uygulanan edildiği bir 3 fazlı davranışsal paradigma (duyusal önşartlama), içerir. Önemli olarak, deneyi davranış paradigma ya farmakogenetik yaklaşım en davranışsal modeller ile b...

Bu protokol, fareler öğrenme ve hafıza görevleriyle meşgulken ayrı beyin bölgelerindeki nöronal aktivitenin geçici olarak ve uzaktan nasıl susturulacağını açıklar. Yaklaşım, farmakogenetiği (Tasarımcı-Reseptörler-Özel-Tasarımcı-Tarafından-Aktive Edilen-İlaçlar), öğrenmenin farklı bileşenlerini ayırt etmek için tasarlanmış davranışsal bir paradigma (duyusal ön koşullandırma) ile birleştirir.

Öğrenmenin Ayrık Aşama sırasında Kemirgenler uzaktan suskunluğu Sinir Aktivitesi Bir Yöntem

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

Bu prosedürün amacı, hayvanlar öğrenme ve bellek görevleri ile meşgulken, beynin belirli bölgelerindeki nöronal aktiviteyi geçici ve uzaktan susturmaktır. Bu işlem, öncelikle tasarımcı bir reseptör ve bir raporlayıcı içeren bir a a V'nin infüzyon için bir şırıngaya doldürülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, a a V'nin sıçan beynindeki ilgili bölgeye infüze edilmesidir.Ardından, biyolojik olarak inert tasarım ilacı klozapin ve oksit hazırlanır ve sıçana sistemik olarak enjekte edilir. Son adım, duyusal ön koşullandırma paradigması kullanılarak davranışsal testlerin gerçekleştirilmesidir. Nihayetinde, tasarım reseptörünün yerleşimini doğrulamak için sıçan beyin dokusu üzerinde immünofloresan mikroskopi uygulanır.Bu yöntem, motivasyon, dikkat, öğrenme ve belleğin düzenlenmesi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere davranışsal nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Adeno-ilişkili virüslerle çalışma konusundaki tüm kurumsal önlemlerin uygulandığından emin olun; bu videoda kullanılan virüs, biyogüvenlik seviyesi bir bileşik olarak sınıflandırılmıştır. %10'luk bir çamaşır suyu çözeltisi hazırlayın. AV atıklarını dekontamine etmek için, çamaşır suyu çözeltisi içeren bir beher ve steril 10 µL'lik bir şırınga hazırlayın.Çalışma alanında, bir alikot A v içeren mikro santrifüj tüpünü standart bir tezgah mengenesine yerleştirin. 10 µL'lik bir şırıngayı en az 4 µL A v ile doldurun. 4 µL'lik A v çözeltisinde hava kabarcığı olmadığından emin olun. Şırıngadan sonra, boş virüs tüpünü %10 çamaşır suyu içeren bekere atın.Atık kabına ek olarak %10 çamaşır suyu ekleyin ve dekontamine edilmiş sıvı atıkları kurumsal kılavuzlarda belirtildiği şekilde bertaraf etmeden önce atığın 30 dakika boyunca beklemesine izin verin. Stereotaksik aparatın altına ve özel virüs uygulama alanı olarak belirlenmiş yan bölgeye emici tezgah kağıdı yerleştirerek cerrahi alanı hazırlayın. Anestezi indüksiyonu %3 isofloran ve dakikada bir litre hızında oksijen ile gerçekleştirilmiştir.Gözlerin arasından kulakların hafifçe arkasına kadar olan bölgedeki tüyler tıraşlandı. Tıraş işleminden sonra, stereotaksik aparatla sabitlenen sıçan, indüksiyon odasında üç dakika boyunca tutuldu. Gözler oftalmik pomad ile kapatıldı ve insizyon bölgesi Betadine ile temizlenerek hazır hale getirildi.Gözlerin yaklaşık iki milimetre kordalından başlayarak, kafatasının üzerindeki deri boyunca 2,4 santimetrelik bir orta hat insizyonu yaptıktan sonra, kafatasını açığa çıkarmak için deriyi geri çekin ve ardından bgma ve lambda net bir şekilde görünene kadar kafatasındaki membranöz dokuları temizleyin. Kafatasının düz olduğundan emin olduktan sonra, matkabı bgma konumuna getirin, koordinatları sıfırlayın ve ardından matkabı istenen medial, lateral ve anterior posterior koordinatlara taşıyın. 0,9, 0,7 veya 0,5 milimetrelik bir matkap ucu kullanarak bir delik açın.İnfüzyon pompasını dakikada 0.2 µL hızda virüs iletecek şekilde ayarlayın. Şırıngayı stereotaksik cihazın infüzyon koluna yerleştirin ve şırıngayı istenen koordinata indirin. Virüs iletimi tamamlandıktan sonra, istenen miktardaki virüsü iletmek için pompayı kullanın.İğne yolundan geri akışı önlemek için şırıngayı 10 dakika boyunca yerinde bırakın, ardından şırıngayı dakikada yaklaşık beş milimetre hızla yavaşça yukarı kaldırın. Daha sonra bir sonraki koordinata geçin ve tüm koordinatlara infüzyon yapılana kadar prosedürü tekrarlayın. Yarayı kapattıktan ve onaylanmış protokole göre postoperatif analjezi sağladıktan sonra, sıçanı altlığı, kapağı ve uygun işaretlemesi olan temiz bir kafese yerleştirin.Sıçan anesteziden tamamen kurtulduğunda, onu barınma odasına geri götürün. Tasarım reseptörünün yeterli düzeyde eksprese olduğundan emin olmak için davranışsal testlere başlamadan önce üç veya daha fazla hafta bekleyin. Bu şekil; ön koşullandırma evresi, koşullandırma evresi ve test evresi olmak üzere duyusal ön koşullandırma paradigmasının üç aşamasını göstermektedir.Tasarım ilaç olan klozapin-N-oksit veya CNO, tasarım reseptörünü aktive ederek nöral aktiviteyi susturmak için kullanılır; CNO, herhangi bir test aşamasından önce enjekte edilebilir. Burada CNO, her bir ön koşullandırma seansından 30 dakika önce enjekte edilir. Protokolün yazılı bölümündeki talimatlara göre taze 1 mg/mL klozapin-N-oksit çözeltisi hazırladıktan sonra, davranışsal testlerden 30 dakika önce 1 mg/kg dozunda intraperitonal olarak CNO enjekte edin.Uygun davranışsal oturum için bilgisayar kodunu başlatın. 30 dakika geçtikten sonra sıçanları test odalarına yerleştirin ve sıçanlara işitsel ve görsel uyaranların sunumundan oluşan 12 karışık deneme sunarak, 64 dakikalık 4 ön koşullandırma oturumunun ilkini başlatın. Denemelerin altısında ön koşullandırma uyaranı olan tonu 10 saniye boyunca sunun, ardından diğer altı denemede hemen beş saniyelik yanıp sönen ışık uyaranı sunumu yapın.Yayınlanmamış uyaran olan beyaz gürültüyü tek başına 10 saniye boyunca sunun. Ön koşullama aşaması tamamlandıktan sonra, beş ardışık gün boyunca gerçekleştirilecek olan koşullama seanslarına başlayın. Sıçanlara, beş saniye boyunca görsel uyaranın (yanıp sönen ışık) sunulmasını ve hemen ardından 2 adet 45 milligram gıda peletinin verilmesini içeren sekiz deneme uygulayın.Bu sefer, koşullanma oturumları tamamlandığında yedi dakikalık denemeler arası aralıklar ekleyin. Sadece işitsel uyaranların sunulduğu, birbirine karışmış 12 denemeden oluşan tek bir 78 dakikalık test oturumu gerçekleştirin. Denemelerin altısında.Ton stimülüsü olan ön koşul stimülüsünü tek başına 10 saniye boyunca sunun. Diğer altı denemede, eşleşmemiş stimülüs olan beyaz gürültüyü tek başına 10 saniye boyunca sunun. Davranışsal görev tamamlandığında, sıçanları derhal bölmelerden çıkarın ve hayvan kolonisine geri götürün.Şartlandırma ve test aşamasından elde edilen verileri, protokolün yazılı kısmındaki ayrıntılı talimatlara göre analiz edin. İşaretli raporere veya reporter proteine yönelik immünohistokimya işlemini gerçekleştirdikten sonra, tasarım reseptörünün ve/veya reporterin konumunu ve ekspresyonunu belirlemek için boyanmış kesitleri mikroskopi ile inceleyin; kontrol ve deney sıçanlarının, şartlandırma oturumları sırasında yanıp sönen ışık uyarısı ile yiyecek arasındaki Pavlovyen İlişkiyi benzer şekilde öğrendiğinden emin olun.Oturumlar boyunca, her iki grup da koşullanma oturumu sırasında yiyecek ödülü almaya motive edilmiştir. Buna karşılık, kritik test oturumu sırasında, deney sıçanları ön koşullanmış ve ön koşullanmamış işitsel uyaranlar arasında ayrım yapamamış, kontrol sıçanları ise ön koşullanmış uyarana verilen tepki olarak daha fazla yiyecek kabı davranışı göstermiştir. Böylece, deney sıçanlarının aksine, kontrol sıçanları duyusal ön koşullanma etkisini göstermiştir.Bu görüntü, kemirgen beyninde geliştirilmesinin ardından, ilgi bölgesine yapılan bir v infüzyonunun konumunun histolojik doğrulamasını göstermektedir. Bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların, belirli beyin bölgelerinin ve/veya hücre tiplerinin in vivo kompleks davranışlara olan katkılarını keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

a-method-for-remotely-silencing-neural-activity-rodents-during

Research

JoVE Journal

Behavior

Davranış

Bu yazıda, aynı anda çoklu bilişsel davranışları test ve kemirgenler için nöronal aktiviteleri kayıt yeteneğine sahip tam otomatik ve çok yönlü bir sistem sunuyoruz.

Multi-bilişsel işlevler Test ve Kemirgenler Nöronal Etkinlikler kayıt için Tam Otomatik ve Çok Yönlü Sistemi

Anestezi uygulanmış bir yenidoğan yavrusunu bir ısıtma yastığına yerleştirin.Saç derisini etanol ile dezenfekte edin.Bir şırıngayı, ilaçla aktive olan bir inhibitör reseptör ve bir izleme boyası için geni taşıyan adeno ilişkili virüsleri içeren viral bir çözelti ile doldurun.Şırınga ucunu yavrunun kafasıyla hizalayın ve eşit dağılım için virüsü yavaşça beyne enjekte edin.Yavrunun iyileşmesine izin verin.Kuluçka sırasında, viral parçacıklar nöronlara girer ve genetik materyallerini çekirdeğe...

Yenidoğan Bir Farede Nöronal Aktivitenin Kemogenetik Susturulması

Kaynak: Lai, J., et al. Kemirgen beyninde inhibitör ajanların eşzamanlı elektrofizyolojik kaydı ve mikro enjeksiyonları. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, sıçan superior colliculus'ta eşzamanlı nöronal kayıt ve inhibisyon için mikroenjeksiyon tabanlı bir tekniği göstermektedir. Prosedür, stereotaksik hedeflemeyi, kafatası delmeyi ve nöronal aktiviteyi kaydederken inhibe edici bir nörotransmitter sağlayan bir injectrodun yerleştirilmesini içerir. Işık stimülasyonu aksiyon potansiyellerini...

Bir Sıçanda Nöronal Aktivitenin İnhibisyonu ve Elektrofizyoloji Kullanılarak Tespiti

Kemirgen edimsel koşullama için tam otomatik protokol önerilmiştir. Protokol bu kontrol etkileri sinirsel aktivite yatan Sensorimotor entegrasyon ve bilişsel kontrolü deneyleri için ölçüde araştırmak için davranışsal olayların hassas zamansal kontrolüne dayanır.

Duyusal Entegrasyon ve Bilişsel Kontrol Deney için tam otomatik Kemirgen Yastıkları Protokolü

Yeni uyaran-tepki dernekler Öğrenme sonuçta bireysel nöronların başak çıkışını değişiyor yansıyan sinirsel süreçlerin geniş bir yelpazede yürütmektedir. Burada, hayvanlar, elde söndürmek ve tek bir deneysel oturumda içinde bir şartlı yanıt yeniden almak ise tek nöron aktivitesinin sürekli kaydı için izin veren bir davranış protokol açıklar.

Serbestçe Öğrenmenin üç aşamalı karşısında Güvercinler Hareketli gelen tek nöronların &#39;Aksiyon Potansiyelleri kayıt

Burada, ikili işlevlere sahip bir cam pipet yapıyoruz: ilaçların mikroenjeksiyonları ile derin beyin yapılarının inhibisyonu ve eşzamanlı elektrofizyolojik kayıtlar yoluyla etkilerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesi.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve kemirgen Beyindeki inhibitör Ajanların Mikro-enjeksiyon

Servis kutusu kaçınma öğrenme davranışsal nörobilim iyi bilinmektedir. Bu protokol kemirgenlerde öğrenme mekik kutusu siteye özgü elektrik intrakortikal mikrostimülasyonla (ICMS) ve öğrenme ve algılama çoklu yönlerini incelemek için bir araç olarak in vivo kayıtları eşzamanlı kronikleştiriyor ile kombine edilebilir açıklanır.

Algı ve Öğrenme Eğitim bir aracı olarak Elektrofizyolojik Cortex Kayıt ve Stimülasyon ile Servisi-Box Eğitim Kombine

Vagus sinir stimülasyonu (VNS) davranışları bir dizi değiştirmek için ön beyinde hedeflenen sinaptik plastisite ikna etmek için bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol korku söndürme bellek konsolidasyonu kolaylaştırmak için VNS uygulamak açıklamaktadır.

Aracı Olarak vagus sinir stimülasyonu Extinction Öğrenme İlgili Pathways Plastisitesi tetikleyebilecek

Uyanık farelerde hücre dışı nöral aktiviteyi aynı anda kaydetmek ve kayıt bölgelerinin yakınında birden fazla nöroaktif madde salmak için elektrotların yapımı için yöntemler sunuyoruz. Bu teknik, ilgilenilen nörona varsayılan yerel sinaptik girdilerin ayrıntılı analizine izin verir.

Uyanık Farelerde Nöroaktif Maddelerin Microiontophoretic Uygulaması ile birlikte Nöronal Faaliyet dışı Kaydı

Fare beyin sinyallerinin in vivo elektrofizyolojik kayıtları için mikro sürücünün tasarım ve montaj açıklanmıştır. Sağlam driveable taşıyıcılara mikroelektrot demetleri takılarak, bu tekniklerin uzun vadeli ve istikrarlı bir sinir kayıtları için izin verir. Hafif tasarım hayvan aşağıdaki sürücü implantasyonu ile sınırsız davranış performans sağlar.

Uyanık davranmak Fare Kronik Sinir Kayıtlar için Microdrive Diziler İnşaatı

Öğrenin: Sıçanlarda belirli beyin bölgelerindeki nöron aktivitesini geçici olarak susturma yöntemi. Farmakogenetik ve davranışsal testlerle öğrenme süreçlerini inceleyin.

Öğrenmenin Ayrık Aşama sırasında Kemirgenler uzaktan suskunluğu Sinir Aktivitesi Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet