Name: Fare Kanser Modeli Tümör Hücreleri Sirkülasyon İzolasyonu ve Yayılım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Keşfedin hepatoselüler karsinom metastaz fare modelinden dolaşımdaki tümör hücrelerinin izolasyonu ve üretimi. Santrifüjasyon ve hücre kültürü yöntemleriyle tekrarlanabilir bir kanser araştırma modeli oluşturun.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Ogunwobi'nin laboratuvarındaki çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Azınlık Sağlığı ve Sağlık Eşitsizlikleri Ulusal Enstitüsü'nden (MD007599) Azınlık Kurumlarında Araştırma Merkezleri Programı hibesi ile desteklenmektedir. Bu makalenin içeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIMHD veya NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Etik Beyanı: Tüm hayvan çalışmaları New York Şehir Üniversitesi Hunter College Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Ön deneme İşlemleri <ol><li> Hayvan tesis varışta, başlangıçta süzülmüş üst ve ahşap talaş yatak ile bir kafese 3 BALB / c fareler ev. Fareler yiyecek, purina kemirgen yemi ve su ücretsiz erişimi olduğundan emin olun. Kafesleri haftada bir kez temizlenmesi gerekir iken Yatak ve gıda haftada iki kez değiştirilmelidir. </li><li> Dakika başına 1 L sabit bir akış oranında oksijenle birlikte izofluran buharlaştırıcı kullanılarak farelerde, genel anestezi neden. Sistem kendine güvenen ve hassas buharlaştırıcı içerir. </li><li> Buna bağlı hassas buharlaştırıcı ve gaz / anestezik sistemine sahip bir plastik kutu içinde Pozisyon hayvan. Hayvan hangi noktada 2 buharlaştırıcı düşürmek, bilinçsiz kadar Başlangıçta 2.5 buharlaştırıcı ayarlayın. </li><li> O zaman, geçişVana hattı, kutu onu sızdırmazlık ve burun konisi onu açmadan. </li><li> Burun konisi (bakım anestezi için) düzgün yerleştirilmiş ve bağlanmış olan, hazırlık alanına hayvan hareket ettirin. </li><li> Fare başına implantasyon için 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 fare HCC hücreleri hazırla. BNL 1ME A.7R.1 ortamında büyüyen olmalıdır (% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve 2 mM L-Glutamin) hava ve% 5 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de bir hücre kültür kabı içinde inkübe CO 2. </li><li> Bir şırınga, bir 20 G iğne sahip olan, BALB / c farelerinin karaciğerinin bir kulak memesine 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 fare hepatoselüler karsinoma hücreleri ihtiva eden PBS implant 100 ul primer tümör üretmek. Sonrası emplantasyon ev ön implantasyonu ile aynı ev gereksinimleri olan bir kafese, BALB / c farelerinde indüklenmiştir. </li><li> Deneysel uç noktada, hepatosellüler karsinom klinik kanıt vücut kondisyonu önemli azalma olarak gözlemlenebilir(genellikle 4 hafta sonra tespit) skoru. Bu noktada, metastatik yatakları akciğerlerde oluşmuş ise primer tümörler, karaciğer gelişmiştir bir olasılık mevcuttur. Bundan sonra, dolaşan tümör hücrelerinin izolasyonu ve yayılma süreci başlar. </li></ol> Tümör Hücre İzolasyonu Sirkülasyon Tüm Kanı 2. Koleksiyonu NOT: Düzgün cerrahi alan dezenfekte ve dağınıklıktan arınmış olduğundan emin olun. Tüm cerrahi aletler otoklav veya üreticinin tavsiyesine göre bir dezenfektan emmek <ol><li> Deneysel sonu noktasında insani ötenazi (tümör gelişiminin klinik kanıt) tarafından fareler Kurban. Farelerin Euthanization CO2 boğulmaya içermelidir. Anestezi onaylamak için düzgün fareler uyun doğru dağıtılır. Solunum durduracak şekilde 10 dakika - Karbondioksit 5 bir süre boyunca odaya yavaş yavaş serbest bırakılması gerekir. Intrakardiyak kan kaybından ve cervic tarafından takipal çıkığı. 5 </li><li> Tam kan toplanması için bir 1 ml şırınga bağlanmış bir 25 G iğne kullanın. 0,01 mi heparin ile şırınga Heparanize. Xyphisternum yaklaşık 45 ° açı ile aşağı iğne ile hemen Delinme cilt. Kalbi delinme yavaş yavaş iğne Advance, sonra iğnenin açısını azaltın. Mütemadiyen yerinde iğne ve şırınga tutun ve 500 ul dışarı çıkartalım - kalpten kanın 1.000 ul. </li><li> Şırınga ve iğne çıkarın ve önceden etiketlenmiş 1.5 ml&#39;lik pirojensiz tüp içine kan transferi. 5 dakika boyunca 1167 x g&#39;de 1.5 mi pirojensiz tüpe tam kan santrifüjleyin. Not: santrifüj, üç tabaka halinde, tüm kan örneğinin ayırır: kırmızı kan hücreleri, buffy coat bir ara ince tabaka, ve bir üst plazma katmanının oluşan alt ya da hematokrit katmanı. </li><li> Pipetle dikkatlice plazmayı çıkarın ve Furth için ayrı 1.5 ml pirojensiz tüp içine toplamaBu tür hücre içermeyen nükleik asitlerin 7 algılama gibi er deneyleri. </li><li> Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) izolasyonu için, kırmızı kan hücresi (RBC) lizis hazırlanmasında ayrı bir 1.5 mi pirojensiz tüp içine buffy coat toplar. Bu ince beyaz tabaka tabakası kalıntı eritrositlerde kaldırmak için gereklidir. </li></ol> Kırmızı kan hücresi (RBC) Liziz Tamponu 3. Tarif <ol><li> RBC parçalama tamponu 1 L&#39;lik bir çözelti sağlayın. </li><li> Bir amonyum klorür 500 ml Tris, 500 ml sağlayın. Daha sonra amonyum klorür 155 mM ve Tris, 10 mM bir son konsantrasyonda olan RBC parçalama tamponu 1 L&#39;lik bir çözelti oluşturmak için karıştırılır. </li><li> 7.5 arasında bir pH değerine çözeltisi Tampon. 2 8 ° C&#39;de RBC parçalama tamponu Mağaza ve kullanımdan hemen önce oda sıcaklığına getirin. </li></ol> Buffy Coat 4. RBC Liziz <ol><li> Toplanan ince beyaz tabakayı içeren steril pirojensiz bir 1.5 ml&#39;lik tübe RBC parçalama tamponu 1 ml ilave edilir. </li><li> Tüpün içeriği karıştırınbirden çok kez ters yüz. Bankta oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırılır tüpün içeriği inkübe edin. X g 1.167 5 dakika boyunca karıştırılır içeriği santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, beyazımsı bir pelet elde edilir. Pelet herhangi bir kesinti olmadan yavaş ve dikkatli% 10 çamaşır suyu içine kırmızımsı süpernatant atın. 3.5 - pelet beyazımsı değilse, yeniden do 3.1 adımları tekrarlayın. 10 RBC parçalama tamponunda kuluçka süresinin arttırılması - 15 dakika da yararlı olabilir. </li><li> % 10 çamaşır suyu biyolojik atık arındırma 24 saat sonra tamamlandığında Güvenle biyolojik atıkların imha edin. </li></ol> Hücre Kültürü 5. Yayılım Not: Tümör hücreleri tipik olarak hızlı bir şekilde hücreler kabı içine ekilmiş hücrelerin özgün bir karışımı bol miktarda bulunan, beyaz kan hücreleri büyümektedir. Ortamının tekrar tekrar değiştirme ve kapalı zaman eğrilerinin sonraki geçişleri sonra tüm akyuvar çıkarılır ve kapalı zaman eğrilerinin nispeten saf popülasyon kalır. <ol><li> Sonraki% 10 çamaşır suyu içine süpernatant atarak, hücre kültürü içinde yayılma için tam kültür ortamı içinde en az bir kez 1 ml fosfat tamponlu salin (PBS) içinde beyaz pelet yıkayın ve süspansiyon haline getirin. </li><li> Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, pelet tam BNL 1ME A.7R.1 kültür ortamında (FBS,% 10 ısı,% 1 penisilin / streptomisin ve 2 mM L-Glutamin) 1 ml ekleyin ve kültür ortamında pelletini. </li><li> Bir hücre kültür çanak içine hücreleri yeniden süspanse karışımı Tohum. Hava ve% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de hücre kültürü çanağı inkübe edin. </li><li> Her iki veya üç gün hücre kültür ortamı değiştirin. Beş ila yedi gün sonra, KTC hücre kültürü çanak yapıştırılır ve çoğalan başlamış olacak. Bu hücreler 25 pasajlar ötesinde ve tekrarlanan donma ve çözülme döngüleri 5 sonra canlı kalacaktır. </li></ol> Hepatosellüler karsinom 6. Doğrulama Tümör Hücre Hattı Sirkülasyon <ol><li> Ap gerçekleştirinzincir reaksiyonu (PCR) bazlı bir yöntem olymerase, yeni bir CTC hücre çizgileri, orijinal implante BNL 1ME A.7R.1 HCC çizgi gibi fare hücreleri kurulan onaylamak için fare β-globin geninin sadece tek bir özel DNA bölümünün yükseltilmesi için. Yöntem aslında anlatılan ve Steube ark doğrulandı. 5,8 </li><li> Belirli bir antikor kullanarak protein 3 gibi 3 (CREB3L3) bağlanma hepatosite özel işaretleyici cAMP yanıt elemanı için immün gerçekleştirin. Bu kurulan KTC gerçekten orijinal implante BNL 1ME A.7R.1 hücre hattı gibi hepatositlerin bu romanı teyit edecektir. 5 </li></ol>

<ol><li>Ashworth, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+cancer+in+which+cells+similar+to+those+in+the+tumors+were+seen+in+the+blood+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death.</a> Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).</li>
<li>van de Stolpe, A., den Toonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells%3A+What+Is+in+It+for+the+Patient%3F+A+Vision+towards+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future.</a> Cancers. 6, 1195-1207 (2014).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).</li>
<li>George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Tissue+is+the+issue%22%3A+circulating+tumor+cells+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastrointestinal+cancer%22%5BJournal%5D)">"Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer.</a> Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).</li>
<li>Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+HGF+and+c-Met+drives+metastasis+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma.</a> PloS one. 8, e63765(2013).</li>
<li>Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent%2C+biocompatible+nanostructured+surfaces+for+cancer+cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture.</a> International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li>
<li>Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+verification+of+rodent+cell+lines+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction.</a> Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer micrometastases.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).</li>
<li>De Giorgi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+bone+metastases+as+detected+by+FDG-PET%2FCT+in+patients+with+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+oncology+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Medical+Oncology+%2F+ESMO%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).</li>
<li>Eloubeidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+ultrasound-guided+fine+needle+aspiration+biopsy+of+patients+with+suspected+pancreatic+cancer%3A+diagnostic+accuracy+and+acute+and+30-day+complications%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).</li>
<li>O'Toole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+complications+of+EUS-guided+fine-needle+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+endoscopy%22%5BJournal%5D)">Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration.</a> Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu çalışmada, HCC'li sinjeneik bir farenin tam kanından CTC'lerin nasıl izole edileceği ve çoğaltılacağı anlatılmıştır. Bu çalışmanın amacı, kanser metastazı mekanizmaları ile ilgili devam eden çalışmaları geliştirmektir. 
Birçok kanserin kötü prognozuna katkıda bulunan bir faktör, malignitenin zamanında tespit edilmemesi ve bunun sonucunda yaygın olarak yayılmasıdır3. CTC'ler birincil kanserlerden kaynaklanır ve kan dolaşımı yoluyla uzak organlara yayılır. Bu nedenle, CTC'ler kanse...

Kanser araştırma topluluğu, ilk kez 1869'da Thomas Ashworth tarafından gözlemlendiğinden beri dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'ler) varlığını bilmektedir1. O zamandan beri, CTC'lerin tümör metastazı ve hastalık progresyonu2-5'te önemli olduğu gösterilmiştir. Günümüzde solid tümörler tüm dünyada önemli bir morbidite ve mortalite nedenidir. CTC'ler, primer tümörlerden kaynaklanan ve kan dolaşımı yoluyla farklı organlara giden nadir hücrelerdir ve bunların sadece küçük bir kısmı sonuçta metastaz2-5'e dönüşür. Özellikle, tümör boyutu ileCTC numarası 3,4 arasında pozitif korelasyon vardır. 
CTC biyolojisinin anlaşılması, hedefe yönelik tedavi arayışına katkıda bulunabilir. Ayrıca, CTC'lerin teşhis uygulamaları olabilir. Bu potansiyel klinik uygulamaları başarmak için, CTC'leri incelemeye yönelik bazı güncel zorlukların üstesinden gelmek gerekir. Bir zorluk, CTC'lerin tek hücreler veya kümeler halinde bulunabileceği ve hatta kan mikroçevresine yanıt olarak fenotiplerini değiştirebilecekleri gerçeğiyle ilgilidir2. Ayrıca, kısmen, kandaki mililitre başına bir milyarhematolojik hücre arasındaki düşük CTC sayısı (mililitre başına birkaç ila yüzlerce) nedeniyle tespit çok zor olabilir6. Bununla birlikte, son yıllarda, katı organ kanserlerinden CTC'lerin potansiyel klinik uygulamalarına yönelik araştırmalar yoğunlaşmıştır.
Bu çabalara rağmen, CTC'lerin rolünü incelemenin ve anlamanın zorlukları, CTC'lerin nadir olması ve şu anda mevcut olan teknolojik araçların yetersizliği nedeniyle devam etmektedir. Bu zorluklara rağmen, klinik uygulamalar için muazzam potansiyel, CTC'lerin kanser metastazındaki rolüne ilişkin araştırmaları sürdürmek için bir teşvik olmaya devam etmektedir.
Yakın zamanda, hepatoselüler karsinom (HCC) metastazı5'in ortotopik sinjeneik fare modelinden hücre kültürü CTC'lerini izole etmede ve çoğaltmada başarılı olduk. Bu makalenin amacı, başarılı metodolojinin tüm yönlerini ayrıntılı olarak tanımlamaktır. Bu metodolojinin önemi, bu yaklaşımın, insan CTC'lerini kültürde başarılı bir şekilde izole etmek ve çoğaltmak için değiştirilebilmesi ve böylece CTC biyolojisinin in vitro çalışmalarının olasılığını arttırması gerçeğinde yatmaktadır. 
CTC'lerin kullanımı için birden fazla potansiyel klinik uygulama vardır. CTC'ler prognoz, yanıt izleme, tarama, tümör moleküler değişikliklerinin dinamik izlenmesi ve kişiselleştirilmiş tedavi için yararlı olabilir4. Bu nedenle, CTC'lerin biyolojisinin daha iyi anlaşılması, klinik etki için yüksek potansiyele sahiptir.

<table><tbody><tr><td>Heparin Sodyum Tuzu 1 g</td><td>VWR</td><td>89508-852</td><td></td></tr><tr><td>BTX Tüp Mikro 1.5 ml Şeffaf NS</td><td>VWR</td><td>89511-254</td><td>1.5 ml&nbsp; Pirojen İçermeyen Eppendorf Tüpleri</td></tr><tr><td>İğne Steril Disp BD 25 G x 1 inç</td><td>VWR</td><td>BD305125</td><td>25 G İğne</td></tr><tr><td>Slp Ucu SRNG 1 ml 200 paket başına</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>1 ml şırınga ucu</td></tr><tr><td>Şırınga 1 ml leur lok Pk 100</td><td>VWR</td><td>BD309628</td><td>1 ml şırınga</td></tr><tr><td>VWR Forseps Doku 6</td><td>VWR</td><td>82027-446</td><td>Forseps</td></tr><tr><td>Cyromold girişi 15 x 15 x 5 mm PK 100</td><td>VWR</td><td>25608-924</td><td>Cyromold</td></tr><tr><td>Cryo-oct bileşeni 4 oz</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Oct bileşik</td></tr><tr><td>VWR Slayt sprfrst 25 x 75 mm PK72</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>Slaytlar</td></tr><tr><td>VWR Kapak Camı #2 22 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48-382-128</td><td>Kapak Camı</td></tr><tr><td>VWR Slayt Kutusu Gerçek Kuzey Fm Pu</td><td>VWR</td><td>89140-278</td><td>Slayt Kutusu</td></tr><tr><td>Süper HT PAP Kalem</td><td>VWR</td><td>89427-058</td><td>PAP kalem</td></tr><tr><td>Su RNASe ve DNAse içermez 2 L</td><td>VWR</td><td>101454-204</td><td>Nükleaz İçermeyen</td></tr><tr><td>Su Tamponu Tris Ultra Saf Sınıf 500 g</td><td>VWR</td><td>97061-796</td><td>Tris Tampon</td></tr><tr><td>Amonyum Klorür ACS Sınıf 2, 5 Kg</td><td>VWR</td><td>97062-048</td><td>Amonyum Klorür Tampon</td></tr><tr><td>Falcon Doku Kültürü Kabı 60 x 15 mm Stil polistiren</td><td>VWR</td><td>353002</td><td>Doku Kültürü Kabı</td></tr><tr><td>Clorox Antiseptik Ağartıcı, Normal</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Clorox Çamaşır Suyu</td></tr><tr><td>PBS, 1x (Fosfat Tamponlu Salin) kalsiyum ve magnezyum içermez (500 ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21-040-CV</td><td>PBS, 1x</td></tr><tr><td>DMEM, 1x&nbsp; 4.5 g/L glikoz ile & Sodyum piruvat içermeyen L-glutamin</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>10-017-CV</td><td>DMEM BNL 1ME A.7R.1 hücreleri için 1x ortam</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35-010-CV</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin Çözeltisi, 100x</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>30-002-Cl</td><td>Penisilin Streptomisin</td></tr><tr><td>Sorvall Biofuge pico Thermo</td><td>Fischer Scientific</td><td>75002411</td><td>13.000 rpm Santrifüj</td></tr></tbody></table>

fare kanser modeli tümör hücreleri sirkülasyon İzolasyonu ve yayılım

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Kansere bağlı ölümlerin en önde gelen nedeni kanser metastazıdır. Son yıllarda yapılan çalışmalar, dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'ler) kanser metastazında önemli olduğunu göstermiştir. Gerçekten de, CTC'lerin sayısı tümör boyutu ile ilişkilidir. Burada, katı organ tümörü metastazının potansiyel olarak önemli moleküler mekanizmalarının aşağı akış analizine izin veren sinjeneik bir hepatoselüler karsinom (HCC) fare modelinden CTC'lerin izolasyonu ve yayılması için bir metodolojinin ayrıntılı bir açıklaması sağlanmıştır. Bu yöntem verimli ve tekrarlanabilir. Non-invaziv bir tekniktir ve bu nedenle, komplikasyonlarla ilişkili olabilecek insanlardan alınan dokuların invaziv biyopsisinin yerini alma potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, burada tartışılan yöntem, CTC'lerin tam kan örneklerinden incelenebilecek ve karakterize edilebilecek şekilde izole edilmesine ve çoğaltılmasına izin verir. Bu, tanı ve kişiselleştirilmiş hedefe yönelik tedavi gibi klinik uygulamalar için gelecekteki adaptasyon potansiyeline sahiptir.

Burada tarif edilen yöntem kapalı zaman eğrilerinin izole edilebilir olduğunu göstermiştir. Fareler insanca deneysel sonu noktasında ötenazi edildi. Süreç katılan karbondioksit asfiksi, intra-kardiyak kan kaybı ve servikal dislokasyon. Prosedürün temel aşamalarının bir şeması, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Intrakardiyak eksanguinasyon yoluyla toplanan tam kan örnekleri, yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak işlenmiştir. Bundan sonra, santrifüjleme RBC lize tabi tutuldu ve ince b...

Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'ler) tümör metastazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Burada, hepatosellüler karsinom (HCC) metastazı sinjeneik fare tümörü modelinin tam kanından CTC'lerin izolasyonu ve yayılması için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kanser Modeli Tümör Hücreleri Sirkülasyon İzolasyonu ve Yayılım

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Bu prosedürün genel amacı, hepatosellüler karsinom metastazı olan sinjenik bir fare tümör modelinin tam kanından dolaşımdaki tümör hücrelerini izole etmek ve çoğaltmaktır. Bu işlem, öncelikle farelerden toplanan tam kanın santrifüjlenmesi ve buffy coat tabakasının izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, buffy coat içindeki eritrositler lizis edilir ve dolaşımdaki tümör hücreleri bir pelet halinde toplanır.Ardından hücreler yıkanır, tam kültür ortamında süspanse edilir ve hücre kültüründe çoğaltılır. Hızla büyüyen tümör hücreleri birçok pasaj boyunca canlı kalır ve standart moleküler tanı teknikleri kullanılarak doğrulanabilir. Tekniğimizle dolaşan tümör hücrelerinin izole edilmesinin önemi, klinik ortamdaki potansiyel kullanım için optimize edilebilen, tekrarlanabilir bir model sağlamasıdır.Prosedürü benimle birlikte laboratuvarımızdan lisans öğrencisi Michelle Nadu uygulamalı olarak gösterecek. Başlamak için, ayrı bir JoVE makalesinde açıklandığı üzere, hepatoselüler karsinom metastazı olan bir Ciea Kamau tümör modelinden tam kan toplayın. Toplanan tam kanı oda sıcaklığında, 5 dakika boyunca 1.167 ×g hızında santrifüjleyin.Katmanlara ayrıldıktan sonra, üstteki plazma tabakasını dikkatlice alın ve hücre dışı nükleik asitlerin saptanması gibi ileri deneyler için ayrı bir 1,5 mililitre rogen içermeyen tüpe aktarın. Ardından, eritrosit lizisine hazırlık amacıyla Buffy coat tabakasını ayrı bir 1,5 mililitre ROGEN içermeyen tüpe aktarın. Bu işlem, dolaşan tümör hücrelerinin izolasyonundan önce Buffy coat tabakasındaki kalıntı eritrositlerin uzaklaştırılması için gereklidir.İşe, nihai konsantrasyonu 155 millimolar amonyum klorür ve 10 millimolar tris olan bir litrelik eritrosit lizis tamponu çözeltisi hazırlayarak başlayın. Çözeltinin pH değerini 7,5'e ayarlayın. Hazırlanan bir litrelik stok eritrosit lizis tamponu karışımından yaklaşık iki ila dört millilitrelik bir alikot alın.Ardından, toplanan buffy coat'u içeren tüpe bir mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin. Tüpün içeriğini tüpü birkaç kez altüst ederek karıştırın. Daha sonra tüpü oda sıcaklığında, tezgah üzerinde beş dakika inkübe edin.Ardından, karışımın içeriğini beş dakika boyunca santrifüj edin. 1.167 ×g'de santrifüjleme sonrası beyazımsı bir pelet elde edilecektir. Kırmızımsı supernatı, peleti bozmamaya dikkat ederek yavaşça ve dikkatli bir şekilde %10'luk çamaşır suyuna boşaltın.Süpernatan atıldıktan sonra, beyazımsı pelet bir mililitre PBS ile yıkayın. Ardından hücreleri tekrar peletleyin ve komple kültür ortamında yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilen hücreleri bir hücre kültürü kabına aktarın ve hücreleri, hava ve %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edin.Hücre kültür ortamını her iki ila üç günde bir değiştirin. Beş ila yedi gün sonra, dolaşan tümör hücreleri hücre kültür kabına yapışmış ve çoğalmaya başlamış olacaktır. Hepatosellüler karsinom dolaşan tümör hücrelerinin doğru şekilde izole edildiğini doğrulamak için.Stu tarafından tanımlanan ve onaylanan şekilde, fare beta globin geninin belirli bir segmenti için PCR uygulayın. Ardından, hepatosit spesifik markör olan Cyclic A MP responsive element binding protein three like three için spesifik bir antikor ile hücreleri immün boyayın. Burada gösterilen standart teknikler kullanılarak elde edilen görseller, iki ayrı fareden alınan dolaşan tümör hücrelerini temsil etmektedir.Hepatosellüler karsinomun ortotopik sinjenik fare modelinden elde edilen kültürde. Metastatik tümör hücreleri kaba tutunur ve hızla çoğalır. 25 pasajın ötesinde genişletilebilirler ve tekrarlanan dondurma-çözme döngülerine dayanıklıdırlar.Bu videoyu izledikten sonra, canlı sirküler tümör hücrelerinin nasıl izole edileceği ve çoğaltılacağı konusunun yanı sıra bu hücrelerin hem moleküler hem de fonksiyonel olarak nasıl karakterize edileceği hakkında kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.

isolation-propagation-circulating-tumor-cells-from-mouse-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Videoda, yüksek derecede homojen tümörlere sahip ortotopik bir fare modeli geliştirmek için kanserli hücrelerin intracekal enjeksiyonu tekniği açıklanmaktadır. Bu nedenle, ortotopik fare modeli, metastazın gerçekçi simülasyonuna izin vererek, tümör büyümesi ve yayılması sırasındaki fenotip değişikliklerini incelemek için değerli bir araç sağlar.

İntracekal Tümör Hücresi Enjeksiyonu: Ortotopik Kolorektal Kanser Fare Modeli Oluşturmak için Kanser Hücreleri Verme Tekniği

Bu videoda, ötenazi uygulanmış bir kolorektal tümör fare modelinin tam kan örneğinden dolaşımdaki tümör hücrelerinin izole edilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Bu izole CTC'ler kültürlenebilir ve amaçlanan aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Tam Kan Örneğinden CTC İzolasyonu: Murin Kolorektal Kanser Modelinden CTC Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Kanserin metastaz kansere bağlı ölümlerin önemli bir nedenidir. Biz solid organ tümörlerinin metastaz mekanizmaları çalışmak için bir "hasta" gibi ortotopik singenik fare modeli sistemi kurulması için hayatta kalma cerrahi yönteminin derinlemesine bir açıklama sağlar.

Bir &quot;Hasta gibi&quot; Ortotopik singenik Fare Modeli Hepatoselüler karsinomu metastazı

Genetik olarak tasarlanmış fare modellerinden primer tümöre özgü endotel hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için güvenilir bir yöntem bildiriyoruz.

Tümör spesifik Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü Genişleme

Bu makale, dolaşımdaki tümör hücrelerinden (CTC'ler) prostat kanseri hastasından türetilen ksenogreftler (PDX'ler) oluşturmak için kullanılan bir yöntemi detaylandırmaktadır. CTC'lerden PDX modellerinin oluşturulması, prostat kanserini incelemek için alternatif bir deneysel model sağlar; En sık teşhis edilen tümör ve erkeklerde kanserden sık görülen bir ölüm nedenidir.

Prostat Kanseri Hasta Üretimi Tümör Hücreleri Sirkülasyon gelen Xenograftlarında Modeller Türetilmiş

Farelerin çekumuna tümör hücreleri veya organoidler enjekte edilerek ortotopik kolorektal tümörlerin oluşumunu ve ardından bu modelden dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'lerin) izole edilmesini açıklıyoruz.

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Bir hayvan modeli tümör hücreleri (CTCs) kanseri metastaz sırasında akciğer kolonizasyon teşvik dolaşan rolü deşifre için gereklidir. Burada kurduk ve başarıyla gerçekleştirilen bir vivo içinde tahlil özel olarak test etmek için gereksinimin akciğer kolonizasyon için CTCs polimer fibronektin (polyFN) Meclisi.

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Burada, sirkülasyon tümör hücrelerini (CTCs) karakterize eden fenotifik ve moleküler özellikleri tanımlamak için entegre bir iş akışı sunuyoruz. Tek ve kümelenmiş CTCs 'lerin canlı immünostasyon ve robotik mikromanipülasyonunu, alt analiz ve metasrin-tohumlama yeteneğinin değerlendirilmesi için tek hücre bazlı tekniklerle birleştiriyoruz.

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Bu protokol, fare rabdomiyosarkom primer hücrelerinin izolasyonu, tümörsphere oluşumu ve tedavisi ve tümörküre kültürlerinden başlayan allograft transplantasyonu için tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlar.

Mouse Rhabdomiyosarkomlardan İzole Edilen Primer Tümör Hücrelerinden Tümörfer Türevve Tedavisi

Kült WC'ler, belirli belirteç ifadesini test ederek ve ilaç direncini ve karaciğeri diğer olasılıklar arasında kolonileştirme yeteneğini değerlendirerek kanserin daha derin bir fonksiyonel karakterizasyonuna izin verir. Genel olarak, CTC kültürü hasta sonucunu iyileştirmek için kişiselleştirilmiş tıp için umut verici bir klinik araç olabilir.

Dolaşımdaki Tümör Hücre Hatları: Temel ve Çevirisel Araştırmalar için Yenilikçi Bir Araç

İntravital mikroskopi bulgularının translasyonu, dokuya sığ derinlik penetrasyonu ile karşı karşıyadır. Burada, intravital mikroskopi bulgularının klinik translasyonunu potansiyel olarak kolaylaştıran, doğrudan uzamsal korelasyon için intravital mikroskopi ve klinik olarak uygulanabilir görüntüleme modalitelerinin (örneğin, BT, MRI) birlikte kaydedilmesini sağlayan bir dorsal pencere odası fare modelini açıklıyoruz.

Translasyonel Kanser Araştırmalarında Kombine İntravital Mikroskopi ve Manyetik Rezonans Görüntüleme için Dorsal Deri Kıvrımlı Pencere Odası Tümör Fare Modeli

Keşfedin hepatoselüler karsinom metastaz fare modelinden dolaşımdaki tümör hücrelerinin izolasyonu ve üretimi. Santrifüjasyon ve hücre kültürü yöntemleriyle tekrarlanabilir bir kanser araştırma modeli oluşturun.

Fare Kanser Modeli Tümör Hücreleri Sirkülasyon İzolasyonu ve Yayılım

Daha fazla video keşfet