Fare Kanser Modeli Tümör Hücreleri Sirkülasyon İzolasyonu ve Yayılım

Bu prosedürün genel amacı, hepatosellüler karsinom metastazı olan sinjenik bir fare tümör modelinin tam kanından dolaşımdaki tümör hücrelerini izole etmek ve çoğaltmaktır. Bu işlem, öncelikle farelerden toplanan tam kanın santrifüjlenmesi ve buffy coat tabakasının izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, buffy coat içindeki eritrositler lizis edilir ve dolaşımdaki tümör hücreleri bir pelet halinde toplanır.

Ardından hücreler yıkanır, tam kültür ortamında süspanse edilir ve hücre kültüründe çoğaltılır. Hızla büyüyen tümör hücreleri birçok pasaj boyunca canlı kalır ve standart moleküler tanı teknikleri kullanılarak doğrulanabilir. Tekniğimizle dolaşan tümör hücrelerinin izole edilmesinin önemi, klinik ortamdaki potansiyel kullanım için optimize edilebilen, tekrarlanabilir bir model sağlamasıdır.

Prosedürü benimle birlikte laboratuvarımızdan lisans öğrencisi Michelle Nadu uygulamalı olarak gösterecek. Başlamak için, ayrı bir JoVE makalesinde açıklandığı üzere, hepatoselüler karsinom metastazı olan bir Ciea Kamau tümör modelinden tam kan toplayın. Toplanan tam kanı oda sıcaklığında, 5 dakika boyunca 1.167 ×g hızında santrifüjleyin.

Katmanlara ayrıldıktan sonra, üstteki plazma tabakasını dikkatlice alın ve hücre dışı nükleik asitlerin saptanması gibi ileri deneyler için ayrı bir 1,5 mililitre rogen içermeyen tüpe aktarın. Ardından, eritrosit lizisine hazırlık amacıyla Buffy coat tabakasını ayrı bir 1,5 mililitre ROGEN içermeyen tüpe aktarın. Bu işlem, dolaşan tümör hücrelerinin izolasyonundan önce Buffy coat tabakasındaki kalıntı eritrositlerin uzaklaştırılması için gereklidir.

İşe, nihai konsantrasyonu 155 millimolar amonyum klorür ve 10 millimolar tris olan bir litrelik eritrosit lizis tamponu çözeltisi hazırlayarak başlayın. Çözeltinin pH değerini 7,5'e ayarlayın. Hazırlanan bir litrelik stok eritrosit lizis tamponu karışımından yaklaşık iki ila dört millilitrelik bir alikot alın.

Ardından, toplanan buffy coat'u içeren tüpe bir mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin. Tüpün içeriğini tüpü birkaç kez altüst ederek karıştırın. Daha sonra tüpü oda sıcaklığında, tezgah üzerinde beş dakika inkübe edin.

Ardından, karışımın içeriğini beş dakika boyunca santrifüj edin. 1.167 ×g'de santrifüjleme sonrası beyazımsı bir pelet elde edilecektir. Kırmızımsı supernatı, peleti bozmamaya dikkat ederek yavaşça ve dikkatli bir şekilde %10'luk çamaşır suyuna boşaltın.

Süpernatan atıldıktan sonra, beyazımsı pelet bir mililitre PBS ile yıkayın. Ardından hücreleri tekrar peletleyin ve komple kültür ortamında yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilen hücreleri bir hücre kültürü kabına aktarın ve hücreleri, hava ve %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edin.

Hücre kültür ortamını her iki ila üç günde bir değiştirin. Beş ila yedi gün sonra, dolaşan tümör hücreleri hücre kültür kabına yapışmış ve çoğalmaya başlamış olacaktır. Hepatosellüler karsinom dolaşan tümör hücrelerinin doğru şekilde izole edildiğini doğrulamak için.

Stu tarafından tanımlanan ve onaylanan şekilde, fare beta globin geninin belirli bir segmenti için PCR uygulayın. Ardından, hepatosit spesifik markör olan Cyclic A MP responsive element binding protein three like three için spesifik bir antikor ile hücreleri immün boyayın. Burada gösterilen standart teknikler kullanılarak elde edilen görseller, iki ayrı fareden alınan dolaşan tümör hücrelerini temsil etmektedir.

Hepatosellüler karsinomun ortotopik sinjenik fare modelinden elde edilen kültürde. Metastatik tümör hücreleri kaba tutunur ve hızla çoğalır. 25 pasajın ötesinde genişletilebilirler ve tekrarlanan dondurma-çözme döngülerine dayanıklıdırlar.

Bu videoyu izledikten sonra, canlı sirküler tümör hücrelerinin nasıl izole edileceği ve çoğaltılacağı konusunun yanı sıra bu hücrelerin hem moleküler hem de fonksiyonel olarak nasıl karakterize edileceği hakkında kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.