Name: İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Öğrenin, mekanik ve enzimatik yöntemlerle insan desidua bazalis ve parietalis dokularından lökosit izolasyonu. Yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile canlı hücre verimi sağlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü, NIH / DHHS tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Anne, Perinatal ve Çocuk Sağlığı Wayne State Üniversitesi Perinatoloji Girişimi tarafından, kısmen, desteklenmiştir. Biz minnetle yazının onun eleştirel okumalar için Maureen McGerty (Wayne State Üniversitesi) kabul eder.

Bu protokol, akış sitometrisi ile, immünofenotipik hazırlık Desidua basalis ve Desidua parietalis lökosit izolasyonu için uygundur. Bundan başka, izole edilen hücreler hücre sıralama, hücre kültürü, RNA izolasyonu ve sitoloji için kullanılabilir. Bu protokolde belirtilen numuneler ile çalışmaya başlamadan önce, insan etik onay Yerel Araştırma Etik Kurulu ve Kurumsal Gözden Kurulları alınmalıdır. toplanması ve araştırma amaçlı insan örneklerinin kullanılması Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi (NICHD) Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Kurumsal İnceleme Kurulları, Sağlık (NIH) National Institutes of, Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı (DHHS tarafından kabul edildi , Bethesda, MD, ABD) ve Wayne State Üniversitesi (Detroit, MI, USA). Yazılı bilgilendirilmiş onam önce doku örneklerinin toplanması için tüm hamile kadınların elde edilmiştir. NOT: Hayvan kanı, hücreleri, ya da tehlike ile çalışırkenBu protokolde belirtildiği gibi lı ajanlar, doğru biyogüvenlik ve laboratuvar güvenliği eylemleri takip edilmesi esastır. İnsan Desidual Dokuların 1. Diseksiyon NOT: Bazal plaka tabanı altında ve plasenta bağlı olduğu ve anne yüzeyi temsil eder. chorioamniotic membranlar amniyon ve koryon bulunmaktadır. bazal plaka desidua basalis içerir ve koryon desidua parietalis (Şekil 1) içerir. <ol><li> Desidua Basalis <ol><li> Plasenta (Şekil 1A ve 1B) bir kotiledondan taban levhasının bir parça teşrih. </li><li> Yukarı bakacak şekilde plasental villus ile steril bir kesme tahtası üzerine yerleştirin. plasental villus gösteren tarafı genellikle görünüşte kıllı doku ile kanlı kırmızı. bazal plaka pürüzsüz ve kırmızı renkli solgun. </li><li> Vill çıkarmak için keskin, ince nokta makas ve forseps kullanınlı doku ve kan damarları. Süreç (Şekil 1C) sırasında (serbest - - 2 + ve Mg Ca 2+) 1x PBS batırılmış doku tutun. Bu parçaların 2-3 toplayın ve kan (Şekil 1D) kaldırmak için 1x PBS ile iyice durulayın. </li></ol></li><li> Desidua Parietalis <ol><li> Chorioamniotic membran bir parça teşrih (yaklaşık 10 cm, 10 cm, Şekil 1E x). Koryon yukarı bakacak şekilde gemide yerleştirin. koryon tarafı kanlı pıhtıları içerir ve genellikle sarımsı renkte ışık. </li><li> Mümkün (Şekil 1E) olarak kan pıhtılaşması gibi birçok kaldırmak için ince nokta forseps kullanın. 1x PBS berrak bitene kadar membran aşırı kan temizlemek için steril 1x PBS membran durulayın. </li><li> Yavaşça zardan desidual katman kazımak için tek kullanımlık steril hücre kazıyıcı kullanın. Mem steril 1x PBS Uygulabrane bu süreci (Şekil 1F) tamamlarken. Desidual dokuları toplamak ve steril 1 x PBS (Şekil 1G), bir 50 ml plastik tüp içine yerleştirin. </li></ol></li></ol> 2. Mekanik Ayrıştırma ve Enzimatik Sindirim <ol><li> Bir 50 ml&#39;lik plastik bir tüp içinde, steril 1 x PBS ile (Aşama 1.1.3 den) Desidua basalis kesilerek doku ya da (Kademe 1.2.3 den) Desidua parietalis yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile pelet doku toplanır. </li><li> Dikkatlice pelet bozmadan doku pelet üzerinde bulunan süpernatant aspire. NOT: kırmızı kan hücreleri içerdiğinden bu noktada, pelet çok gevşek. Pelet hacmi veya 3 mi ise, hücre ayırma çözeltisi, 6 ml, 37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış pelet yeniden askıya. Pelet hacmi 3 ml büyükse, daha fazla hücre dekolmanı çözüm eklemek (th yaklaşık 2 kat eklemekdoku örneklerinin e hacmi). </li><li> Bir Cı tüpüne homojenize dokular (Desidua basalis + hücre dekolmanı çözelti veya Desidua parietalis + hücre sıyrılma çözeltisi) aktarın. </li><li> Otomatik dissociator C tüpü yerleştirin ve ilgili programı çalıştırın. NOT: desidua bazalisin program çalıştırmak başına 668 toplam mermi ile 17 saniye boyunca çalışır. desidua parietalis program çalıştırmak başına 235 toplam mermi ile 37 saniye boyunca çalışır. Bu programlar desidua bazalisin ya da iyi verim ve hücre canlılığı ile desidua parietalis gelen lökosit izole etmek için özelleştirilmiş edilmiştir. </li><li> Örneğin Accutase gibi ticari olarak temin edilebilen hücre ayırma çözeltisi ile dokuları sindirmek, dokuların mekanik parçalanmalanna sonra; Hafifçe çalkalama ile 37 ° C&#39;de 45 dakika boyunca (proteolitik ve kolajenolitik enzimleri içeren bir kokteyl). </li></ol> Lökosit 3. İzolasyonu <ol><li> İnkübasyondan sonra, Dige 1x 10 ml PBS ilavestion Karışım bir 50 ml plastik tüp içine, bir 100 mikron hücre süzgecinden geçirilir. Sindirim karışımı yapışkanlığının bağlı olarak, bir tek bir karışım için çok sayıda hücre gericileri kullanmak gerekebilir. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de 1 x PBS ile tüp ve santrifüj doldurun. Dikkatli bir şekilde, hücre peletleri üzerinde 1x PBS çıkarın ve buz gibi soğuk FACS tampon maddesi, 5 ml pelet yeniden askıya. NOT: 6.1 adıma gidin, birlikte polimorfonükleer ve mononükleer lökosit incelemek için; mononükleer lökosit incelemek için, 3.3 Adım ile devam edin. </li><li> 15 ml plastik tüp 20 ila% 5 ml yoğunluk gradyan ortamı (1.077 + 0.001 gr / ml) ilave edin ve yavaş yavaş yoğunluk gradyan medyanın üstüne hücre süspansiyonu kaplar. Örnek katman iken, hücre süspansiyonu ile yoğunluk gradyan ortamı karıştırmak için önemlidir. </li><li> Frensiz 4 ˚C 30 dakika boyunca 500 xg&#39;de bir salıncak-out rotorlu santrifüj. Bu hücreleri ve l karışmasını önlemek için fren kapatmak için çok önemlidirdegrade Osing. Lökositler yoğunluk gradyan medya ve FACS tampon arasındaki arayüz bulunacaktır. </li><li> Bir pipet kullanarak çok dikkatli FACS tampon ve hücre artıkları içeren üst katmanı kaldırın. arayüzde bandı desidual mononükleer hücreleri ve polimorfonükleer lökositlerin bir kısmını içerir. </li><li> Yeni bir 15 ml&#39;lik plastik tüp tamamen Ara yüzeydeki hücreleri aktarın. FACS tampon, en az 3 kat daha fazla hacim. </li><li> Hücreleri topaklaşmasına 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ve FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de bir santrifüj ile hücreler topaklaşmasına. NOT: Adım 6, bkz immünofenotıpleme gerçekleştirmek için adım 5. bkz hücre sıralama gerçekleştirmek için adım 4&#39;e bakın, hücre kültürü gerçekleştirmek için. </li></ol> 4. Uygulamalar - Hücre kültürü <ol><li> USI canlı hücreleri sayın RPMI kültür ortamı 1640 1 ml Adım 3.7 hücreleri yeniden askıyaOtomatik hücre sayıcı veya hemasitometre ve tripan mavisi çözüm% 0.4 ng. </li><li> 1 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir hücre konsantrasyonunu yapmak için RPMI kültür ortamı miktarı kadar ekleyin. Hücreler artık kültür için hazırız. </li></ol> 5. Uygulamalar - Birincil Hücre Kültürü için Makrofagların izolasyonu <ol><li> Manyetik CD14 mikro boncuklar (10 7 hücre başına 20 ul boncuklar) ile Aşama 3,7 hücreleri etiketlemek, CD14 + hücreler izole edilmesi için, 15 ° C&#39;de 4 dakika, ve manyetik bir alan uygulanması ile diğer hücre tiplerinden ayrı CD14 + hücrelerinin inkübe edilir. MACS tamponu ve manyetik alanın ayrılması ile 2 kez yıkamadan sonra, MACS tamponu ile manyetik muhafaza CD14 + hücreler elüte. </li><li> Santrifüj sonrasında yeniden askıya hücreleri kaplama (Şekil 2) için hazır olan RPMI 1640 kültür ortamında, hücre peletleri. </li></ol> 6. Uygulamalar - İmmünofenotipleme <ol><li> Immunophenot hücreleri kullanmak içinyping, 1 x PBS içinde 1 ml Aşama 3.7 hücreleri yeniden askıya. Otomatik hücre sayıcı veya hemasitometre ve tripan mavisi çözeltisi% 0.4 kullanılarak canlı hücreleri saymak. </li><li> Bir fixable canlılığı boya (Şekil 3) ile hücrelerin etiketleyin. FACS tamponu ile hücreler iki kez yıkayın ve leke tampon hücreleri yeniden askıya. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca bir FcR engelleyicisi ile inkübe edin. </li><li> Florokromların konjüge hücre dışı antikor ekleyin. Örneğin, bu protokolde, anti-CD3 kullanımı, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 ve anti-CD56 antikorları (Tablo 1). Karanlıkta 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> 1x PBS ile 2 kez yıkamadan sonra, hücreler, bir akış sitometrisi kullanılarak boya tamponu 500 ul analiz edilecektir. Desidual dokularda bulunan lökosit alt popülasyonları analiz etmek için kullanılan yolluk stratejisinin bir temsili Şekil 4&#39;de gösterilmektedir. </li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması açıklamamaktadır.

İnsan maternal-fetal arayüzünde lökositler infiltre fonksiyonel ve fenotipik özelliklerinin karakterizasyonu gebelik bozukluklarına sebep bağışıklık mekanizmalarının anlaşılması için gereklidir. Çeşitli teknikler gebelik 10,14,25,28,37,42,43 boyunca insan maternal-fetal arayüzünden lökositleri izole etmek için tarif edilmiştir. Bununla birlikte, bu tekniklerin her biri farklı olan, her zaman izole edilmiş hücrelerin canlılığını belirtmez, en önemlisi, enzim veya enzim kombinasyonları, değişik kullanır gerekti...

Gebelik üç ayrı aşamadan immünolojik ile karakterize edilir: 1) implantasyon ve pro-enflamatuar yanıt ile ilişkili erken plasenta (yani, implantasyon, bir &#39;açık yara&#39; benzeyen); 2) ikinci trimester ve bağışıklık homeostazı maternal-fetal arayüzünde ağırlıklı anti-inflamatuar devlet yoluyla elde edilir gebeliğin üçüncü trimesterde en; ve 3) doğum, bir pro-inflamatuar durum 1-7. Bağışıklık hücreleri maternal-fetal arayüzünde inflamatuar yanıtın düzenlenmesinde önemli bir rol oynar nerede onların bereket ve gebelik süresince 6-9 yerelleştirme değişim. İnsanlarda, maternal-fetal arayüz anne (desidua) ve fetal (koryon veya trofoblast) dokular arasındaki doğrudan temas bir alanı temsil eder. 1) desidua hatları uterin kavite plasenta kapsamında değil parietalis ve yan yana olan: Bu arayüz içerirkoryon laeve için; ve 2) interstisyel trofoblastlar 10 (Şekil 1) tarafından işgal plasenta bazal plaka bulunan desidua basalis. temas bu alanların samimiyet maternal bağışıklık sistemi 11-13 fetal antijenik maruz kalma koşulları yaratır. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, lökositlerin normal stromal tipi hücreler ve bez hücrelerinde 8,14,16 ilave olarak desidual hücrelerde 8,9,14,15% 30-40 kadar içermektedir. maternal-fetal arayüzünde lökositlerin rolü trofoblast invazyonu 17 sınırlandırılmasına spiral arterlerin 18,19 yenileme, anne hoşgörü 12,20 bakım ve emek 21-26 başlatılmasını dahil çoklu süreçleri kapsar. Uyarlanabilir ve örneğin, T hücreleri, makrofajlar, nötrofiller, B hücreleri, dendritik hücreler ve NK hücreleri, desidual dokularda tespit edilmiştir bağışıklık sistemi, doğuştan gelen uzuvlar, ve bunların her ikisinin de Lökositleroranlar ve aktivasyon durumu gebelik 6-10,12,14,24,27-30 boyunca mekansal ve zamansal olarak değişir gösterilmiştir. Lökosit nüfus ve / veya işlev tedirginlikler spontan abortus 31 preeklampsi 32, intrauterin gelişme geriliği 32,33 ve preterm eylem 7,24 ile ilişkilidir. Bu nedenle, insan maternal-fetal arayüzünde fenotipik özellikleri ve lökositlerin işlevselliği çalışma gebelik bozukluklarında disregüle immünolojik yolların açıklanmasını kolaylaştıracaktır. Birden parametrelerin eş zamanlı olarak 34-36 kantitatif analiz sağlar akım sitometri olan fenotip ve lökositlerin işlevsel özelliklerini belirlemek için kullanılan en güçlü araçlardan biri, teknoloji. Akış sitometrisi ile lökosit analiz etmek için, tek hücreli bir süspansiyon içinde lökositlerin izolasyonu gereklidir. Bu nedenle, bir yöntem, leu infiltre ayırmakmaternal-fetal arayüzden kocytes kendi fenotipik ve fonksiyonel özelliklerini incelemek için gereklidir. Çeşitli yöntemler, insan maternal-fetal arayüz 10,14,25,27,37-39 gelen lökositleri izole etmek için tarif edilmiştir. Bazı mekanik ayrıştırılmasına yönelik çabalara 10,25,27,38 geçerli olsa da, diğerleri doku ayrılma için enzimatik sindirimi 37,40 kullanın. Mekanik parçalanma daha düşük bir verim ve düşük canlılığı 41 ve canlılık ve hücre yüzeyi işaretleme tutma 42 etkileyebilir enzimatik dissosiasyonunu için, burada tarif edilen yöntem, hücre canlılığını tehlikeye atmadan izole lökositlerin verimini artırmak için enzimatik ön-muamele ile hafif mekanik bir ayrışma birleştirir. Yöntemlerin de benzer bir kombinasyonu maternal fetal arabirim 39 ile desidual dokulardan lökositlerin izolasyonu ile etkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, burada tarif edilen bir protokol mekanizmalarını içermektedirkarşıt neşter, tıraş bıçakları, veya cerrahi makas 10,28 geleneksel kıyma haline gelme işleminde göre zaman ve emek tasarrufu sağlarken tutarlılığını artırır otomatik doku dissociator ile nical parçalanma. Doku Ayrılma için seçilen enzim Accutase oldu. Yaygın olarak kullanılan kollajenaz 43 aksine 44 dispase ve tripsin 45 Accutase (hücre dekolmanı çözeltisi) genel proteolitik ve verimli henüz nazik ayrılma 46,47 katkıda kolajenolitik faaliyetleri hem birleştirir. Ayrıştırmadan sonra, lökosit yoğunluk gradyan santrifüjü ile desidual hücrelerin toplam popülasyonundan zenginleştirilmiştir. Çeşitli yoğunluk gradyan Ortam daha önce Percoll (koloidal silis taneciklerinin bir süspansiyon), 48 ve Ficoll (yüksek sentetik bir molekül ağırlığına sahip olan, sukrozun bir polimer) 49 En yaygın olanı, kullanılmıştır. sakaroz polimerin tarafından tecrit üstün verim onceki olmuşturusly 50 gösterilmektedir, ve burada daha fazla tarif protokolü bu yoğunluk gradyan ortam mononükleer lökositlerin yeterince yüksek saflığa ürettiğini kanıtlamaktadır. Bu nedenle, burada tarif edilen bir protokol, insan desidual dokularından lökosit izole etmek için bir yoğunluk gradyan ortam (1.077 + 0.001 gr / ml) ile otomatik bir doku aynştıncı, bir hücre ayırma çözeltisi ile enzimatik sindirme ve lökosit ayırma mekanik doku parçalanmalanna birleştirir. Bu protokol, hücre canlılığı ile birlikte hücre yüzey antijenlerini korumak için kanıtlanmıştır. İzole lökosit akış sitometrisi ve in vitro fonksiyonel çalışmalar ile immünofenotıpleme birden fazla uygulama için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Diseksiyon</td></tr><tr><td>Steril diseksiyon aletleri: cerrahi makas, forseps ve ince uçlu cımbız&nbsp;</td><td>Herhangi bir satıcı</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>1X fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>(1X PBS)</td></tr><tr><td>Büyük ve küçük Petri kapları</td><td>Herhangi bir satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dissociation</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td> <td>(hücre ayırma çözeltisi)</td></tr> <tr><td>Steril 2 ml güvenli kilitli konik tüpler</td><td>Herhangi </td><td></td><td></td>satıcı</tr><tr><td>50 ml konik santrifüj tüpleri</td><td>Herhangi bir satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ve mikro; m hücreli süzgeçler</td><td>FALCON/Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>5 ml yuvarlak tabanlı polistiren test tüpleri</td><td>Herhangi bir satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Herhangi bir satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C tüpleri</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>RPMI kültür ortamı 1640&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>22400-089</td><td>(1X) (%10 FBS ve %1/S)</td></tr><tr><td>Plastik hazne kızakları</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatörü</td><td>Thermo Scientific Corporation</td><td>HEPA Class 100</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Fisher Scientific</td><td>ISOTEMP 110</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sayacı</td><td>Nexelcom</td><td>Cellometer Auto2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Olympus CKX41</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Hücre Ayırma</strong</td></tr><tr><td>>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Hücre ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m ön ayırma filtreleri</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-40</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml güvenli kilitli konik borular</td><td>Herhangi bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS tamponu&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(% 0.5 sığır serum albümini, 2 mM EDTA ve 1X PBS)</td></tr><tr> <td colspan = >< güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td></tr> <tr><td>FcR Engelleme</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td> <td>(Fc Bloğu)</td></tr> <tr><td>Anti-insan hücre yüzeyi antijen antikorları&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>(Tablo 1)</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ canlılık boyası</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix tamponu&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>346202</td><td></td></tr><tr><td>FACS tamponu&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(% 0.1 BSA,% 0.05 Sodyum Azid ve 1X PBS, pH = 7.4)</td></tr> <tr><td>Boyama tamponu&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi çözümü %0,4Yaşam</td> <td>Teknolojileri</td><td>15250-011</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>%20 yoğunluk gradyan ortamı (1,077 + 0,001 g/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Additional Instruments</td></tr><tr><td>Çalkalayıcılı inkübatör</td><td>Thermo Scientific</td><td>MAXQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td>LSR-Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>SpinChron DLX</td><td></td></tr><tr><td>Vakum sistemi</td><td>Herhangi bir satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otomatik doku ayrıştırıcı&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>gentleMACS Ayrıştırıcı</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan maternal-fetal arabirimi lökosit İzolasyonu

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Gebelik yeniden üretici dokularda ve maternal-fetal arayüzünde lökositlerin (Desidua basalis ve Desidua parietalis) infiltrasyonu ile karakterize edilir. Bu arayüz maternal ve fetal dokular arasındaki temas anatomik sitedir; bu nedenle, gebelik sırasında eylem bir immünolojik sitedir. Maternal-fetal arayüzünde infiltre lökositler teslimat merkezi implantasyon rol, gebelik bakımı ve zamanlama oynarlar. Bu nedenle, bu lökositlerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu gebelik bozukluklarına sebep mekanizmalarına fikir verecektir. Birçok protokol Desidua basalis ve Desidua parietalis gelen lökositlerin infiltre izole etmek için de tarif edilmiştir; bununla birlikte inkübasyon, reaktifler, enzimler ve belirli bir süre içinde düzenli olmaması zor bu sonuçları karşılaştırma yapar. Burada tarif edilen yumuşak mekanik ve enzimatik diss kullanımını birleştiren yeni bir yaklaşımdırociation teknikleri maternal fetal ara yüzeyde insan dokularından izole edilen lökosit hücre dışı ve hücre içi işaretlerinin canlılığı ve bütünlüğünü korumak için. Kenara immünofenotiplendirme, hücre kültürü ve hücre sıralama gelen, bu protokolün gelecekteki uygulamaları çok sayıda ve çeşitlidir. Bu protokol, izole edilmiş DNA, lökosit nitro lökosit işlev (yani, fagositoz, sitotoksisite, T-hücresi çoğalması ve plastiklik, vs.) metilasyonu, hedef genlerin ekspresyonunu, ve reaktif oksijen türlerinin üretimini belirlemek için kullanılabilir maternal-fetal arayüzünde. Ayrıca, açıklanan protokolünü kullanarak, bu laboratuar maternal-fetal arayüzünde yeni ve nadir lökosit tanımlamak mümkün olmuştur.

. maternal fetal ara yüzeyde insan dokularıyla (Desidua basalis ve Desidua parietalis) disseksiyon Şekil 1 &#39;de gösterilen bu prosedür, Desidua basalis (- D Şekil 1 A) içeren taban plaka, diseksiyon içerir. Desidua basalis taban plakasına (Şekil 1C) plasental villi (fetal yan) çıkarılması ile elde edilir. Desidua parietalis yavaşça koryonik membran (Şekil 1E - F) kazınarak toplanır. 2 manyetik hücre sıralama kullanar...

Burada açıklanan, insan maternal-fetal arayüzü olan decidua basalis ve decidua parietalis'in sızan lökositlerini izole etmek ve daha fazla incelemek için bir protokoldür. Bu protokol, hücre yüzeyi belirteçlerinin bütünlüğünü korur ve akış sitometrisi analizi ile kanıtlandığı gibi aşağı akış uygulamaları için yeterli canlı hücre verir.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Bu prosedürün genel amacı; insan desidüasından, basalis ve decidua parietalis'ten lökositleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle insan desidua dokularının plasentadan diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, desidua dokusu mekanik dağıtma ve enzimatik sindirim yoluyla ayrıştırılır.Ardından, hücre süspansiyonu 100 mikrometrelik bir hücre süzgeci kullanılarak filtrelenir; süzgeç bir kez XPBS ile yıkanır ve hücre peleti elde etmek için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjlenir. Son olarak, hücre süspansiyonu yoğunluk gradyanı çözeltisinin üzerine yerleştirilip santrifüjlenir ve lökositleri içeren ara yüzey toplanır. Nihayetinde, izole edilen lökositler immünofenotipleme hücre kültürü ve fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir.Bu tekniğin mekanik disosyasyon veya enzimatik sindirim gibi mevcut yöntemlere göre avantajı, mekanik doku desegregasyonunu otomatik bir doku ilişkilendiricisiyle ve tematik sindirimi Accutane ile dışkı gradyanı kullanılarak yapılan lökosit izolasyonuyla birleştirmesidir. Bu protokolün, hücre canlılığındaki hücre yüzeyi antijenlerini koruduğu kanıtlanmıştır ve etkileri, prenatal komplikasyonların patogenezi ile ilgili maternal fetal arayüzdeki infiltre lökositlerin fonksiyonel ve fenotipik özelliklerinin anlaşılmasına kadar uzanmaktadır. Araştırma amaçlı insan örneklerinin toplanması ve kullanılması; Eunice Kennedy Shriver, National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services ve Wayne State University'nin kurumsal inceleme kurulları tarafından onaylanmıştır.Doku örnekleri toplanmadan önce tüm hamile kadınlardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır.Yay. Başlangıç olarak, plasentanın bir kenarından bazal plakadan bir parça kesin. Bunu, tüylü görünümlü ve kan kırmızı rengindeki plasental villuslar yukarı bakacak şekilde steril bir kesim tahtasına yerleştirin.Bazal plaka pürüzsüz ve soluk kırmızı renktedir; dokuyu 1X PBS içinde ıslak tutarken, villöz dokuyu ve kan damarlarını temizlemek için keskin, ince uçlu makas ve pens kullanın. İki ila üç parça toplayın ve kanı uzaklaştırmak için bunları PBS ile iyice yıkayın. Decidua parietalis'i izole etmek için 10 santimetre x 10 santimetre boyutlarındaki kare parçayı diseke edin.Koryon kısmını, yani pıhtıların bulunduğu ve genellikle açık sarı renkte olan yüzeyi yukarı bakacak şekilde tahtanın üzerine yerleştirin. Ardından, ince uçlu pensle mümkün olduğunca çok kan pıhtısını temizleyin. Daha sonra, steril 1X PBS kullanarak, PBS berrak akana kadar membranı yıkayın.Tek kullanımlık steril bir hücre kazıyıcı kullanarak ve membrana PBS uygularken, desidüal tabakayı nazikçe kazıyarak çıkarın. Desidüal dokuları toplayın ve desidüa Bali veya desidüa paral yapılarını mekanik olarak ayrıştırmak için steril PBS içeren 50 mililitrelik plastik bir tüpe yerleştirin. Dokuyu 50 mililitrelik bir tüp içinde yıkamak için steril 1X PBS kullanarak işleme başlayın.Ardından dokuyu 300 G'de ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Pellete zarar vermeden süpernatantı dikkatlice aspire edin. Daha sonra, metin protokolüne uygun olarak dokuyu ve ayırma çözeltisini yeniden süspanse ettikten sonra, homojenize edilmiş dokuları bir C tüpüne aktarın.Tüpü otomatik disosiatöre yerleştirin ve Accutane gibi ticari olarak mevcut bir hücre ayırma solüsyonu ile dokuların disosiyasyonu için ilgili programı çalıştırın; sindirim için 37 °C'de hafif ajitasyon ile 45 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, sindirim karışımına 10 mL PBS ekleyin ve karışımı 100 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Yapışkanlığa bağlı olarak, tek bir sindirimi süzmek için birkaç süzgeç gerekebilir.Tüpü doldurmak için PBS kullanın ve oda sıcaklığında 300 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. S süpernatantını dikkatlice uzaklaştırın ve hücre peletini yeniden süspande etmek için beş mililitre buz soğukluğunda fax tamponu kullanın. Mononükleer lökositleri incelemek için, 15 mililitrelik plastik bir tüpe beş mililitre %20 yoğunluk gradyanı ortamı ekleyin.Ardından, katmanların karışmamasına dikkat ederek hücre süspansiyonunu yavaşça üst kısma ekleyin; 4 °C'de, frenleme olmadan, 500 G'de 30 dakika boyunca dışa doğru açılan rotorlu bir santrifüjde döndürün; lökositler, yoğunluk gradyanı medyumu ile FACS tamponu arasındaki ara yüzeyde bulunacaktır. Daha sonra, FACS tamponu ve hücre kalıntılarını içeren üst katmanı dikkatlice pipetle alın. Ara yüzey, geriye kalan mononükleer hücreleri ve polimorfonükleer lökositlerin bir kısmını içerir.Bu katmanı yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Tüpe en az üç hacim fax tamponu ekleyin, ardından 300 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Hücreleri çöktürmek için süpernatantı aspire edin ve hücre kültürleme işlemine geçmeden önce hücreleri ikinci kez fax tamponu ile yıkayın.Metin protokolüne göre yürütülen ayıklama ve immünofenotipleme işlemi sonucunda, bu şekil, manyetik hücre ayıklama yöntemi kullanılarak miadındaki bir gebelikte decidua pariah'lardan toplanan izole makrofajların morfolojisini göstermektedir. İzole edilen makrofajlar, üç günlük kültürden sonra sitokin salgılama yeteneklerini korurlar. Decidua, baus ve decidua paral'dan izole edilen canlı hücre verimi, yoğunluk gradyanı ayırmasının ardından belirlenmiştir.Burada gösterildiği gibi, sabitlenebilir canlılık kullanıldığında, her bir desidüal hücre popülasyonu için canlılık %90'ın üzerindeydi. Burada; T hücreleri, nötrofiller, makrofajlar, NK hücreleri, NK T hücreleri ve B hücreleri dahil olmak üzere, görünür kapılama (gating) içinde polimorfonükleer ve mononükleer lökositlerin analizine yönelik kapılama stratejisi gösterilmiştir. Term gebelikteki bu şekil; term gebelikten izole edilen kalıntı hücrelerden elde edilen nötrofilleri, makrofajları, T hücrelerini ve B hücrelerini göstermektedir.Son olarak, miadındaki bir gebelikten izole edilen rezidüel hücrelerden elde edilen NK, NKT ve T hücreleri bu grafik setinde sunulmuştur. Bu teknik üzerinde uzmanlaşıldığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, kan kontaminasyonunu önlemek için dokunun iyice temizlendiğinden emin olmak ve işlem boyunca dokuyu ve enzim kokteylini göz önünde bulundurmak önemlidir.

isolation-of-leukocytes-from-the-human-maternal-fetal-interface

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fare beyni infiltre lökositler elde etmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, sürekli Percoll degrade ve süreksiz Ficoll degrade lökosit zenginleştirilmiş katmanı seçin ve arındırmak için kullanır. İzole lökositler akım sitometrik ölçümleri ile karakterize olabilir.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

Burada göbek kordon kanı habercisi alt B-hücreleri izole etmek için bir protokol açıklar. Nükleik asitlerin yeterli bir miktarı ve kalitesi hücrelerinden çıkarılır ve DNA ya da RNA kullanılarak daha sonraki deneylerde kullanılabilir.

Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Burada açıklanan, farelerin maternal-fetal arayüzündeki (uterus, desidua ve plasenta) dokuların sızan lökositlerini izole etmek ve analiz etmek için bir protokoldür. Bu protokol, çoğu hücre yüzeyi işaretleyicisinin bütünlüğünü korur ve akış sitometrisi analizi de dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için yeterli canlı hücre verir.

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Bu yazıda izolasyon ve bu dokulardan mezenkimal kök / stromal hücreler (MSC) genişlemesi, ardından insan terim plasenta, fetal ve maternal dokuların diseksiyonu için yöntemler açıklanmaktadır.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Birincil insan plasental (villöz) ve plasental organ kültürleri oluşturmak için basit bir yöntem tarif edilmektedir. Villus ve desidual organ kültürleri, insan maternal-fetal arayüzünde patogenezinde eğitim için çok değerli araçlardır. Fakültatif hücre içi bakteri Listeria monocytogenes ile enfeksiyon gösterilmiştir.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

Burada, insan göbek kordonu (UC) ve kord fetal plasenta örnek izolasyonu için (CL) Wharton jöle (WJ), kordon plasenta bileşke (CPJ) ve fetal plasenta (FP) astar diseksiyon için bir protokol mevcut ve eksplant kültürü tekniği kullanılarak mezenkimal stromal hücreler (MSC) karakterizasyonu.

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

Bu iletişim kuralı bir yöntem için birincil insan decidual hücreleri çeşitli uygulamalar (Yani immunocytochemistry, Akış Sitometresi, vb) için kullanılan terim placentae fetal membranlar toplanan yalıtım gösterir hedefleyen farklı hücre popülasyonlarının gebelik komplikasyonları olarak rol çalışmak için.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

Anne sütü insan immün yetmezlik virüsü (HIV) iletir, ancak HIV enfekte anneler tarafından emzirilen bebeklerin sadece ~% 15 enfekte olur. Anne sütüyle beslenen bebekler günlük ~105−108 maternal lökosit yutmaktadır, ancak bu hücreler incelenmiştir. Burada anne sütü lökositlerinin izolasyonu ve fagositik kapasitelerinin analizini anlatıyoruz.

Hiv Hedeflerinin Antikorbağımlı Hücresel Fagositoz Sataşanında Kullanılmak Üzere İnsan Anne Sütünden Lökositlerin İzolasyon

Bu, uterus lenfoid hücrelerini hem hamile hem de hamile olmayan farelerden izole etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, FACS fenotipleme, hücre sıralama, işlevsel tahliller, RNA-seq ve proteomik gibi birden çok aşağı akış uygulaması için kullanılabilir. Buradaki protokol, akış sitometrisi ile kandine doğuştan gelen lenfoid hücrelerin fenotip grup 1 rahiminin nasıl olduğunu göstermektedir.

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

Bu protokol, canlı bağışıklık ve bağışıklık dışı popülasyonların fare akciğerinden kararlı bir durumda ve grip enfeksiyonunu takiben izolasyonunu detaylandırır. Ayrıca epitelyal ve miyeloid hücre alt kümelerini tanımlamak için geçit stratejileri sağlar.

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Bu protokol, insan termi plasentalarının decidua bazalis ve koriyonik membranından primer HLA-G+ ekstravillous trofoblastlarının (EVT) arındırılması, karakterizasyonu ve kültürünü sağlar. Birincil EVT kültürleri 96 saat boyunca canlılık korur; bu da örnek eşleştirilmiş anne bağışıklık hücreleriyle birlikte kültür yapılmasına ve ardından etkileşimlerinin akış sitometrik ve moleküler analizine olanak tanır.

İnsan termi plasenta dokularından HLA-G+ ekstravillous trofoblastların fenotipleme ve fonksiyonel analiz için arındırılması

Öğrenin, mekanik ve enzimatik yöntemlerle insan desidua bazalis ve parietalis dokularından lökosit izolasyonu. Yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile canlı hücre verimi sağlanır.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Daha fazla video keşfet