Name: Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Öğrenin, fare maternal-fetal arayüzünden lökosit izolasyonu için mekanik ve enzimatik sindirme yöntemini. Bu protokol, akış sitometrisi ve immünofenotipleme için canlı hücre sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NGL Anne, Perinatal ve Çocuk Sağlığı Wayne State Üniversitesi Perinatal Girişimi tarafından desteklenmiştir. Biz minnetle yazının eleştirel okuma Maureen McGerty ve Amy E. Furcron (Wayne State Üniversitesi) kabul eder.

Bu protokolde belirtilen numuneler ile çalışmaya başlamadan önce, hayvan etik onay Yerel Araştırma Etik Kurulu ve Kurumsal Gözden Kurulları tarafından verilmelidir. Hayvan kanı, hücreleri, ya da bu protokolde belirtildiği gibi tehlikeli maddelerle çalışırken, uygun biyogüvenlik ve laboratuvar güvenliği eylemleri takip edilmelidir. 1. Fare Taşıma ve Doku Koleksiyonu <ol><li> Steril bir iş istasyonu hazırlayın ve doku toplama steril araçlar edinin. Bu araçlar büyük ve küçük cerrahi makas, forseps ve ince uçlu cımbız içerecektir. (- 22 ° C 20), oda sıcaklığına dengelendi - (5 mi 3) 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi ile doldurulmuş uygun doku adlarını taşıyan kültür kaplarına, içerir. (- 15 mi 10) da 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş, etiketlenmemiş büyük bir Petri kabı, içerir. </li><li> Hamile bir fare Euthanize (10,5-19,0 ​​gün sonrası coitum (DPC) ya da teslimattan önce) karbondioksit kullanarak (CO 2). Fare ötenazi emin olmak için, servikal dislokasyon tekniği kullanın. Not: 10.5 DPC önce, manüel olarak uterus dokulardan desidual dokuları ayırmak zordur. Desidual lökositlerin izolasyonu gerekli değilse, rahim gebe olmayan farelerin dokularında ya da fareden olanlardan lökositler &lt;10.5 DPC de bu protokol takip edilerek gerçekleştirilebilir. </li><li> Steril cerrahi makas kullanılarak, tam olarak deri ve kas dokusu alt karın kısmı çıkartın. Forseps ile rahim kadar bir kenara diğer tüm organları taşımak ve yumurtalıklar görebilir. Rahim hala bağlı olan, periton boşluğuna (Şekil 1A) dışına hareket ettirmek için forseps kullanır. </li><li> Her uterin boynuz yumurtalık ve uterotubal kavşağına uzak yumurtalıkların bulun. Küçük cerrahi makas kullanarak, uterotubal kavşakta bir kesi yapmak ve rahim damarları içeren mezenter gelen rahim boynuzları ayrı; o zaman,servikste tüketim periton boşluğuna (Şekil 1B) den rahim boynuzları ayırmak için. </li><li> Küçük cerrahi makas ile, serviks ve uterus boynuzları alt segment arasında bir kesi yapmak. Ara uterin boynuzu açma önlemek için bu işlem (Şekil 1C) serviksin bir kısmı eklenmiş. </li><li> Implantasyon siteleri nemlendirmek için - (15 ml 10) 1x PBS çözeltisi ile dolu büyük bir Petri kabındaki (serviks dahil) rahim boynuzları daldırın. </li><li> Hala 1x PBS çözeltisi batırılır iken, küçük cerrahi makas ile rahim boynuzları gelen herhangi bir yağ kırpın. Diseksiyon boyunca 1x PBS çözeltisi dalmış dokuların tutun. </li><li> Forseps ile yerde rahim boynuzları Holding, küçük cerrahi makas (Şekil 1D) kullanılarak arası implantasyon bölgesinde kesti bir enine ile rahim implantasyon sitelerinden birini kaldırın. implantasyon sitesi çevrili fetus içerirkoriyoallantoik membran ve rahim, desidual ve plasental dokuların. </li><li> Forseps kullanarak, yerinde siteyi tutun ve plasenta ve desidual dokularda (Şekil 1E) komşu rahim duvarında küçük bir kesi yapmak. Bu rahim duvarına ve fetus içeren chorioallantoic membran (Şekil 1F) hem ayrılmış hale gelene kadar plasenta / desidua çevresinde Trim. </li><li> 1x PBS çözüm plasenta ve ekli desidual doku ve yer çıkarın (3-5 ml; adım 1.12 bakınız). </li><li> (- 5 mi 3) 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş bir Petri kabındaki uterus dokularının bağlı chorioallantoic membran ile çevrelenmiş fetus yerleştirin. Bu dokuların hidrasyon rahim duvarından korioallantoik membranın ayrılmasını kolaylaştıracaktır (adım 1.14 bakınız). </li><li> Ince uçlu bir cımbız kullanarak, yavaşça plasenta yüzey desidual doku (beyaz-gri tabaka) soyun. Bu gerçekleştirinplasenta ve desidual dokularda (Şekil 1G) bütünlüğünü korumak için dikkatli adım. </li><li> (- 5 ml her 3) 1x PBS çözeltisi ile doldurulmuş iki ayrı etiketli Petri kapları plasenta ve desidua dokuları yerleştirin. </li><li> Yavaşça ince uçlu cımbız ile chorioallantoic zarından rahim duvarına çıkarın. Bu rahim dokulardır. </li><li> (- 5 mi 3) 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş bir Petri kabındaki uterus dokularının yerleştirin. </li><li> Tüm implantasyon yerleri işlendikten yineleyerek 1.15 ile 1.8 adımları. </li><li> Enzimatik sindirim sırasında hücre verimini artırmak için çok sayıda uterin, desidual ve plasental dokularda toplayın. dokuların miktarı çöp boyutuna bağlıdır; Bununla birlikte, lökosit yalıtım doku&gt; 2 adet gerektirir. Not: Farklı gestasyonel günlerde implantasyon sitelerinin diseksiyonu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için, soruşturmalar için Kılavuzu, Bölüm İki bulunan resimleri görüntülemekFare Gebelik 42 üzerinde. </li></ol> 2. Rahim, Desidual ve Plasental Doku Ayrılma <ol><li> Uygun doku isimde çok sayıda steril 2 ml konik tüpler etiketleyin ve buz üzerinde enzimatik solüsyon 1,000 ul bir şişe yerleştirin. </li><li> Etiketlenmiş bir 2 ml konik tüp, uterin, desidual ya da plasental dokularda - (150 ila 100 mg), 1 x PBS çözeltisi ile doldurulmuş petri, iki parça aktarın. </li><li> Her bir 2 ml konik tüp içine soğuk bir enzimatik solüsyon 500 ul ekle. </li><li> Ince steril makas ile, ince kıyılmış kadar enzimatik solüsyon batırılır doku ayırmak başlar. Zamanla, süspansiyon sütlü bir görünüm geliştirecektir. Bu aşama, örneğin aşırı manipülasyonu önlemek için en fazla 2 dakikayı geçmemelidir. </li><li> Doku ayrışmış sonra, 2 ml konik tüp, soğuk enzimatik solüsyonun bir ilave 500 ul ekle. </li><li> Buz üzerinde 2 ml konik tüp yerleştirin. </li><li> Tüm dokular işlendikten yineleyerek her doku ile 2.6 ile 2.2 arasındaki adımları. </li><li> 37 ºC bir inkübatör içine buz homojenize doku (kıyılmış dokuya + enzimatik solüsyon) numuneler ile tüm 2 ml konik tüpler aktarın ve nazik bir yörünge ajitasyon (80 rpm) gerçekleştirin. 35 dakika - 30 inkübe. Kuluçka sıcaklığı inkübasyon süresi başlamadan önce stabilize olduğundan emin olun. </li><li> İnkübasyon sonrasında, inkübatör ayrışmış dokularla 2 ml konik tüpler çıkarın ve başka sindirim önlemek için buz üzerine koyun. </li><li> Doku tipine bağlı olarak, steril 50 ml konik tüp etiketleyin. Kapakları çıkarın ve steril bir hücre süzgeç (100 mikron gözenek boyutu) ile değiştirin. </li><li> ~ 1 x PBS çözeltisi 20 ml hücre süzgecinden konik tüp kullanılarak 2 ml ayrışmış dokuları dökün. doku fragmanları hücre süzgecinden kalır ve hücre süspansiyonu içinden geçecek. </li><li> Di yıkayınhücre süzgecinden ssociated dokular 2 - Bir transfer pipeti kullanarak, 1x PBS çözeltisi, 20 ml ile 3 kez. </li><li> Boş 2 ml 1 x PBS çözeltisi (1 mi) ile konik tüp durulayın ve hücre süzgeçler yoluyla içeriğini dökün. </li><li> 50 ml konik tüpler hücre süzgeçler çıkarın ve kapaklarını değiştirin. 4 ºC de 10 dakika boyunca 1.250 xg&#39;de tüpler santrifüj. </li><li> Dikkatle, hücre pelet bozmadan süpernatant aspire. Hücre pelet izole lökositler ve stromal hücreler içerir. </li><li> Fetal sığır serumu (FBS) içermeyen RPMI kültür ortamı, 1 ml hücre pelletini yeniden askıya. Hafifçe karıştırın. Vorteks kullanmayın. </li><li> 5 ml polistiren plastik tüp düzgün FBS 500 ul ekleyin ve yavaş yavaş hücre süspansiyonu kaplaması. </li><li> Hücresel kalıntı PBS / FBS arayüzde korunur ise, oda sıcaklığında freni olmadan 1,100 xg&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj canlı hücre pelet. </li><li> Hücre pelet dokunmadan süpernatant aspire. cell pelet çoğunlukla canlı hücreleri içerir. </li><li> İsteğe bağlı: Aşağıda açıklandığı gibi mononükleer hücreleri konsantre etmek,% 20 doymuş polisakkarit çözümü kullanın. <ol><li> FBS&#39;siz RPMI kültür ortamının 1000 ul hücre pelletini. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir 5 ml polistiren plastik tüpe% 20 doymuş polisakarit çözeltisi 1 ml ilave edilir ve yavaşça, bu çözeltinin üzerine hücre süspansiyonu kaplar. Örnek katman birlikte, hücre süspansiyonu% 20 doymuş polisakarit çözeltisi karıştırma kaçının. </li><li> Frensiz oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 500 xg&#39;de bir salıncak-out rotorlu santrifüj. Bu hücrelerin karıştırma ve degrade kaybetmemek için fren kapatmak için çok önemlidir. Mononükleer hücreler,% 20 doymuş polisakarit çözeltisi ve 1 x PBS çözeltisi arasında arayüzde bulunacaktır. </li><li> Aspire ve süpernatant atın. Hücre topağı çoğunlukla mononükleer hücreleri içerir. Hayırte: gerçekleştirmek için adım 6&#39;ya bakınız, izole lökositlerin hücre kültürü gerçekleştirmek için adım 5. bkz canlılık boyama ve sadece dışı boyama gerçekleştirmek için adım 4. bkz immünofenotıpleme gerçekleştirmek için 3. adımı bkz canlılık boyama ve hücre içi boyama gerçekleştirmek için Manyetik hücre sıralama, adım 7 bkz. </li></ol></li></ol> Tamir edilebilir Hücreler 3. geçerlilik boyaması <ol><li> 1x PBS çözeltisi 1.100 ul hücre pelletini. Hafifçe mikro-pipet kullanılarak karıştırılır. </li><li> 5 ml&#39;lik bir polistiren plastik tüp içine hücre süspansiyonu 100 ul aktarın. 5 ml polistiren tüp 1x PBS çözeltisi 400 ul ekleyin. Bu tüp, doku bir oto-floresan için kontrol edilmesidir. Adım 3.5 kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Yeni 5 ml polistiren plastik hücre süspansiyonunun tüpe Geriye kalan 1000 ul aktarma. Canlılık boya 1 ul ekleyin ve hafifçe homojenize. 4 ° C&#39;de karanlıkta 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> İnkübasyon sonrasında, 1,000 &amp; # ekleyin181; 1 x PBS çözeltisi l. Elle hafifçe karıştırın. </li><li> Santrifüj her ikisi de 5 ml polistiren tüpler 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1250 x g&#39;de (3.2 ve 3.3 adım). Aspire ve süpernatant atın. Not: hücre topağı (aşama 3.3), doku bir oto-floresan için bir kontrol olarak hizmet edecek aşama 4. hücre topağı (aşama 3.2) kullanılır. </li></ol> 4. İmmünofenotipleme <ol><li> Anti-fare CD16 / CD32, 50 ul hücre pelletini (1 seyreltilmiştir: FACS tampon maddesi içinde 100 [% 0.1 BSA,% 0.05 sodyum azid, 1x PBS çözeltisi, pH 7.4]). Yavaşça hücre süspansiyonu karıştırın. Vorteks kullanmayın. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C de karanlıkta 5 ml polistiren bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, hücre-dışı hücre yüzey markörlerinin veya izotip-eşleştirilmiş kontrol antikoru ile reaksiyona sokulması her anti-lökosit monoklonal antikor 50 ul (antikor seyreltme doğrulanması gerekir) ekleyin. Örneğin, lökosit alt popülasyonları analiz anti-mo kullanmak içinCD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 (Tablo 1): Aşağıdaki lökosit hücre yüzey belirteçleri ile reaksiyona antikorları kullanır. </li><li> Hücre-dışı belirteçleri karşı antikorlar, 5 ml polistiren plastik tüpe ilave edildikten sonra, yavaşça karıştırın. 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir. </li><li> Bu kuluçka sırasında hazırlanması ve (iyonu giderilmiş su ile seyreltildi, 1: 5) sabitleme tampon çözeltisi önceden ısıtmak, gerekirse 37 ºC&#39;ye. Kullanımı gereklidir kadar karanlıkta 37 ºC &#39;de tampon tutun. </li><li> 30 dakika inkübasyondan sonra, 5 ml polistiren plastik tüp FACS tampon 500 ul ve hafifçe karıştırın. Bu adım, hücrelerin yıkayın ve bağlanmamış antikor fazlasını uzaklaştırmak için gereklidir. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 1,250 x g&#39;de örnekleri santrifüjleyin. Aspire ve süpernatant atın. Not: hücre içi boyama gerekli değilse, hücre içi boyama gerekli ise, adım 5 bkz geçirgenliği yapmak ve hücreler arasıular boyama burada ve daha sonra sabitleme (adım 4.8) ile devam edin. </li><li> Hücre pelletine önceden ısıtılmış sabitleme tampon çözeltisi 500 ul ilave edin ve 37 ° C &#39;de 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe edilir. </li><li> 5 ml polistiren plastik tüp içine FACS tampon 500 ul koyun. Hafifçe karıştırın. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 1,250 x g&#39;de örnekleri santrifüjleyin. Aspire ve süpernatant atın. </li><li> Her bir örnek için FACS tampon 500 ul ekle. Bu örnekler hemen akış sitometrisi ile analiz edilebilir. En iyi sonuçlar için derhal örnekleri edinin. </li></ol> Unfixable Hücreler 5. geçerlilik boyaması <ol><li> Hücre-dışı immünofenotiplendirme sonra FACS tampon 500 ul hücre pelletini. </li><li> Sadece örnek elde edilmesinden önce 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI, 200 ug / ml) 1 ul ekle. </li><li> Debi sitometresinde DAPI ekledikten sonra 2 dakika - 1 içindeki örnekleri gözünüzde canlandırın. </li></ol><ol><li> Steril bir davlumbaz altında bir iş istasyonu hazırlayın. Bir su banyosu kullanılarak 37 ° C RPMI kültür ortamının önceden ısıtın. </li><li> Hücre sayımı için FACS tampon 1000 ul hücre pelletini. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ve% 0.4 tripan mavisi çözeltisi kullanılarak canlı hücre sayısı, saymak. Toplam canlı hücre sayısını kaydedin. </li><li> Santrifüj 4 ° C&#39;de 1,250 x g&#39;de hücreler 10 dakika FACS tampon kaldırmak için. </li><li> Yavaşça 2-3 kez pipetleme önceden ısıtılmış RPMI kültür ortamında 500 ul hücre pelletini. </li><li> Steril 24 oyuklu bir plaka içerisinde hücrelerin istenilen sayıda plaka ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. Kuluçka süresi araştırma sorusu ile belirlenecektir. </li></ol> 7. Manyetik Hücre Ayırma <ol><li> MS sütunlar, manyetik hücre ayırıcı, 15: Aşağıda yer alan maddelerle temiz bir iş istasyonu kurmakml konik tüpler, 30 mikron ön ayırma filtreleri ve bir çok standı. </li><li> MACS tamponu (% 0.5 BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS çözeltisi, pH 7.2) içinde 500 ul hücre pelletini. </li><li> Otomatik Hücre sayıcı veya hemasitometre ve% 0.4 tripan mavisi çözümü kullanarak, saymak ve toplam canlı hücre sayısını kaydedin. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 1,250 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Aspire ve süpernatant atın. MACS tamponu başka 500 ul ekleyin. </li><li> Üreticinin önerilerine aşağıdaki manyetik ayırma gerçekleştirmek için devam edin. </li><li> Flow sitometri veya mikroskop ile saflığını belirlemek. </li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışmaları anlatmaktadır.

maternal-fetal arayüzünde sızan lökositlerin bolluğu ve fenotipik özelliklerini kaydeden tutarlı veri toplanması gebelikle ilgili komplikasyonlar patogenezini anlamak için gereklidir. Çeşitli teknikler gebelik 31,38,39,43-46 boyunca anne-fetal arayüzünde Fare dokularından elde lökositlerin infiltre izolasyonunu kolaylaştırmak olduğu tarif edilmiştir. Ancak, her teknik farklıdır, her zaman izole hücrelerin canlılığını belirtmez, en önemlisi, enzimler veya enzim kombinasyonları farklı kullanır gerektiren farklı...

Ayırt edici değişiklikler annenin bağışıklık sisteminde ortaya çıktığında gebelik bağışıklık tolerans bir dönemdir. Bu değişiklikler anne fetus, yarı allojenik greft 1 tahammül sağlar. Fetus baba büyük doku uygunluk kompleksi (MHC) 2 antijenleri ve fetal hücreler anne dolaşımında 3 bulunmuştur ifade eder; Ancak, fetus, 4,5 vazgeçmiş değiliz. Bu muamma tam olarak anlaşılmış değildir. En son hipotez maternal-fetal tolerans cinsel birleşme sırasında oluşturulan ve 6,7 döllenme ve tam süreli gebeliği 8-10 sürdürmek için muhafaza belirtiyor. Bu maternal-fetal tolerans dökümü gebeliğin 10-16 erken ve geç evrelerinde hastalık mekanizmasını kabul edilir. Maternal-fetal tolerans T hücreleri (düzenleyici T hücreleri, Th1 hücreleri, Th2 hücreleri ve Th17 hücreleri), mac dahil olmak üzere çeşitli lökosit alt popülasyonları, katılımını gerektirirrophages, nötrofiller, mast hücreleri, NK hücreleri, ve NKT hücreleri, dendritik hücreler ve B hücreleri, gebelik 15,17-19 boyunca yoğunluk ve lokalizasyon bu değişiklik. Annenin bağışıklık sistemi cenin antijenler 20,21 ile etkileşime anatomik sitede - Maternal-Fetal tolerans maternal-fetal arayüzü 20&#39;de zenginleştirilmiştir. Fetal extravillous trofoblastların rahim mukozası 22-24 istila ettiğinde maternal-fetal arayüz plasenta sırasında oluşturulur. Bu arayüz fetal tarafında, fetüsü çevreleyen zarlar plasenta içindeki özel bir epitel yüzey oluşturmak ve sinsityotrofoblast hücreleri anne kanındaki 22 ile doğrudan temas yoluyla besin alışverişini kontrol eder. Arayüzü maternal tarafında, Desidua farelerde bütün desidual hücrelerde% 50% 30&#39;unu lökositlerin heterojen havuz işe. MATERN katılımları yanı sıraEl immun tolerans, bu hücrelerin gebelik sırasında farklı süreçler, örneğin., enfeksiyonlar, döllenmenin gelen üreme sisteminde korunması, embriyo implantasyonu 7,25, desidual anjiyogenez 26 vasküler remodeling 24,27, trofoblast invazyonu 28, plasental anahtar sebeplerindendir kalkınma 24,25 ve nihayetinde, emek ve dağıtım 15,17. Bu nedenle, maternal-fetal tolerans katılan lökositlerin çalışma gebeliğe bağlı komplikasyonların patogenezi aydınlatılması esastır. Immünhistokimyasal ve immünofloresan kullanımı doğrudan görselleştirme ve uterin, desidual veya plasental lökositlerin 29,30 lokalizasyonu için veri üretti ederken, ayrıca bu dokuların 31,32 her lökositlerin belirli alt kümelerini ortaya çıkarmıştır sitometri analizi akış. Ayrıca, sitometri yoğunluğu ve mater oranını belirlemek için kullanılır olmuştur akışNAL fetal arayüz hücre dışı ve hücre içi proteinlerin 8-10,34 33 ve ekspresyon seviyelerini lökosit. Maternal-fetal arayüzünde lökositlerin sitometrik akış analizi tek bir hücre süspansiyonu gerektirir. Desidual, rahim ve plasenta dokularından süzücü lökositlerin izole etmek için, doku ayrışma için iki yöntem kullanılmıştır: mekanik ve enzimatik. Her iki yöntem de, bu dokuların hücre dışı matrisin (ECM) ile ilgili infiltre lökosit ayrılmasını sağlar. Daha az kesme kuvveti ile ilişkili hasar 35 ile lökositlerin yüksek verim verir gibi enzimatik doku ayrışma mekanik doku ayrılma üstündür. Sonuç olarak, mekanik doku ayrışma örnekleri değişkenliği ve heterojenitesini artırabilir dokuların 36, havuzlama gerektirir. Bununla birlikte, mekanik ayrıştırma İlgi konusu antigen enzimatik ayrışma veya değiştirilebilir zaman seçim olabilir hücre işleviFaiz ihtiyacı s korunacak (örn., NK hücrelerinin sitotoksisite) 35. ECM aşağılamak özel enzimlerle proteoliz kullanımı mekanik ayrışma ile gözlenen düşük verim ortadan kaldırır. Çeşitli çalışmalar tripsin 32, kollajenaz 37, DNaz 31, 38 dispase ve çeşitli enzimlerin 32,39 ticari kokteyller kullanımını bildirmişlerdir. Bununla birlikte, doğal ve farklı enzim konsantrasyonu ve sindirim süresi titizlikle tanımlandığı gibidir ve immünofenotipleme için gerekli olan hücre yüzeyi antijenik epitopların bütünlüğünün korunmasını sağlamak için doğrulanması gerekir. Çeşitli yüzey yapıları bir çok monoklonal antikorlar tarafından tanınan lökosit yüzey epitoplarını sıyırma için ünlü olan tripsin gibi bazı enzimler ile, farklı enzimlerin yok farklı olarak duyarlı olan. Bu tarifnamede sunulan bir proteolyt kullanılan bir yöntem olupAccutase denilen ic ve kolajenolitik enzimatik kokteyl. Bu enzimatik solüsyon kadar anne-fetal arayüzünde sıçangil hücreleri ayrıştırma sırasında halen etkin nazik ve ayrışma reaksiyonu sonlandırmak için başka ayrışan reaktifler veya serum eklenmesini gerektirmez. Ayrışma zamanı doğrulanması gerekiyor, ancak Ayrıca, yukarıda belirtilen enzimler 40,41 daha sağlamdır, tedarik edildiği gibi kullanıma hazırdır ve. Doku ayrıştırma her iki tip bir kombinasyonunun kullanılması elde edilen hücrelerin kalitesi ve miktarı artırır; Böylece, çeşitli çalışmalar tatmin edici sonuçlar 31,32,37 ile mekanik ve enzimatik ayrılma kombine kullanımının hayata geçirdik. Burada tarif edilen bir protokol kurulmuş ve laboratuvarda doğrulandı; o sağlam enzimatik ayrıştırma ardından hafif bir mekanik ayrışma bir arada kullanır. Bu protokol izolasyonu ve daha fazla çalışma izin verirmaternal-fetal arayüzünde fare dokularda sızan lökositler (rahim, desidua ve plasenta). Akış sitometrik analizi ile gösterildiği gibi, aşağıdaki protokol aynı zamanda, hücre yüzey belirteçleri ve aşağı doğru uygulamalar için verim kadar canlı hücre bütünlüğünü korur. Son olarak, bu protokol analizi ve maternal-fetal arayüz oluşturan farklı fare dokuların karşılaştırma için hücre hazırlama tutarlılığını korumaktadır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Magentic Hücre Ayırma</td></tr><tr><td>MS Sütunları</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Ayırıcı</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m ön ayırma filtreleri</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüpler</td><td>Thermo Fisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>MACS Tamponu</td><td>Militenyi Biotec</td><td>Laboratuvar hazırlığı</td> <td>(%0.5 sığır serum albümini, 2mM EDTA ve 1x PBS, pH 7.2)</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Akaktaz enzimatik çözelti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>533142</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare hücre dışı antikorlar</td><td>BD Bioscences/eBiosciences</td><td></td><td>Tablo 1</td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Fisher</td><td>S227-500</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD canlılık boyası</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Fiksasyon tampon çözeltisi</td><td>BD Biosciences</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>FACS Tamponu</td><td>BD Biosciences</td><td>Laboratuvar hazırlığı</td><td>%0.1 BSA, %0.05 sodyum azid, 1x PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi %0.4</td> <td>BIO-RAD</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Additional Instruments</td></tr><tr><td>Çalkalayıcılı inkübatör</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Termo Bilimsel Efsane</td><td>LXTR</td><td></td></tr><tr><td>Vakum sistemi</td><td></td><td></td><td>laboratuvarı inşa edildi</td></tr><tr><td>Kuluçka makinesi</td><td>Thermo Scientific</td><td>İnkübatör 3307</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Hassas</td><td>51221035</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sayacı</td><td>BIO-RAD</td><td>TC20 Otomatik Hücre Sayacı</td><td></td></tr><tr><td>Optik ve floresan mikroskoplar</td><td>Zeiss ve Olympus</td><td>Zeiss LSM780 ve Olympus CKX41</td><td></td></tr></tbody></table>

maternal fetal arayüz at fare dokular lökosit İzolasyonu

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Gebelikte immün tolerans annenin bağışıklık sistemi gelişmekte fetusun kabul ve beslemek için ayırt edici değişikliklere uğrar gerektirir. Bu hoşgörü, cinsel birleşme sırasında başlatılan döllenmenin ve implantasyon sırasında kurulan ve gebelik boyunca korunur. Maternal-fetal hoşgörü Aktif hücresel ve moleküler arabulucular plasenta ve uterus ve desidual dokuları içeren maternal-fetal arayüzü olarak bilinen fetal ve maternal dokular arasındaki temas yerinde zenginleştirilmiştir. Bu arayüz, stromal hücreleri ve infıltre edici lökositler oluşur ve bunların bolluğu ve fenotipik özellikleri gebelik boyunca değişir. Maternal fetal arayüzünde infiltre eden lökositlerin gebeliği ayakta yerel mikro-ortam yaratmak nötrofiller, makrofajlar, dendritik hücreler, mast hücreleri, T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri ve NKT hücrelerini içerir. Bu hücrelerin ya da herhangi bir inapprop arasındaki bir dengesizlikOnların fenotipleri de yaklaşımlarına yön değişiklik gebelikte hastalığın mekanizmasını kabul edilir. Bu nedenle, maternal-fetal arayüz sızmak lökositlerin çalışma gebeliğe bağlı komplikasyonlara neden bağışıklık mekanizmaları aydınlatmak için esastır. Burada tarif edilen bir proteolitik ve maternal-fetal arayüzünde fare dokulardan sızan lökositlerin izole etmek kolajenolitik enzimatik kokteyl ile sağlam enzimatik ayrıştırma ardından hafif mekanik ayrışma bir arada kullanan bir protokoldür. Bu protokol, yeterince korunmuş antijen ve fonksiyonel özelliklere sahip uygun bir lökosit (&gt;% 70) yüksek sayıda izolasyon sağlar. İzole edilmiş lökositlerin daha sonra immunofenotip hücre sıralama, görüntüleme, immunoblotting, mRNA ekspresyonu, hücre kültürü, ve karışık bir lökosit reaksiyonları, proliferasyon, sitotoksisite veya tahlilleri gibi in vitro fonksiyonel deneyleri de dahil olmak üzere çeşitli teknikler ile analiz edilebilir.

maternal-fetal arayüzü fare dokuların diseksiyonu Şekil 1&#39;de gösterilmiştir; Bu prosedür, periton boşluğu (Şekil 1A, B), emplantasyon yerlerinin (Şekil 1D) içeren rahim boynuzları (Şekil 1C) ve uterus dokularının toplama (Şekil 1E), plasenta (Şekil 1F) ve desidual dokuları açıklığı kapsamaktadır 16.5 at (Şekil 1G) DPC. Şekil 2 izole makrofajlar morfolojisi göstermektedir (F4 / 80 +)...

Burada açıklanan, farelerin maternal-fetal arayüzündeki (uterus, desidua ve plasenta) dokuların sızan lökositlerini izole etmek ve analiz etmek için bir protokoldür. Bu protokol, çoğu hücre yüzeyi işaretleyicisinin bütünlüğünü korur ve akış sitometrisi analizi de dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için yeterli canlı hücre verir.

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Bu prosedürün genel amacı, fare maternal fetal arayüzündeki infiltre lökositleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle uterus, plasenta ve eua'nın hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. Dokular, enzim içeren bir solüsyonda mekanik disosiyasyonla parçalanır ve ardından enzimatik sindirime tabi tutulur.Elde edilen hücre süspansiyonu daha sonra filtrelenir ve yıkanır; bu aşamada, hedeflenen immün hücreler, fetal bovine serum gradiyenti kullanılarak canlı olmayan hücreler gibi hücre kalıntılarından ayrıştırılır. Sonuç olarak, izole edilen lökositler immünofenotipleme, hücre kültürü veya hücre ayırma işlemleri için kullanılabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikir, maternal-fetal arayüzden lökosit izole etmek için bir protokol oluşturmaya çalışırken, yayınlanmış yöntemlerin ilgilendiğimiz nadir immün hücrelerin izolasyonunu kolaylaştırmadığını fark ettiğimizde ortaya çıktı.Prosedür, laboratuvarımdan araştırma görevlileri olan Mile El Sanchez Rodriguez ve Marcina Hernandez tarafından gerçekleştirilecektir. Maternal fetal arayüz dokularını toplamak için, önce steril bir cerrahi makas kullanarak alt karın bölgesindeki deri ve kas dokusunu tamamen çıkarın. Ardından, uterus ve yumurtalıklar görünür hale gelene kadar diğer tüm organları pens yardımıyla kenara çekin. Daha sonra uterusu periton boşluğunun dışına çıkarın.UCT'nin distalinde yer alan yumurtalıkları ve her bir uterus kornusunun utero tübal bileşkesini bulun. Ardından, kornusları uterus damarlarını içeren mezenterden ayırmak için utero tübal bileşkesinde bir insizyon yapın. Uterus kornuslarını periton boşluğundan ayırmak için serviksten eksizyon yapın.Ardından, uterus kornusunun açılmasını önlemek için serviksin bir kısmını bağlı bırakarak, serviks ile kornusların alt segmenti arasına cerrahi makasla bir insizyon yapın. İmplantasyon bölgelerini hidrate etmek için kornusları ve serviksi 10 ila 15 mililitre PBS ile dolu geniş bir Petri kabına daldırın. Dokulardaki tüm yağları temizleyin.Ardından, forseps ile boynuzları yerinde tutun. Uterustan implantasyon bölgelerinden birini çıkarmak için implantasyon bölgesi üzerinden transvers bir kesi yapın. Şimdi bölgeyi sabit tutun ve plasental ve rezidüel dokuların bitişiğindeki uterus duvarına küçük bir insizyon yapın.Dokular hem rahim duvarından hem de koriyonik membrandan ayrılana kadar plasentanın ve deciduanın çevresini kesin. Ardından plasentayı ve ona bağlı decidual dokuları, üç ila beş mililitre PBS içeren temiz bir Petri kabına aktarın. Fetüsü PBS içeren başka bir Petri kabına aktarın ve plasenta yüzeyindeki beyaz gri decidual dokuyu nazikçe soymak için ince uçlu cımbız kullanın.Plasenta ve ECI dokularının bütünlüğünü korumaya dikkat edin. Plasentayı ve ECI dokularını, PBS ile doldurulmuş, ayrı ayrı etiketlenmiş iki Petri kabına bölün. Ardından, koriyonik allantoik membranın rahim duvarını ince uçlu cımbızla nazikçe çıkarın ve dokuları mekanik olarak ayrıştırmak için bu rahim dokularını PBS ile doldurulmuş yeni bir Petri kabına yerleştirin.Ardından, 100 ila 150 mg uterus disci ve plasenta dokusunu, ayrı ayrı etiketlenmiş 2 mL'lik konik tüplere aktarın. Her tüpe 500 µL soğuk enzimatik çözelti bir ekleyin. Daha sonra, süspansiyonlar oluşana kadar her bir dokuyu steril makas kullanarak en fazla iki dakika boyunca mekanik olarak ayrıştırın.Sütlü bir görünüm oluşmasını bekleyin. Her bir tüpe 500 µL daha soğuk enzimatik çözelti ekleyin ve tüpleri buz üzerine yerleştirin. Ardından, tüm dokuları 37 °C'de, 80 RPM hızında hafif orbital çalkalamayla inkübe edin ve sindirimi durdurmak için 30 ila 35 dakika sonra tüpleri buz üzerine yerleştirin.Şimdi her bir doku bulamacını 100 mikronluk bir süzgeçten geçirerek ayrı ayrı etiketlenmiş 50 mililitrelik konik tüplere süzün ve tüm hücreleri toplamak için her bir iki mililitrelik tüpü ve süzgeci 20 mililitre PBS ile iki ila üç kez yıkayın. Tüm hücreler filtrelendiğinde, bunları santrifüjle çöktürün ve peletlere dokunmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin. İzole edilen lökositleri ve stromal hücreleri, vortekslemeden bir mililitre RPMI kültür besiyeri içinde nazikçe yeniden süspande edin.Ardından, her doku için beş mililitrelik polistiren bir tüpe 500 µL fetal sığır serumu ekleyin ve hücre süspansiyonunu serumun üzerine yavaşça aktarın. Son olarak, tüm hücreler aktarıldığında, hücreleri ara vermeden santrifüjleyin ve hücre peletlerine dokunmadan süpernatantı aspire edin. Bu görüntülerde, decidua ve uterus dokularından izole edilen F4/80 pozitif makrofajların morfolojisi görülmektedir.Kopulasyon sonrası 16,5. günde, hem maternal hem de fetal arayüz dokularından alınan hücreler gösterilmektedir. Bu yöntemle izolasyon sonrası %70'in üzerinde bir canlılık sergileyen bu hücreler; nötrofil, makrofaj, T hücresi, NK hücresi ve dendritik hücre popülasyonları içermekte olup, CD11c eksprese eden makrofajların oranı yüksektir. Maternal-fetal arayüz dokularından izole edilen lökosit alt popülasyonları ayrıca B hücrelerini, CD4 pozitif T hücrelerini, CD8 pozitif T hücrelerini ve bu yoğunluk grafiğinde gözlemlendiği üzere CD3 pozitif CD4 negatif CD8 negatif T hücrelerini de içermektedir.Tamam, bu prosedürü uygularken, inkübatörde doğru sıcaklığı ayarlamak için dokuları ve enzim kokteylini buz üzerinde tutmayı ve bu prosedürü takip eden sindirim sırasında dokularınıza aşırı müdahale etmemeyi hatırlamak önemlidir. İmmünofenotipleme, hücre kültürü, hücre ayıklama ve DNA/RNA izolasyonu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, maternal-fetal arayüzde, uterusta ve plasentada infiltre olan lökositlerin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

isolation-leukocytes-from-murine-tissues-at-maternal-fetal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fare beyni infiltre lökositler elde etmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, sürekli Percoll degrade ve süreksiz Ficoll degrade lökosit zenginleştirilmiş katmanı seçin ve arındırmak için kullanır. İzole lökositler akım sitometrik ölçümleri ile karakterize olabilir.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

Fare genital lenfosit yalıtmak için verimli bir şekilde tarif edilmiştir. Bu yöntem verimli izolasyonu sağlamak için enzim sindirim ve Percoll degrade ayrılık yararlanır. Bu teknik, diğer tür kullanım için de...

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Bu videoda, marjinal hepatik lökositlerin fare karaciğerinden zorla perfüzyon ile izolasyonunu gösteriyoruz.

Bir Fare Karaciğerinden Marjinal Hepatik Lökositlerin İzolasyonu

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Burada açıklanan, insan maternal-fetal arayüzü olan decidua basalis ve decidua parietalis'in sızan lökositlerini izole etmek ve daha fazla incelemek için bir protokoldür. Bu protokol, hücre yüzeyi belirteçlerinin bütünlüğünü korur ve akış sitometrisi analizi ile kanıtlandığı gibi aşağı akış uygulamaları için yeterli canlı hücre verir.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Bu iletişim kuralı bir yöntem için birincil insan decidual hücreleri çeşitli uygulamalar (Yani immunocytochemistry, Akış Sitometresi, vb) için kullanılan terim placentae fetal membranlar toplanan yalıtım gösterir hedefleyen farklı hücre popülasyonlarının gebelik komplikasyonları olarak rol çalışmak için.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

Bu, uterus lenfoid hücrelerini hem hamile hem de hamile olmayan farelerden izole etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, FACS fenotipleme, hücre sıralama, işlevsel tahliller, RNA-seq ve proteomik gibi birden çok aşağı akış uygulaması için kullanılabilir. Buradaki protokol, akış sitometrisi ile kandine doğuştan gelen lenfoid hücrelerin fenotip grup 1 rahiminin nasıl olduğunu göstermektedir.

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

Bu protokol, canlı bağışıklık ve bağışıklık dışı popülasyonların fare akciğerinden kararlı bir durumda ve grip enfeksiyonunu takiben izolasyonunu detaylandırır. Ayrıca epitelyal ve miyeloid hücre alt kümelerini tanımlamak için geçit stratejileri sağlar.

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Öğrenin, fare maternal-fetal arayüzünden lökosit izolasyonu için mekanik ve enzimatik sindirme yöntemini. Bu protokol, akış sitometrisi ve immünofenotipleme için canlı hücre sağlar.

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Daha fazla video keşfet