Name: Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Keşfedin desteklenmiş lipid çift katmanlarının atomik kuvvet mikroskobu ile görüntülenmesi ve kuvvet spektroskopisi yöntemlerini. Bu teknik, membran kalınlığı ve kırılma kuvveti gibi fiziksel özellikleri yüksek çözünürlükle ölçerek biyofizik araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser (no. 0312040 hibe) Max Planck Kurumu, Alman Kanser Araştırma Merkezi, Tübingen Üniversitesi ve Bundesministerium für Bildung und Forschung tarafından desteklenmiştir. Biz bize bu yazının dikkatli okumak için kuvvet eğrisi verileri ve Dr. Jakob Suckale analizi otomatik yardım için Eduard Hermann teşekkür ederiz.

Desteklenen Lipid Bilayers 1. Hazırlama (SLB) 11,12,21 <ol><li> Lipid Karışım ve çok katmanlı veziküllü Cezalı Hazırlanması <ol><li> Önceden aşağıdaki tamponlar hazırlayın. <ol><li> 2.7 mM KCI, konsantrasyonlarda, PBS tampon hazırlanması 1.5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 ve 137 mM NaCl, pH 7.2. </li><li> 150 mM NaCI, 10 mM HEPES, pH 7.4 konsantrasyonlarda SLB (desteklenen lipid iki katmanlı) tamponunu hazırlayın. </li><li> 1 M CaCI2 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. </li></ol></li><li> İstenen bir konsantrasyonda kloroform içinde, aşağıdaki lipitleri çözülür: örneğin, di-oleoil-fosfatidilkolin, 10 mg / ml&#39;de 25 mg / ml ve kolesterol (Chol) 25 mg / ml, sfingomiyelin (SM) &#39;den (DOPC). </li><li> 2: 1: DOPC: SM: Kol mol oranında, bir 2 toplam lipidlerin 1 mg bir çözeltinin yapılması için DOPC 18.38 ul, SM 17.10 ul ve Chol 11.30 ul alır. Conce göre buna uygun hacimleri Vary1.1.2 hazırlanan lipitlerin ntrations. 2: 1: DOPC: SM: kol, zar 25 faz özelliklerini değiştirecek mol oranı değiştirilerek Ancak, 2 molar oranını korumak. </li><li> Vorteks tamamen çözüm karıştırın. Biri floresan mikroskop ile bilayeri görselleştirmek isterse 0.05 mol% bir floresan lipidik boya ekleyin. Not: Uzun zincirli dialkylcarbocyanines ailesini, yaptığımız gibi, DII ve Dio dalga boylarında geniş bir yelpazede hizmet ve ideal lipid membranlar etiketlemek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, rodamin-fosfatidiletanolamin ya da BODIPY-kolesterol gibi flüoresan etiketli lipidler kullanılabilir. Her durumda, boyanın konsantrasyonu lipid bağlı fluorofor yüksek konsantrasyonlarda lipid davranışı 19 değiştirebilirsiniz akılda tutarak, mikroskopi ayarına göre optimize edilmelidir. </li><li> N 2 gazı kullanılarak kloroform (veya herhangi bir kullanılabilir inert gaz gibi Ar gibi He) kapalı kurulayın. </li><li> Bundan başka, kuru tEn azından 1 saat için vakum altında bir karışım, kolesterol. Not: bu lipit karışımı depolamak için, soy gaz ile (N2, Ar veya He) hava üfleme ve -20 ° C&#39;de saklayın. Küçük kahverengi şişelere fazla lipidler-in-kloroform kısım. -20 ° C&#39;de soy gaz ile (N2, Ar veya He) ve mağaza hava yerini, lipit karışımı gibi benzer bir şekilde, kurutun. </li><li> 10 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyona PBS tamponu içinde kurutuldu lipidleri çözülür. </li><li> 1 dakika vorteksleyin, yaklaşık 20 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde kanşım çok katmanlı veziküller içeren, bulanık bir süspansiyon elde etmek için. Flakon kenarlarına yapışmasını hiçbir lipit film olmadığından emin olun. </li><li> 10 ul alikotları (lipid 1 mg 10 bölüntülerin yapar) içine bu süspansiyon dağıtın. </li><li> Sonraki kullanıma kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edin. </li></ol></li><li> Tek lamelli vesiküller hazırlanması Not: tek lamelli vesiküller çeşitli boyutlarda sonikasyon yöntemi ya da kalıptan çekme yöntemi ile hazırlanabilir. Sonikasyon s kullanıround enerji karışımı ajitasyon ve çok katmanlı süspansiyon katmanları ayırmak için. Bu puslu süspansiyon kadar takas ile gösterilir. Ekstrüzyon kesin bir gözenek büyüklüğüne sahip bir membran filtreden geçmesine çok katmanlı veziküller zorlar. <ol><li> Sonikasyon Yöntemi <ol><li> Çok katmanlı lipit süspansiyonlar 10 ul alın ve SLB tampon 150 ul ekleyin. </li><li> Küçük (2 mi) kapaklı cam şişelere karışımı aktarın ve Parafilm ile sızdırmaz. </li><li> 10 dakika süre ile ya da (çapı 50 nm altında, SUV), küçük tek tabakalı veziküller elde etmek için açık hale gelinceye kadar bir banyo sonikatörü içinde, oda sıcaklığında, karışım sonikasyon. </li></ol></li><li> Ekstrüzyon Yöntemi <ol><li> Çok katmanlı lipit süspansiyonlar 10 ul alın ve SLB tampon 150 ul ekleyin. </li><li> Kriyojenik bir tüp içine süspansiyon aktarın. </li><li> Sıvı azot içinde bir kaç saniye için kriyojenik tüp daldırılması lipid süspansiyonu dondurun. </li><li> Çözülmebir kaç dakika için bir su banyosu oda sıcaklığında veya 37 ° C kriyojenik tüp daldırarak Lipid süspansiyonu. Donma-çözülme adımları en az 10 kere tekrarlanır. </li><li> Lipid süspansiyonu ekstrüde etmek amacıyla, 200 nm gözenek boyutuna sahip olan bir polikarbonat membran kullanımı ticari bir ekstrüzyon tertibatı 26 (diğer gözenek boyutları 100 nm ya da 400 nm gibi mevcuttur). Not: Şu anda, iki ekstruder cihazları piyasada mevcut vardır: manuel ekstrüzyon küçük hacimleri (bir kaç ml 200 ul) için mevcuttur. Bu durumda, Örnek elle iki şırınga arasında ileri ve geri süspansiyon iterek zardan basınç altında geçirilir. Üreticisine bağlı olarak, lipid tümbölenler set up asgari hacme ulaşmak için kombine edilmesi gerekir. Daha büyük hacimler için (en fazla 50 mi) daha karmaşık cihazlar kullanıldığı süspansiyon sıkıştırılmış gaz kullanarak polikarbonat zardan itilir. Set-up ve ekstrüzyon koşulları mod göre değişebilirEl. Kullanmadan önce üreticinin talimatlarına bakın. Bu protokol, küçük miktarlar için manuel ekstruder anlamına gelir. </li><li> Ekstruder üzerinden su geçirilerek su içinde ekstrüderi dengelenmesi. Suda membran daldırın. </li><li> Iki piston arasında zarın cihazı monte ve bir şırınga diğerine, ekstrüzyon yoluyla tampon geçirilerek, tampon maddesi içinde dengeye. Bu adım ayrıca sistemin leakiness test sağlar. Bu sızıntı varsa, sökmeye ve tekrar zar değişiyor yenilemek. </li><li> Ekstruder bir şırıngayı (&#39;kirli yüzü&#39;) ile lipid süspansiyon atın. </li><li> Tek odasının lipit süspansiyon ve karşıt odasının boş şırınga içeren şırınga takın. </li><li> Bir ucunda şırınga itin. Zarından ve rakip şırınga içine çözüm geçirin. Bu 1. pass. </li><li> 31 kat gibi bir toplam zar geçirinÇözelti rakip şırınga (&#39;temiz tarafı&#39;) üzerine biter. Not: ekstrüzyon sonra membran kontrol ediniz. Kırık, sonra ekstrüzyon işlemi başarılı değildi ve tekrar edilmesi gerekir. </li><li> Küçük bir tüp içine şırınga boşaltın. 4 ° C &#39;de muhafaza edilmesi durumunda Büyük tek tabakalı veziküller (LUVler) 1-2 gün boyunca stabildir. </li></ol></li></ol></li><li> Mika ve lameller hazırlanması <ol><li> Yıkama etanol önce su ve daha sonra lamelleri. Kuru hava. </li><li> Mika diskleri alın ve yapışkan bant kullanılarak dış katman soyulabilir. </li><li> Lamel üzerine mika diski takın. Biri floresan mikroskop ile bilayers kontrol edebilirsiniz böylece Şeffaf optik yapıştırıcılar optimum bulunmaktadır. </li><li> Optik tutkal / gres kullanarak plastik silindirler (2.5 cm dış çapı 2 cm iç çapı ve 0,5 cm yükseklik) takın. Her şey sızdırmaz olduğundan ve sızıntı olmadığından emin olun. Kolayca inci ayrılabilir olarak silindirlerin yeniden kullanmak isteyen yaparken gres kullanınE lamel ve yıkanmıştır. Plastik silindir boyutları AFM konsol tutucu büyüklüğüne bağlıdır ve buna uygun olarak ayarlanmalıdır. </li></ol></li><li> Katı Destek tek katmanlı veziküller birikmesi <ol><li> Pipetleyin mika doğrudan bütün lipozom çözüm. 300 ul bir hacim ulaşmak için daha fazla SLB tamponu ekleyin. </li><li> 3 mM Ca2 + nihai konsantrasyona ulaşmak için, 1 M kalsiyum klorür çözeltisinin 0.9 ul ekleyin. </li><li> 2 dakika ve daha sonra en az 10 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta, 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Her tampon ile iki katmanlı kapsamaktadır. Hava ve hava kabarcıkları ile irtibat onu yok edecek. Gerekirse İnkübasyon sırasında, yüksek sıcaklıklarda kuluçka, özellikle daha fazla tampon eklemek. Not: İnkübasyon ısılarının, ihtiyaç duyulan lipid karışımları ve fazlar göre değişir. En az 10 dakika kuluçkalama süresi desteklenen iki katmanlı yapılar oluşturmak için gerekli olan, ancak sıcaklık ve bileşimine bağlı olarak, daha uzun olabilir. </li><li> YıkamaSıcak (65 ° C) ile iki tabakalı SLB tamponu 15-20 kat kalsiyum ve kaynaşmamış kesecikler kaldırmak için. Tamponu altında bilayeri tutmak için yıkama adımları sırasında ekstra özen ve yavaşça bilayeri yok önlemek için yıkama solüsyonu pipetlemeyin. </li><li> AFM ölçümlerinden önce oda sıcaklığında soğutun desteklenen bilayers. Bu membran, farklı fazlar oluşturabildiğini gibi alet termal kaymasını en aza indirmek için gereklidir. </li></ol></li></ol> 2. Atomik Kuvvet Mikroskobu Ölçümleri 11,12 <ol><li> Görüntüleme Not: İletişim modu veya mod dokunarak atomik kuvvet mikroskopisi görüntüleme gerçekleştirin. Çözelti içinde Resim desteklenen bilayers; Bu bilayers yok gibi çözüm tamamen buharlaşması için izin vermez. Tek tampon ile çalışıyor olacak gibi, herhangi AFM kısmı sıvı dökülmelerine karşı korumalı olduğunu emin güvenlik önlemlerini dikkate alınız. <ol><li> Yumuşak bir konsol seçin (0.2 N / m yay sabiti tavsiye edilir altında) ve t monteO AFM. Konsol sertlik seçimi kuvvet spektroskopisi için daha önemlidir (ve bu daha sonra ele alınacaktır). </li><li> AFM sahnede örnek takın ve tüm titreşim izolasyonu modülleri açık olduğundan emin olun. Dengeye ve sistemin termal sürüklenme azaltmak için en az 15 dakika boyunca bekleyin. AFM set-up bağlı olarak, ayarlama ve görüntüleme özellikleri değişebilir. Üreticinin kullanma kılavuzuna bakınız. </li><li> Temas edene kadar AFM ucu ile örnek yaklaşın. </li><li> Lipid bilayers genellikle yüksekliği 4 nm olduğundan, (örneğin 1.5 mikron için) en yüksek z-çözünürlüğü verecek cihazın Z-dizi kullanın. </li><li> Görüntünün bir bölge seçin. Çift katlı lipid genel bir bakış, x 25 mikron bölge imajı için iyi bir başlangıç ​​noktası olacaktır 50 mm x 50 mm veya 25 mikron almak için. Daha küçük özellikler belirirse, küçük alanlarda bir kutu görüntüsü (10 mm x 10 mm veya 2 mm x 2 mm). görüntüleme alanının seçimi de çalışma r bağlıdırPiezoelektrik tarayıcı ange. Bunun için alet kılavuzuna bakınız. </li><li> Bilayers çok kırılgan olduğu için, numune ile temas korurken, termal sürüklenme için en az kuvvet ve doğru tutmak için görüntüleme sırasında AFM ucu ayar noktasını ayarlayın. Iletişim modunda, ayar noktasını en aza indirmek. Modunda dokunarak, set noktasını maksimize. </li><li> Polinom tesviye işlevlerine her tarama satırı takarak Süreç görüntüler. AFM üretim şirketi özel yazılım kullanılarak membran ile temas kaybetmek taramalar için hat kaldırma gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Kuvvet Spektroskopisi <ol><li> Üreticinin protokolüne göre yönergeleri izleyerek konsol ayarlayın. Kalibrasyon fotodiyotlar kuvvete (Şekil 1B) elektrik sinyalinin dönüşüm sağlar. <ol><li> Volt uç duyarlılığını (uzunluk birimi olarak) z-piezo hareketi olarak sapma ölçmek yerine, elektrik sinyalini kalibre edin. <br /&gt; Not: AFM bir lazer kullanarak konsol sapmasına değişiklikler konsolun arkasında yansıyan algılar. Lazer mekansal lazer nokta pozisyonunu tespit edebilen bir fotodiyot ulaşır. Bu numune ile temas üzerine eğilir olarak konsol sapmasına bir değişiklik &quot;dikey sapma&quot; olarak foto diyot tarafından tespit edilir ve bu gerilimin birimleri cinsindendir. Konsol z piezo ile taşınır için, düşey sapma, z-piezo hareket ile ilgilidir. Dikey sapma ve z hareketi arasındaki oran hassasiyeti denilen ve mesafe gerilim dönüştürür. </li><li> Genellikle AFM yazılımı dahil termal gürültü frekans yöntemi kullanılarak konsol bahar sabitini hesaplayınız. Bu yöntemde, güç spektrumu yoğunluk arsa oluşturma, salınım frekansına göre gürültü titreşimin genliğini çizilir. Bu arsa rezonans frekansı etrafında bir tepe gösterecektir. Frekans nerede genlik iEn büyük s rezonans frekansı olduğunu. Yazılım tarafından otomatik olarak yay sabitini hesaplamak için tepe etrafında Lorentz işlevi takın. Isıl gürültü yönteminin teorisi için bazı yararlı kaynaklar referanslar 27-30 verilmiştir. </li></ol></li><li> Çift katlı bir alanı görüntüleme sonra kuvvet spektroskopisi gerçekleştirmek için iki katmanlı bir 5 mm x 5 mm bölgeyi seçin. </li><li> O bölgenin 16 x 16 grid kuvvet eğrileri alır, böylece AFM ayarlayın. Bu bölgenin başına 256 kuvvet eğrileri ile sonuçlanır. iki komşu nokta arasındaki boşluk membran alanı sonraki noktaya denk olur bir noktada tarafından tanınacak olan önlemek için yeterli olmalıdır. Bu uç yarıçapına bağlıdır. İki nokta arasında bir 100 mil mesafesi ideal olacaktır. 16 x 16 ızgara içine 5 mm x 5 mm bölgesini bölün. Faz büyüklüğüne bağlı olarak, bir küçük veya daha büyük bölgeyi seçmek ve daha sonra buna göre ızgara boyutunu ayarlayabilirsiniz. </li><li> Ayarlayın z-piezo deplasman400 nm. Bu z-piezo maksimum hareket aralığını belirler. Bu konsol tamamen ölçümler arasında numune uzak geri emin olmak için yeterince büyük olmalıdır. </li><li> 800 nm / sn yaklaşım hızını ayarlamak ve 200 nm / sn hıza geri çekin. Iki tabakalı yapısı ve lipit fazı 6.16 incelenecek bağlı 6.000 nm / sn 400 arasında bir yaklaşım hızı kullanın. </li><li> Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, AFM yazılımı &quot;run&quot; düğmesine basarak, kuvvet eğrileri kazanır. </li><li> Yükseklik eğrileri vs kuvvet olarak kuvvet eğrileri (z-piezo hareketinin bir ölçüsü) kaydedin. Bu husus örnek ile temas dikkate konsol bükülmesini almaz. Veri işleme adımı sırasında, AFM yazılım iki tabakalı kalınlığı için uygun değerler verecek uç-numune ayırma eğrileri (Şekil 1C), vs kuvveti elde etmek için eğilme konsol için düzeltme sağlar. Düzeltme değerleri, genellikle calibr içinde bu buluşa katılmıştırHer kuvvet eğrisi ile kaydedilir tirme. Belirli bir noktada piezo hareketinden, dikey saptırma çıkarılarak uç-numune ayırma hesaplayın. Not: yaklaşım kuvvet eğrisinde tepe (kuvvet değeri aşağı konsol hareketi yaklaşım döngüsü hala olsa bile gider) membran atılım gücüdür iken bu zirve pozisyon ve nokta konum arasındaki fark kuvvet yükselmeye başladığı tekrar zarın kalınlığı sağlar. </li><li> Iyi istatistikler elde etmek için her durum için en az 500 kuvvet eğrileri edinin. Menşe veya MatLab gibi programları kullanarak değerleri bir histogram çiziniz ve dağıtım zirve ve genişliğini almak için Gauss dağılımına histogramlar uygun. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Tunneling+Microscopy+and+Atomic+Force+Microscopy%3A+Application+to+Biology+and+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology.</a> Science. 242, 209-216 (1988).</li>
<li>Gaczynska, M., Osmulski, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+of+biological+complexes%3A+What+can+we+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Curr%2C+Opin.+Colloid+In%22%5BJournal%5D)">AFM of biological complexes: What can we learn.</a> Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).</li>
<li>Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -C., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+for+structure+and+dynamics+of+biomembranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">AFM for structure and dynamics of biomembranes.</a> BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).</li>
<li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+A+Nanotool+in+Membrane+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-US%22%5BJournal%5D)">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).</li>
<li>Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRedondo-Morata%2C+L+%22Atomic+Force+Microscopy+in+Liquid%3A+Biological+Applications%22">Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications</a>. Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. , Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+of+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy of Biological Membranes.</a> Biophys. J. 96, 329-338 (2009).</li>
<li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Solid-Supported+Lipid+Bilayers+by+Spin-Coating%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li>
<li>Raviakine, I., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Supported+Phospholipid+Bilayers+from+Unilamellar+Vesicles+Investigated+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy.</a> Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).</li>
<li>Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+AFM+and+Two-Focus+SFCS+Study+of+Raft-Exhibiting+Model+Membranes.+%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. </a> ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).</li>
<li>Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+effects+on+membrane+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics.</a> Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).</li>
<li>Domènech, Ò, Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+and+structural+study+of+the+main+phospholipid+components+comprising+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane.</a> BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).</li>
<li>Domènech, Ò, Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+from+hexagonal+phases%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers from hexagonal phases.</a> BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).</li>
<li>Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+line+tension+on+the+lateral+organization+of+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes.</a> J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).</li>
<li>Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Force+Spectroscopy+on+Supported+Lipid+Bilayers%3A+Effect+of+Temperature+and+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation.</a> Biophys. J. 103, 38-47 (2012).</li>
<li>Butt, H. -J., Franz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rupture+of+molecular+thin+films+observed+in+atomic+force+microscopy+I.+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory.</a> Physical Review E. 66, 031601(2002).</li>
<li>Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Temperature+on+the+Nanomechanics+of+Lipid+Bilayers+Studied+by+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy.</a> Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).</li>
<li>Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raft+domain+reorganization+driven+by+short-+and+long-chain+ceramide%3A+a+combined+AFM+and+FCS+study%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study.</a> Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).</li>
<li>Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+spectroscopy+as+a+tool+to+investigate+the+properties+of+supported+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Techniq%22%5BJournal%5D)">Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes.</a> Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).</li>
<li>García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+Formation+by+a+Bax-Derived+Peptide%3A+Effect+on+the+Line+Tension+of+the+Membrane+Probed+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM.</a> Biophys. J. 93, 103-112 (2007).</li>
<li>Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+future+of+scanning+probe+microscopy%3A+Combining+atomic+force+microscopy+with+other+surface-sensitive+techniques%2C+optical+microscopy+and+fluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques.</a> Nanoscale. 1, 40-49 (2009).</li>
<li>Simons, K., Vaz, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+Systems%2C+Lipid+Rafts%2C+and+Cell+Membranes1%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Bioph.+Biom%22%5BJournal%5D)">Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1.</a> Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).</li>
<li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rafts+defined%3A+a+report+on+the+Keystone+symposium+on+lipid+rafts+and+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function.</a> The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).</li>
<li>Kahya, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Lipid+Mobility+of+Raft-exhibiting+Model+Membranes+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li>
<li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome%3A+classification%2C+preparation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Liposome: classification, preparation and applications.</a> Nanoscale Research Letters. 8, 102(2013).</li>
<li>Butt, H. -J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+thermal+noise+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Calculation of thermal noise in atomic force microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li>
<li>Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973(2000).</li>
<li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64(1998).</li>
<li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310(2005).</li>
<li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li>
<li>Lee, M. -T., Chen, F. -Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-US%22%5BJournal%5D)">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li>
<li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+physical+journal.+E%2C+Soft+matter%22%5BJournal%5D)">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li>
<li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li>
<li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li>
<li>Rigaud, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%3A+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Medical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

DOPC oluşan SLBs: SM: Kol (2: 2: 1), kalsiyum klorür ile indüklenen vezikül adsorpsiyon ve yırtılması sonrasında mika oluşmuştur. Bu lipit kompozisyonu L D ve L değeri O fazlar ayrıldı. Ğ fazı sfingomyelin ve kolesterol açısından zengin ve L, D aşaması 11&#39;den daha az sıvı / daha viskoz (Şekil 1A) olarak bulunmuştur. L d aşamasından L o ayrılması çevreleyen (Şekil 1B, C) ​​yukarıda yükseltilmiş dairesel yapı...

Atomik Kuvvet mikroskopisi (AFM), çok keskin ucu 1 ile konsol kullanılarak numunenin bir alanı boyunca tarama bir yüzeyin bir görüntü oluşturur. konsol hareketi numunesinin yüzey topolojisini araştırıyor. Sıvı 2-5 hava ya da doğala yakın halde sabit örnekleri analiz çok yönlülüğünü nedeniyle, protein, DNA, ve membran da dahil olmak üzere - AFM yaygın biyolojik moleküllerin uygulanmıştır. Apart nanometre aralığında, yüksek çözünürlüklü görüntüleme yeteneği gelen, AFM konsol etkileşim kuvvetlerini (yapışma ve itme) ve örnek 5,6 mekanik özelliklerini araştırmak üzere bir yay gibi davranır. Bu kuvvet spektroskopisi diye bilinmektedir. Bu modda, prob birinci numune (Şekil 1A) ile temasını kaybeder kadar daha sonra geri çekilir, örnek yaklaşır ve bunun üzerine bir kuvvet uygular. oluşturulan eğriler uygulama hem de konsol mesafenin bir fonksiyonu olarak kuvvet gösterirhamamböceği ve geri çekilme. Elastikiyet modülüne dahil olmak üzere birçok özellikler, bir malzemenin sertliğini ölçmek için, ve yapışma güçleri elde edilebilir. Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır bir katı destek üstünde yatan biyolojik model membranlar - genellikle mika, borosilikat cam, erimiş silis veya silikon 7 oksitlenmiş. Bunlar vesikül birikimi gibi çeşitli teknikler kullanılarak hazırlanmaktadır, Langmuir-Blodgett yöntemi ve 8,9 spin kaplama. AFM görüntüleme bu desteklenen ikili tabakalar 10 oluşumunu takip ve farklı bileşimler 11-15 membranları tarafından oluşturulan farklı yapıları incelemek için kullanılmıştır. Yaklaşım eğrisi de bir zirve desteklenen bilayers sonuçlarına kuvvet spektroskopisi gerçekleştirme. Bu zirve bilayeri delmek için gerekli kuvveti gösterir ve atılım kuvvet denir. iki tabakalı kalınlığı da kuvvet eğrisi 6 kullanılarak ölçülebilir. bilayers tipik atılım gücü1-50 arasındaki aralık NN 6. Bu özellikler, lipit ambalaj (sıvı veya jel fazı) ve yapının (asil zincir uzunlukları ve doymamışlık derecesi) ve zar-aktif maddeler 16 tarafından değiştirilmiş bağlıdır. rüptür arkasındaki teori 17 açıklanmıştır ve bu konsol yumuşaklık, uç yarıçapı ve yaklaşım hızı gibi diğer deneysel parametreler de atılım gücü 15,16,18 etkiler. Kuvvet spektroskopisi zar 21 stabilitesi, farklı lipit fazları 11,19, peptidler gibi bir bileşim bağımlı değişiklikler 12,20, hem de diğer biyomoleküllerin etkileri özelliklerini analiz etmek için kullanılmıştır. Desteklenen iki katmanlı yassı yönelimi daha iyi bir yapı ve membran özelliklerini karakterize etmek için bu yüzey plazmon rezonans 22 ve floresan mikroskobu 11,19 gibi diğer yöntemler ile AFM birleştirilmesi için avantajlıdır. Bu ayrıntılı video protocol vezikül birikimi kullanarak desteklenen lipit katmanlarını hazırlamak ve AFM ve kuvvet spektroskopisi ile bunları analiz etmek amaçlanmaktadır. Çeşitli büyüklüklerde veziküller iki katmanlı yapılar hazırlamak için kullanılabilir olsa da, bu protokol, küçük ve büyük tek lamelli vesiküller odaklanmaktadır. Faz sıvı emretti (ğ) ve sıvı düzensiz (L d) aşamalarında ayırmak Desteklenen bilayers 11,15 karakterize edildi. 2: 1 oranında membran 2 di-oleoil-fosfatidilkolin (DOPC), sfingomiyelin (SM) ve kolesterol (kol) oluşmaktadır. Bu kompozisyon modelleri, protein kaçakçılığı ve sıralama, hücre sinyalizasyon ve diğer hücresel süreçleri 23,24 önemli platformlar olarak davranmaya önerilmiştir lipid sallar.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil- sn-glisero-3-fosfokolin</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>Kapalı şişelerde liyofilize toz olarak gelir. Açıldıktan sonra tüm tozu kloroformda çözün. Fazla miktarda kurutulmuş lipid filmler olarak, inert atmosfer altında, -20 ° C'de saklayın. &deg;C. <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; adresini ziyaret edin; görünüm=makale& Kimlik=1679& Depolama ve işleme hakkında daha fazla bilgi için Itemid=398"></a>.</td></tr><tr><td>Sfingomyelin (Beyin, Domuz)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>Büyük sızdırmaz plastik kaplarda liyofilize toz halinde gelir. Açıldıktan sonra bir spatula toz tozunu kloroformda çözün. Fazla miktarda kurutulmuş lipid filmler olarak, inert atmosfer altında, -20 ° C'de saklayın. &deg;C. <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; görünüm=makale& Kimlik=1679& Depolama ve işleme hakkında daha fazla bilgi için Itemid=398"></a>.</td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Avanti Polar Lipidler, Inc.</td><td>700000P</td><td>Büyük sızdırmaz plastik kaplarda liyofilize toz olarak gelir. Açıldıktan sonra bir spatula toz tozunu kloroformda çözün. Fazla miktarda kurutulmuş lipid filmler olarak, inert atmosfer altında, -20 ° C'de saklayın. &deg;C. <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; görünüm=makale& Kimlik=1679& Depolama ve işleme hakkında daha fazla bilgi için Itemid=398"></a>.</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl), %99,8</td> <td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl), %88</td> <td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidrojenfosfat (Na<alt>2< alt>HPO<alt>4</alt>), %>99</td> <td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum dihidrojenfosfat (KH<alt>2</alt>PO<alt>4</alt>), %99</td> <td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2), moleküler biyoloji sınıfı</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, moleküler biyoloji sınıfı</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Cam lamel, 24&nbsp; x&nbsp; 60&nbşk; mm, 1&nbsp; mm kalınlık</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>Punch ve Kalıp Seti</td><td>Hassas Marka Ürünleri, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>Optik Yapıştırıcı</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>Uzun dalga boylu UV ışığı altında kürlendiğinde sertleşen sıvı yapıştırıcı.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Mica,</td><td>NSC Mica Exports Ltd.'yi engelliyor.</td><td></td><td>Bunlar, alanı en az 1 inç kare olan ve kalınlığı 0,006 inç ile 0,016 inç arasında değişen mika parçalarıdır. Nakliye için şirket tarafından belirli bir boyuta kesilirler. Küçük mika diskler, zımba ve kalıp seti kullanılarak mika bloklarından delinebilir. Mika'yı her zaman eldiven veya cımbızla tutun.</td></tr><tr><td>Laboratuvar Ekipmanları Gres</td><td>Delici Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>Lipozom Ekstruder</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>Alternatif olarak Northern Lipids, Inc.'in tekliflerine de bakabilirsiniz.</td></tr><tr><td>Yapışkan Bant</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Bant 810 (1 inç)</td><td></td></tr><tr><td>Banyo Sonikatörü</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>Isıtma yok, Frekans: 35 kHz, Ultrasonik Tepe Çıkışı: 160 W, HF Güç: 40 W. (<a href="http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf">Veri sayfası</a>)</td></tr><tr><td>Silisyum Nitrür AFM Konsol&nbsp;</td><td>Bruker AFM Probları</td><td>DNP-10</td><td>Her konsolun dört ucu vardır ve nominal uç yarıçapı 20 nm'dir (mümkün olan maksimum 60&nbsp; nm). Spesifikasyonlara bağlı olarak, 18 kHz rezonans frekansı ve 0,06 N/m nominal yay sabiti ile D ucunu kullanıyoruz.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II, Zeiss Axiovert 200</td><td></td> üzerine monte edilmiştir</tr></tbody></table>

atomik kuvvet mikroskobu görüntüleme ve desteklenen lipid bilayers kuvvet spektroskopisi

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), biyolojik zarların görüntülenmesine izin veren çok yönlü, yüksek çözünürlüklü bir görüntüleme tekniğidir. Membran alt yapılarını ve hatta tek tek molekülleri incelemek için yeterli büyütme oranına sahiptir. AFM, membranların etkileşimlerini ve mekanik özelliklerini ölçmek için bir kuvvet probu görevi görebilir. Desteklenen lipid çift katmanları, AFM çalışmalarında geleneksel olarak membran modelleri olarak kullanılır. Bu protokolde, desteklenen çift katmanların nasıl hazırlanacağını ve AFM kullanarak yapılarını ve mekanik özelliklerini nasıl karakterize edeceklerini gösteriyoruz. Bunlar, iki tabaka kalınlığı ve nüfuz etme kuvvetini içerir. 
AFM görüntüleme ve kuvvet spektroskopisi tarafından sağlanan bilgiler, membranların mekanik ve kimyasal özelliklerini tanımlamaya yardımcı olur. Bu özellikler, çevresel stresten hücre hemostazını korumak, zar proteinlerini bir araya getirmek ve protein komplekslerini stabilize etmek gibi hücresel süreçlerde önemli bir rol oynar.

DOPC oluşan Desteklenen lipid bilayers: SM: Chol (2: 2: 1) AFM içinde görüntülendi (Şekil 2 AC). Çünkü lipit kompozisyonu, SM / Chol-zengini L o ve DOPC zengin L d fazlar gözlenmiştir. AFM görüntüleme yükseklik profili zar yapısı hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Yükseklik profili bakarak, iki tabakalı kalınlığı temin edilebilir membranın (Şekil 2B), veya L o / L D fazlar arasındaki yükseklik farkından kusurların varlığında ölçülebilir. B...

Desteklenen lipid çift katmanlarının hazırlanması ve atomik kuvvet mikroskobu ve kuvvet spektroskopisi kullanılarak karakterizasyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, faz ayrışması gösteren membranların fiziksel özelliklerini atomik kuvvet mikroskobu kullanarak görüntülemek ve incelemektir. Bu işlem, öncelikle faz ayrışmalı bir lipid karışımı oluşturmak için dilio, fosfatidilkolin, fgo, miyelin ve kolesterolün ikiye iki bire oranında karıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, lipozom süspansiyonunun atomik kuvvet mikroskobu yardımıyla bir MICA yüzeyine çöktürülmesiyle desteklenmiş lipid çift katmanları hazırlanır.Ardından çift tabakanın yüzeyi taranarak, yükseklik gibi yapısal özelliklerin ölçülebildiği topografik bir görüntü elde edilir. Daha sonra, çift tabakanın fiziksel özelliklerini, özellikle de kırılma kuvvetini ve membran kalınlığını incelemek amacıyla çift tabakanın belirli bölgelerinde kuvvet spektroskopisi uygulanır. Sonuç olarak FM görüntüleri ve kuvvet eğrileri temelinde, farklı lipid fazları arasındaki özellik farkları ortaya konur.Bu tekniğin floresan mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çözünürlükteki artış ve bir FM'nin numune üzerinde inceleyebileceği ek özelliklerdir. Bu yöntem, biyolojik membranların yapısı ve bu membranlara gömülü proteinler gibi biyofizik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, membranın fiziksel özelliklerini inceleyebilir ve kompozisyondaki değişikliklerin veya membran aktif ajanların eklenmesinin bu özellikleri nasıl değiştirebileceğini izleyebiliriz.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, numunenin hassas doğası nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Bu durum numune hazırlama, taşıma, kantilever seçimi ile FM görüntüleme ve spektroskopi koşulları üzerinde etkiler yaratır. DOPC, spino, myelin ve kolesterolü istenen konsantrasyonlarda kloroform içinde çözerek başlayın. Ardından, toplamda bir miligram toplam lipid ve sırasıyla ikiye ikiye bir molar oranına sahip bir çözelti hazırlamak için 18.38 µL DOPC, 17.1 µL sing myelin ve 11.3 µL kolesterolü birleştirin.Bir çözeltiyi vorteksleyerek karıştırın, karışımı azot gibi inert bir gaz kullanarak kurutun ve ardından en az bir saat boyunca vakum altında daha fazla kurutun. Sonrasında, kurutulmuş lipidleri 10 mg/mL konsantrasyona ulaşacak şekilde 100 µL PBS içinde çözün. Karışımı yaklaşık bir dakika boyunca kuvvetlice vorteksleyin.Çok katmanlı veziküller içeren bulanık bir süspansiyon elde etmek için, flakonun kenarlarında hiçbir lipid filminin kalmadığından emin olun. Çok katmanlı lipid süspansiyonundan 10 µL alın ve üzerine 150 µL desteklenmiş lipid çift tabaka tamponu ekleyin.Ardından çözeltiyi karıştırın, iki mililitrelik kapaklı küçük bir cam şişeye aktarın ve parafilm ile mühürleyin. Karışımı oda sıcaklığında, bir sonikatör banyosunda 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Bu süre zarfında çözelti berraklaşmalı ve çapı yaklaşık 50 nanometre olan küçük unilameller veziküller oluşmalıdır.Cam lamelleri önce suyla, ardından etanolle yıkayın ve ardından havada kurumaya bırakın. Sonrasında, Mika diskleri alın ve dış katmanı yapışkan bant kullanarak soyun. MICA diskini, bir damla şeffaf optik yapıştırıcı kullanarak lamele sabitleyin.Ardından, vakum gresi kullanarak plastik silindirleri MICA'ya sabitleyin ve sızıntı olmadığından emin olun. Lipozom çözeltisinin tamamını doğrudan mika üzerine pipetleyin ve toplam hacmi 300 µL'ye tamamlamak için 140 µL destekli lipid çift tabaka tamponu ekleyin. Sonrasında, kalsiyumun nihai konsantrasyonu 3 mM olacak şekilde 0,9 µL 1 M kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin; örnekleri 37 °C'de iki dakika ve ardından en az 10 dakika boyunca 65 °C'de inkübe edin; bu aşamada destekli lipid çift tabaka tamponunu da 65 °C'ye önceden ısıtın.Numunenin kurumasını önlemek için gerekirse tampon ekleyin. Numune haznesinin bir lamel ile kapatılması da numunenin nemli kalmasını sağlayacaktır. Ardından, kalsiyumu ve kaynaşmamış vezikülleri uzaklaştırmak için numuneyi önceden ısıtılmış destekli lipid tabakası tamponu ile 10 ila 15 kez nazikçe durulayın.Yıkama adımları sırasında, çift tabakanın yıkama sonrası kurumaması için ekstra özen gösterin. Destekli çift tabakaları oda sıcaklığına kadar soğutun. Atomik kuvvet mikroskobuyla ölçümlere başlamadan önce, lipid çift tabakalarının bir çözelti içindeki görüntülemesini gerçekleştirmek için atomik kuvvet mikroskobunu veya bir FM'yi hazırlayın.Üretici spesifikasyonlarına uygun olarak kontak modunu kullanarak, örneğin tüm deney boyunca tampon çözeltinin içinde kalmasını sağlamak için örneğe tampon ekleyin. Örneği AFM tablasına yerleştirin ve tüm titreşim izolasyon modüllerinin açık olduğundan emin olun. Sistemin dengelenmesi ve termal sürüklenmenin azalması için en az 15 dakika bekleyin.Ardından, temas sağlanana kadar yumuşak bir AFM kantilever ucuyla numuneye temas modunda yaklaşın. Bilayer yapıları çok kırılgan olduğundan, kuvveti minimumda tutmak ve numuneyle teması sürdürürken termal sürüklenmeyi düzeltmek için temas modu görüntüleme sırasında AFM ucunun set noktasını minimize edin. Görüntüleme tamamlandığında, her tarama satırını polinomyal seviyelendirme fonksiyonlarına uydurarak görüntüleri işleyin.Membranla teması kesilen taramalar için çizgi kaldırma işlemi uygulayın. Elektriksel sinyalin kuvvet ölçümüne doğru dönüşümünü belirlemek amacıyla, AFM üretim şirketinin tescilli yazılımını kullanarak üretici protokolünü takip edip kantileveri kalibre edin. Bilayer'ın bir alanının görüntülemesini yaptıktan sonra, kuvvet spektroskopisi gerçekleştirmek için bilayer üzerinde beş mikron çarpı beş mikronluk bir bölge seçin.AFM'leri, ilgili bölgede 16'ya 16'lık bir ızgara şeklinde kuvvet eğrileri alacak şekilde ayarlayın; bu işlem bölge başına 256 kuvvet eğrisi ile sonuçlanacaktır. Ardından, Z piezo deplasmanını 400 nanometreye ayarlayın. Bu işlem, z piezonun maksimum hareket aralığını belirler ve ölçümler arasında kantileverin numuneden tamamen geri çekilmesini sağlar.Ardından, yaklaşma hızını 800 nanometre/saniye ve geri çekilme hızını 200 nanometre/saniye olarak ayarlayın. Ayrıca, bu durumda her bir kuvvet eğrisi için maksimum hedef kuvveti 12 nano Newton olarak belirleyin. Tüm parametrelerin kurulumu tamamlandıktan sonra, AFM yazılımının çalıştırma düğmesine basarak kuvvet eğrilerini elde edin.İyi bir istatistik sağlamak için her koşul için en az 500 kuvvet eğrisi elde edin, değerlerin bir histogramını çizin ve ardından dağılımın tepe noktasını ve genişliğini elde etmek için histogramları bir Gauss dağılımına uydurun. Bu çalışmada kullanılan lipid kompozisyonu nedeniyle iki ana membran bölgesi oluşur. Bunlardan biri sphingomyelin ve kolesterolden oluşan sıvı düzenli bölge, diğeri ise temel olarak DOPC'den oluşan sıvı düzensiz bölgedir.AFM görüntülemesinden elde edilen yükseklik profili, incelenerek membran yapısı hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Bilayer kalınlığı, membrandaki defektlerin varlığı kullanılarak ölçülebilir. Yükseklik haritası ayrıca düzenli ve düzensiz fazlar arasındaki yükseklik farkını ölçmek için de kullanılabilir.Kuvvet spektroskopi modundan elde edilen kuvvet eğrileri, burada gösterildiği gibi kuvvet eğrisinin zirvesindeki kuvvet değerinin alınmasıyla kırılma kuvvetini ölçmek için kullanılır. Ek olarak, kuvvet eğrisinin zirvesindeki mesafe değerinden, kuvvet eğrisinin tekrar yükselmeye başladığı mesafe değerinin çıkarılmasıyla membran kalınlığı hesaplanabilir. Bu prosedür uygulanırken, termal sürüklenme etkilerini ve uç üzerindeki D birikimini düzeltmek için B katmanlama çözeltisini korumanın ve FM düzeneğini sürekli izlemenin önemli olduğunu unutmamak gerekir.Membran dinamikleri gibi ek soruları yanıtlamak için konfokal floresan mikroskopi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, destekli tabakaların nasıl hazırlanacağı ve bu çift tabakaların fiziksel özelliklerini görüntülemek ve incelemek için bir FM'nin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, mikroakışkan platform adı verilen, desteklenen bir lipid çift tabakasının fosfatidiletanolamin lipidine etiketlenmiş pH'a duyarlı floresan boya kullanarak, pH modülasyon testini kullanarak mikroakışkan bir modelde protein-fosfoinositid etkileşimlerini gösteriyoruz. Proteinin fosfolipide bağlanmasından sonra pH'daki modülasyonlar floresan söndürmeye neden olur.

Protein-Fosfoinositid Etkileşimlerini Tespit Etmek için Desteklenen Lipid Çift Katmanları Üzerinde pH Modülasyon Testi

Biz yüksek çözünürlüklü mikroskopi için mika desteklenen lipit katmanlarını hazırlamanın bir yöntem mevcut. Mica bir atomik ölçekte şeffaf ve düz, ancak nadiren nedeniyle zorluklar ele görüntülenmesinde kullanılan; bizim hazırlık mika tabakanın da birikimi ile sonuçlanır, ve iki katmanlı hazırlanmasında kullanılan malzemeyi azaltır.

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Çok çeşitli tek molekülleri kovalent olarak bir AFM ucuna bağlamak için bir protokol sunulmuştur. Bu moleküllerin katı mesnetler ve biyo-arayüzler üzerindeki yapışma kuvvetini ve serbest enerjisini belirlemek için prosedürler ve örnekler verilmiştir.

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Biz lipid veziküller kullanmadan katı yüzeyler üzerinde desteklenen lipid çift oluşturmak için deneysel bir protokol mevcut. Çeşitli biyolojik uygulamalarda, kolesterol açısından zengin bir etki ile, bir lipid, silikon dioksit ve altın iki tabakalı olarak desteklenen zarları meydana getirmek üzere, bir aşamalı bir yöntemi göstermektedir.

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

Protein fonksiyonelleştirilmiş düzlemsel cam destekli lipid çift katmanlarının hazırlanması, içindeki protein hareketliliğinin belirlenmesi ve protein yoğunluklarının ölçülmesi burada gösterilmiştir. Yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip tek çift katmanlı yerleşik florokromların görselleştirilmesine olanak tanıyan, gürültüsü azaltılmış bir Toplam İç Yansıma mikroskobu oluşturmak için bir yol haritası özetlenmiştir.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

Burada, tek bir molekül duyarlılık ve ~ 15 msn zaman çözünürlüğü ile polarize TIRFM kullanılarak lipozomlar ve mikroakışkan kanallarda desteklenen iki katmanlı arasındaki tek tuzak aracılı füzyon olayları tespit etmek için bir protokol mevcut. Lipid ve çözünür kargo sürümü aynı anda tespit edilebilir. Lipozom boyutu, lipit yayınım ve füzyon gözenek özellikleri ölçülmüştür.

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

Biz sıvı genlik modülasyonu (dokunarak modu) atomik kuvvet mikroskobu ile alt nanometre çözünürlüklü görüntüler elde etmek için bir yöntem mevcut. yöntem ticari atomik kuvvet mikroskobu üzerinde gösterilmiştir. Biz parametrelerin seçimlerimizde arkasındaki mantığı açıklamak ve çözünürlük optimizasyonu için stratejiler önermek.

Sıvı olarak Genlik modülasyonu Atomik Kuvvet Mikroskobu ile alt nanometre Çözünürlüklü Görüntüleme

Bu makalede lipid membranlarının nötron spin eko (NSE) çalışmalarında örnek hazırlama, veri azaltma ve veri analizi protokolleri açıklanmaktadır. Lipitlerin judicious döteryum etiketlemesi, üzerinde hayati biyolojik süreçlerin meydana geldiği mezoskopik uzunluk ve zaman ölçeklerinde farklı membran dinamiklerine erişim sağlar.

Lipid Membran Dinamiği ve Membran-Protein Etkileşimleri için Benzersiz Bir Prob Olarak Nötron Spin Eko Spektroskopisi

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) prob ucu tarafından bir numune yüzeyine uygulanan temas alanının ve kuvvetin ölçülmesi, nano ölçekli mekanik özellik belirlemeyi mümkün kılar. Elastik modülü veya diğer nanomekanik özellikleri ölçmek için yumuşak ve sert numunelerde havada veya sıvıda AFM konsol bazlı nanogirinti uygulamak için en iyi uygulamalar tartışılmaktadır.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Konsol Tabanlı Nanogirinti: Hava ve Sıvıda Nanoölçekte Mekanik Özellik Ölçümleri

Gramicidin A-doped damlacık arayüz çift katmanlarını bir yere toplamak, elektriksel olarak uyarmak ve analiz etmek için deneysel bir protokol sunulur. Lipid-protein yapı-fonksiyon ilişkileri, membran alanı, iyonik akı ve tek kanal iletkenliğindeki değişiklikler ölçülerek ve bu yanıtların, elektriksel sinapslardan ilham alan bir membran modelinde iyonik iletkenlikteki plastisite benzeri değişikliklerle ilişkilendirilmesiyle nicelendirilir.

Damlacık Arayüz Bilayerları Kullanarak Lipid-Protein Zar Yapı-Fonksiyon Karakterizasyonu

Keşfedin desteklenmiş lipid çift katmanlarının atomik kuvvet mikroskobu ile görüntülenmesi ve kuvvet spektroskopisi yöntemlerini. Bu teknik, membran kalınlığı ve kırılma kuvveti gibi fiziksel özellikleri yüksek çözünürlükle ölçerek biyofizik araştırmalarına katkı sağlar.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Daha fazla video keşfet