Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, atomik kuvvet mikroskobu kullanarak faz ayırıcı zarların fiziksel özelliklerini görüntülemek ve araştırmaktır. Bu, önce bir faz ayırıcı lipit karışımı oluşturmak için dilio, fosfatidilkolin, fgo, miyelin ve kolesterolün iki ila ikiye bir oranında karıştırılmasıyla elde edilir. Daha sonra, desteklenen lipid çift katmanları, lipozom süspansiyonunun atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak bir MICA® yüzeyine bırakılmasıyla hazırlanır.

Çift tabakanın yüzeyi daha sonra taranır ve yükseklik gibi yapısal özelliklerin ölçülebildiği topografik bir görüntü üretilir. Bir sonraki kuvvet spektroskopisi, çift tabakanın fiziksel özelliklerini, özellikle de atılım kuvveti ve membran kalınlığını araştırmak için çift tabakanın belirli alanlarında gerçekleştirilir. Sonuç olarak, sonuçlar, bir FM görüntülerine ve kuvvet eğrilerine dayalı olarak farklı lipid fazları arasındaki özelliklerde farklılıklar olduğunu göstermektedir.

Bu tekniğin floresan mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bir FM'nin numune üzerinde inceleyebileceği çözünürlük ve ek özelliklerdeki artıştır. Bu yöntem, biyolojik zarların yapısı ve bu zarlara gömülü proteinler gibi biyofizik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, zarın fiziksel özelliklerine de bakabilir ve zar aktif maddelerin bileşimindeki veya ilavesindeki değişikliklerin bu özellikleri nasıl değiştirebileceğini izleyebiliriz.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, numunenin kırılgan doğası nedeniyle mücadele edeceklerdir. Bunun numune hazırlama, taşıma konsol seçimi ve FM görüntüleme ve spektroskopi koşulları üzerinde etkileri vardır DOPC, spino, miyelin ve kolesterolü istenen konsantrasyonlarda kloroforma çözerek başlayın. Daha sonra 18.38 mikrolitre DOPC, 17.1 mikrolitre sing miyelin ve 11.3 mikrolitre kolesterolü birleştirin ve sırasıyla bir miligram toplam lipit ve iki ila iki ila bir molar orana sahip bir çözelti elde edin.

Bir çözeltiyi girdaplama ile karıştırın, karışımı nitrojen gibi inert bir gaz kullanarak kurutun ve ardından en az bir saat vakum altında daha fazla kurutun. Daha sonra, kurutulmuş lipitleri 100 mikrolitre PBS'de mililitre başına 10 miligramlık bir konsantrasyona çözün. Yaklaşık bir dakika boyunca kuvvetlice karıştırmak için girdap.

Çok laminer veziküller içeren bulanık bir süspansiyon elde etmek için. Şişenin kenarlarına bağlı hiçbir lipit film kalmadığından emin olun. 10 mikrolitre çoklu laminer lipid süspansiyonu alın ve 150 mikrolitre desteklenen lipid çift katmanlı tampon ekleyin.

Sonra bir çözelti karıştırın ve iki mililitrelik küçük kapaklı bir cam şişeye aktarın ve para film sonikat ile kapatın. Oda sıcaklığında bir banyoda karışım 10 dakika boyunca sonikat olur. Bu süre zarfında, çözelti berraklaşmalı ve yaklaşık 50 nanometre çapında küçük uni veya veziküller verecektir.

Cam kapak fişlerini suda, ardından etanolde yıkayın ve ardından kurumaya bırakın. Ardından, Micah disklerini alın ve yapışkan bant kullanarak dış tabakayı soyun. MICA® diskini bir damla şeffaf optik olarak şeffaf yapıştırıcı kullanarak bir kapak kızağına takın.

Ardından plastik silindirleri vakumlu gres kullanarak MICA'ya takın ve sızıntı olmadığından emin olun. Tüm lipozom çözeltisini doğrudan mika'nın üzerine sıkın ve 300 mikrolitrelik bir hacme ulaşmak için 140 mikrolitre daha desteklenen lipid çift katmanlı tampon ekleyin. Daha sonra, üç milimolar kalsiyumun nihai konsantrasyonuna ulaşmak için 0.9 mikrolitre bir molar kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin, numuneleri 37 santigrat derecede iki dakika inkübe edin ve daha sonra bu adım sırasında 65 santigrat derecede en az 10 dakika inkübe edin, ayrıca desteklenen lipid çift katmanlı tamponu 65 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.

Numunenin kurumamasını sağlamak için gerekirse tampon ekleyin. Numune haznesinin bir kapak fişi ile kaplanması da numunenin nemli kalmasını sağlayacaktır. Daha sonra numuneyi, kalsiyumu ve kaynaşmamış vezikülleri çıkarmak için önceden ısıtılmış desteklenen lipit ile katman tamponu ile 10 ila 15 kez nazikçe durulayın.

Yıkama adımlarını takiben çift katmanın kurumasını önlemek için yıkama adımları sırasında ekstra özen gösterin. Desteklenen çift katmanları oda sıcaklığına soğutun. Atomik kuvvet mikroskobu üzerindeki ölçümlerden önce, bir çözelti içindeki lipid çift katmanlarının görüntülemesini gerçekleştirmek için atomik kuvvet mikroskobunu veya bir FM'yi ayarlayın.

Temas modunu üreticinin spesifikasyonlarına uygun olarak kullanarak, tüm deney boyunca tampona daldırılmış halde tutmak için numuneye tampon ekleyin. Numuneyi A FM tablasına monte edin ve tüm titreşim izolasyon modüllerinin açık olduğundan emin olun. Sistemin dengelenmesi ve termal kaymayı azaltması için en az 15 dakika bekleyin.

Ardından, temas sağlanana kadar yumuşak bir FM konsol ucu ile temas modunda s'ye yaklaşın. Çift katmanlar çok kırılgan olduğundan, numuneyle teması sürdürürken kuvveti minimumda tutmak ve termal kaymayı düzeltmek için temas modu görüntüleme sırasında A FM ucunun ayar noktasını en aza indirin. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, her bir tarama çizgisini polinom seviyelendirme işlevlerine uydurarak görüntüleri işleyin.

Membran ile temasını kaybeden taramalar için hat kaldırma işlemi gerçekleştirin. A FM üretim şirketinin tescilli yazılımını kullanarak, elektrik sinyalinin bir kuvvet ölçümüne doğru şekilde dönüştürüldüğünü belirlemek için üreticinin protokolünü izleyerek konsolu kalibre edin. Çift katmanın bir alanını görüntüledikten sonra, kuvvet spektroskopisi yapmak için çift katmanda beş mikrona beş mikronluk bir bölge seçin.

O bölgenin 16'ya 16'lık bir ızgarasında kuvvet eğrileri aldığı AFM'leri ayarlayın, bu da bölge başına 256 kuvvet eğrisi ile sonuçlanır. Ardından Z piso yer değiştirmesini 400 nanometreye ayarlayın. Bu, z piezo'nun maksimum hareket aralığını belirler ve ölçümler arasında konsolun numuneden tamamen geri çekilmesini sağlar.

Ardından, yaklaşma hızını saniyede 800 nanometreye ve geri çekme hızını saniyede 200 nanometreye ayarlayın. Ayrıca bu durumda her kuvvet eğrisi için maksimum hedef kuvveti 12 nano Newton olarak ayarlayın. Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, A FM yazılımının çalıştır düğmesine basarak kuvvet eğrilerini elde edin.

İyi istatistikler elde etmek için her koşul için en az 500 kuvvet eğrisi elde edin, değerlerin histogramını çizin ve ardından dağılımın tepe noktasını ve genişliğini elde etmek için histogramları bir Gauss dağılımına sığdırın. Bu çalışmayı kullanan lipit bileşimi nedeniyle, iki ana zar bölgesi oluşur. Fing, miyelin ve kolesterolden oluşan sıvı sıralı bir bölge ve esas olarak DOPC'den oluşan sıvı düzensiz bir bölge vardır.

A FM görüntülemeden elde edilen yükseklik profili, yükseklik profiline bakarak membran yapısı hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. İki tabaka kalınlığı, zardaki kusurların varlığı kullanılarak ölçülebilir. Yükseklik haritası, sıralı ve düzensiz fazlar arasındaki yükseklik farkını ölçmek için de kullanılabilir.

Kuvvet spektroskopisi modundan türetilen kuvvet eğrileri, burada gösterildiği gibi kuvvet eğrisinin zirvesindeki kuvvet değerini inceleyerek atılım kuvvetini ölçmek için kullanılır. Ek olarak, zar kalınlığı, kuvvet eğrisinin tepe noktasından mesafe değerine uzaklık değerinin çıkarılmasıyla elde edilebilir. Kuvvet eğrisi tekrar yükselmeye başladığında, bu prosedürü denerken, B katmanlama solüsyonunu tutmayı ve uç üzerindeki termal kayma ve D birikiminin etkilerini düzeltmek için FM montajını sürekli olarak izlemeyi unutmamak önemlidir.

Membran dinamiği gibi ek soruları yanıtlamak için konfokal floresan mikroskobu gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, katmanlarla desteklenen hazırlamayı ve bu çift katmanların fiziksel özelliklerini görüntülemek ve araştırmak için bir FM kullanmayı iyi anlamalısınız.