Tetanik Uyarım tarafından Yerel CA1 γ Titreşim Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, bir nöronal uyarılabilirlik modeli olarak hücre dışı gama salınımlarını kaydetmek için beyin dilimleri hazırlamaktır. Bu, önce beynin kafatasından çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, beyni bir BOS buzunda hızla soğutmak ve 450 mikronluk dilimler halinde kesmektir.

Daha sonra, kayıt odasına bir dilim aktarın ve uyarıcı elektrodu tabakaya ve bir kayıt elektrodunu ca bir stratum parama doole'ye yerleştirin. Son adım, gama salınımlarını ortaya çıkarmak ve ilaçların nöronal uyarılabilirlik üzerindeki etkisini değerlendirmektir. Sonuç olarak, hipokampal gama salınımlarının karakterizasyonu, ilaçların ağ fonksiyonu üzerindeki etkilerini göstermek veya nörogenetik hastalıkta hastalık oluşum mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

Bu yöntem, epilepsi, otizm ve Alzheimer gibi nöronal ağ uyarılabilirliğinde artışların meydana geldiği hastalık mekanizmaları hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilir ve ayrıca ilaçların etki yöntemini araştırmak için de kullanılabilir. Bu işleme başlamak için, 250 mililitrelik bir behere yükseltilmiş bir naylon ağ yerleştirerek bir tutma odasını onarın. Daha sonra, ağı yaklaşık iki santimetre kaplamak için beheri bir BOS ile doldurun ve oda sıcaklığında karbojen ile köpürtün.

Baloncukların dilim tutma alanını doğrudan bozmadığından emin olun. Daha sonra büyük bir makas, küçük bir makas, küçük ve büyük bir mikro spatula ve küçük ve büyük bir forseps çifti dahil olmak üzere diseksiyon aletlerini buz üzerine yerleştirin. Soğutulmuş Vibram doku kesme bloğunu buz üzerinde bir alüminyum folyo üzerine yerleştirin.

Bu onarımdan sonra, iki parça altı santimetre filtre kağıdı, tek kenarlı bir tıraş bıçağı ve bir kesme solüsyonu bulamacı ile doldurulmuş 25 mililitrelik bir beher. Ardından, beyin diseksiyonu için ikinci bir kabı buzla doldurun. Buzun üzerine bir parça kağıt mendil koyun ve üstüne 12 santimetrelik bir kültür kabı yerleştirin.

Daha sonra, kültür kabını kesme çözeltisi, buz, bulamaç ile doldurun ve karbojen ile köpürtün. Bu prosedürde, küçük bir makas kullanarak başın cildini ve bağ dokusunu buruna doğru iyileştirin, alttaki kafatasını ortaya çıkarmak için bağ dokusunu kesin. Daha sonra kafatasının ve boynun dorsal yönünü kaplayan kasları çıkarın.

Beyni çıkarmak için kafatasının ön tarafını bir çift büyük forseps ile sabitleyin. Ardından, rem ve magnumun her iki tarafındaki kemikten iki yanal kesim yapın. Bundan sonra, bgma'nın hemen önündeki gözler arasında başka bir kesi yapın.

Sagital sütür boyunca dikkatlice kesin ve beyni ortaya çıkarmak için kesilen kafatası bölümlerini yansıtın. Ardından, beyni çıkarmak için küçük spatulayı kullanın ve kraniyal sinirleri kesmeye dikkat edin. Beyni kültürlü bir tabağa yerleştirin.

Daha sonra beyni, kesme çözeltisi bulamacı ile doldurulmuş 25 mililitrelik bir behere aktarın. Beyin yarımküresini dilimlemeye hazırlamak için, kültürlü bir kabın dibine altı santimetrelik bir filtre kağıdı parçası yerleştirin. Sonra taze kesme çözeltisi bulamacı ile doldurun ve araba ile kabarcıklayın.

Daha sonra, beynin ventral tarafı aşağı bakacak şekilde filtre kağıdına yerleştirin. Ardından, beyinciği yeni ve temizlenmiş tek kenarlı bir tıraş bıçağıyla çıkarın. İki yarım küreyi ayırmak için orta hat boyunca bir kesim yapın.

Vibram doku bloğunu hazırlamak için, soğutulmuş Vibram doku kesme platformunun yüzeyini kurulayın. Ortasına bir damla Sano ACRL yapıştırıcısı koyun ve beynin yaklaşık boyutuna eşit şekilde yayın. Bir yarım küreyi büyük bir mikro spatulaya aktarmak için küçük bir spatula kullanın ve beynin medial tarafı aşağı bakacak şekilde konumlandırın.

Beynin çözeltisini mümkün olduğunca bir parça filtre kağıdı ile emdirin. Daha sonra beyni daha büyük spatuladan kaydırın ve daha küçük spatulayı tutkalın üzerine yönlendirmek için kullanın. Bundan sonra, kesme platformunu Vibram haznesine sabitleyin.

Beyni tamamen kaplamak ve çözeltiyi karbojen ile köpürtmek için hazneyi kesme çözeltisi bulamacı ile inşa edin. Ardından kesme platformunu, beynin ventral tarafı bıçağa bakacak şekilde döndürün. Beyni 450 mikrometre kalınlığında bölümlere ayırın, elektrofizyolojik kayıtlar için tüm beyin sagital dilimleri üretmek için beynin ventral yüzeyinden dorsal yüzeye kadar kesin.

Dilimin tabanı kalkarsa, dilimi hafifçe aşağı bastırmak için bükülmüş 27 gauge bir iğne kullanın. Ardından dilimi tutma odasına aktarmak için pipeti kullanın. Tipik olarak, dilimi kayıt odasına monte etmek için her yarım küreden üç ila dört su aygırı Campbell dilimi kesilebilir.

Dakikada bir ila iki mililitre akan ve 32 santigrat dereceye kadar ısıtılan bir BOS ile perfüze edilmiş batık bir kayıt odasına bir beyin dilimi yerleştirin. Kayıtlar için A BOS kullanımı, magnezyum konsantrasyonu iki milimolardan dört milimolara yükseltildiği için tutma odasındakinden farklıdır. Dilimi, telleri hipokampal ca'ya paralel olacak şekilde üzerine yarım daire biçimli paslanmaz çelik bir ağırlık koyarak sabitleyin.

Bundan sonra, perfüzyon hızını 32 santigrat derecede dakikada sekiz ila 10 mililitreye yükseltin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, uyarıcı elektrodu tabaka yönlerinin ortasına hareket ettirin. Ardından kayıt elektrodunu, uyarıcı elektroda mümkün olduğunca yakın parametre katmanına hareket ettirin.

Daha sonra, hem uyarıcı hem de kayıt elektrotlarını dilimin içine 50 ila 100 mikrometre indirin. Gama salınımları oluşturmak için 120 ila 150 mikro test darbesine yanıt olarak bir milivoltluk alan EPSP'sini oluşturmak için, dokuyu 200 hertz'de verilen 20 kat 0.1 milisaniyelik darbelerden oluşan bir trenle uyarın. Bu Titanik uyaran, her beş dakikada bir verildiğinde tekrarlanabilir tepkiler verebilir.

Bu şematik, uyarıcı elektrotun tabaka yönlerindeki yerlerini ve kayıt elektrodunun ca olanın stratum parasındaki yerlerini gösterir. Ve işte Titanik stimülasyonun neden olduğu gama salınımlarına bir örnek. Bu şekil, 20 mikromolar peridyum, klorür ve T tipi kalsiyum kanalları ile Coline IH akımı ile 20 mikromolar CN QX gabaa reseptörü ile 20 mikromolar ile AMPA reseptörlerinin farmakolojik blokajını göstermektedir.

100 mikromolar nikel ile, her bir ajan üretilen sivri uç sayısını bağımsız olarak azaltabildi. Bu hazırlık, ilaçların ağ ölçeğindeki etkisini belirlemek için idealdir. Tine, potasyum kanallarını açan ve membran uyarılabilirlik banyosunu azaltan klinik olarak kullanılan bir anti-epileptik ilaçtır.

Çatal uygulaması, salınım süresindeki sivri uçların sayısında doza bağlı bir azalma sağlamıştır. Bir kez ustalaştıktan sonra, beyin dilimlerinin hazırlanması ve elektrofizyolojik kayıtlar için diseksiyon bu işlemi takiben yaklaşık 10 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Tüm hücre yaması klemp kayıtları gibi diğer yöntemlerin eklenmesi, bir ağ içindeki bireysel nöronların hastalıklardaki rolünü anlamak ve ilaçların uygulanmasını takip etmek için eklenebilir.