Name: Uygulanması İn Vitro İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Keşfedin, hedefli tedavilere direnç mekanizmalarını hızla belirlemek için in vitro ilaç direnci hattı türetme ve dizileme protokolünü. Bu yöntem, klinik yönetim stratejilerini geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, H3 Biomedicine'deki meslektaşlarımıza makale hazırlığı sırasındaki geri bildirimleri için teşekkür eder.

1. İlgi Bileşik (ler) için GI 50 değerlendirilmesi <ol><li> Uygun ekim yoğunluğu değerlendirmek için ilgi hücre hatları için büyüme eğrisi (ler) oluşturun. Tohumlamadan sonra, çeşitli zaman noktalarında hücre sayısını çizilir (gün 2, 4, 6 ve 8) 0. günde göre Bunlar arasında hücre çizgisinin bir göreceli büyüme oranı sağlayacak ve bu tür başlangıç ​​tohum yoğunluğunu değerlendirmek için kullanılmalıdır izdiham 7 gün içinde 96 oyuklu plakalar içinde ulaşılabilir değildir. </li><li> Büyüme eğrileri tespit edildiği zaman, hücre ortamının 100 ul saydam olmayan, şeffaf dipli, 96 gözlü levhalar hücre çekirdeği uygun sayıda GI 50 değerlendirmek. Kullanılan ve 1.1 belirlenen hücre hattına göre hücre sayısını Tohum. Tipik olarak, 24 saat ~ ikiye katlanması zaman, örneğin., HCT116 ile hızla büyüyen hücre hatları için tohum 3x10 3 hücreleri. <ol><li> Bir deney plakası (gün 1) hazırlayın. Deney plakası için, kültür ortamı i 100 ul istenen yoğunluğa, tohum hücrelerin mavi gölgeli kuyular (Şekil 1). Wells beyaz vurgulanan sadece medyayı içerir. </li><li> Bir kontrol plakası (gün-1) hazırlayın. Kontrol plakası için, ayrı bir 96-çukurlu plaka içinde kültür ortamı 100 ul içinde aşama 1.2.1 gibi hücrelerin aynı yoğunluğa tohum. Bileşiklerin sitostatik / sitotoksik doğasını yorumlamada yardımcı olacak bu &#39;Gün 0&#39; okuma (Şekil 2) analiz edilir. </li></ol></li><li> Ertesi gün (gün 0), kumanda paneli okuyun. Oda sıcaklığına Lüminesan Hücre Canlılığı reaktifi (üreticinin talimatlarına göre tampon maddesi ile karıştırıldı, CellTiter-Glo substrat) dengeye ve homojen bir çözelti elde etmek için içeriği ters çevirerek yavaşça karıştırın. Hücre / medya karışımı 100 ul reaktifin 80 ul eklenir ve hücre lizizine neden 30 dakika boyunca içeriği çalkalayın. <ol><li> 560 nm 0.1-1.0 sn ve tespit dalga boyunun bir pozlama ayarlanmış bir lüminometre ile rekor ışıma. </li></ol></li><li> (Bileşikleri Test bileşiklerini eklemeÇevrede) plakaları (gün 0) test etmek için,. 10 konsantrasyonlarının toplam 200x son konsantrasyonda DMSO içinde bileşik 4 seri seyreltme (bileşik ve yalnızca bir DMSO, levha bileşik ihtiva eden 9 dilüsyonları) bir 1: sağlayın. Bir başlangıç ​​noktası olarak, 0.03 uM&#39;lik bir 200x düşük doz ve 2.000 uM bir üst dozda (nihai hacim 200 ul) hedefler. </li><li> 10x son konsantrasyonda (son hacim 100 ul, ara levha), bir bileşik, orta karışımı yapmak için ortama seri olarak seyreltilmiş bileşikler ekleyin. Deney gününde 3 kullanım için -20 ° C &#39;de bir bileşik plaka saklayın. En yüksek doz 10 uM (ör., Satırlar B, C ve D, gün 0) (Şekil 1) öyle ki üç kez hücrelere bileşiği, orta karışımı 10 ul ekle. 37 ° C &#39;de 3 gün boyunca deney inkübe edin. Kullandıktan sonra ara levha (lar) atın. </li><li> 3 gün, 1.4 hazırlanan bileşik plakaları kullanılarak 400 ul 1x bileşik orta karışımı hazırlayın. Medya kaldırmak ve otomatik kuru pat tahlil plakaları haricindekilericlaved kağıt havlular 2-3x kalan ortamı çıkarmak için. Mavi gölgeli kuyulara bileşik / medya (/ kuyu 100 ul) ekleyin ve kuyular buharlaşma (Şekil 1) önlemek için çevre medya 100 ul ekleyin. İlave bir 3 gün için 37 ° C &#39;de deney plakaları yeniden inkübe edin. </li><li> 6. günde, adım 1.3 de tarif edildiği gibi, bir lüminesans okuma gerçekleştirerek yaşayan hücrelerin nispi sayısını değerlendirmek. </li><li> Bileşiklerin statik / toksik doğa değerlendirmek için gün 0 okuma kullanın. Sitostatik ajanlar hücre siklusu durmasına neden ise Toksik maddeler apoptosis. Bileşik zehirli ise, GI 50 ve Gi direnci deneyleri için 50 x 5 konsantrasyonlarını seçme düşünün (gün 6 okuma günü 0 okuma altındadır). Bileşik durağanlığı (d0 okuma eşit veya daha yüksek) uyaran Ancak, GI 100 ve direnç deneyleri için GI 100 x5 (Şekil 2) düşünün. </li></ol> 2. İlaç Direnci Tahliller kurma <ol><li> Çalışma zekâ Eğerha sitostatik madde, direnç analizi için 150 mm2 doku kültür tabaklarında (hacim = 30 ml) içinde bir% 30-40 arasında bir kesişme noktasında tohumu hücreleri. Toksik madde ile çalışıyorsanız, bir% 70-80 izdiham tohum. </li><li> Sağlam bir yanlış eşleşme onarım (KKK) mekanizması liman hücre çizgileri için, aşama hücrelerin inkübe kanserojen N-etil-N-nitroso üre ile 37 ° C (TRK) 2,1 O / N. Genomik instabilite artırmak için 50 mg / ml TRK (nihai konsantrasyon 50 ug / ml) içindeki bir stok çözeltisi 30 ul hücreleri tedavi edin. Kusurlu bir MMR (Tablo 2 ve 3), TRK veya diğer kanserojen tedavi gerekmeyebilir sahip hücre çizgileri için. <ol><li> Diğer hücre hatları için, mikrosatellit instabilite 12 kullanılarak NCI kriterlerine göre MMR-eksikliği tespit veya mikrosatellit instabilite deneyleri veya MMR genlerinin 13-15 Epigenomik / genomik profilleme kullanılarak yayınlanan karakterizasyonu dayalı. </li></ol></li><li> Test bileşiği (ler) ile muamele hücrelerikonsantrasyonda faiz adımında 1.8 belirlenen. Tipik bir üç günlük canlılığı deneyi 10 hücre ölümüne neden yüksek derecede toksik bileşikler için, (örneğin, GI 50), düşük doz tedavi ile başlar ve aşamalı olarak dayanıklı kadar konsantrasyon, bileşiğin (Gİ 50 katlarını) her 2-3 hafta geliştirmek direnci gözlenmiştir. Ortamı doldurun ve her 3 d bileşik. </li><li> Seçim başladıktan sonra dirençli klonlar ortaya kadar, değişim medya / bileşik 3-4 günde karıştırın. Tedavi edilen hücreler DMSO ile muamele edilmiş kontrol hücreleri akut tedavisi göre ilaç tedavisinde daha büyük bir büyüme / uygunluğu göstermek zaman tanım göre direnç ortaya çıkmaktadır. </li></ol> 3. tek hücre klonlarının izole edilmesi <ol><li> Hücrelerin canlı kümeleri için faz-kontrast mikroskobu (büyütme 40x) kullanılarak kültür çanak inceleyin. </li><li> Bir işaretleme kalemi ile çanak alt Mark tatmin edici klonlar. Ortalama boyutu vardır klonlar (büyük koloniler seçin mayBirden hücrelerinden köken) ve diğer kolonilerden izole. Adım 3.3 özetlenen iki yaklaşımdan birini kullanarak klonları seçin. </li><li> Yaklaşım 1: pipet kullanarak (Şekil 3) <ol><li> Büyüme ortamı çıkarın ve herhangi bir kayan hücreleri çıkarmak için 1x PBS ile durulayın. </li><li> Pipet ucu ile &#39;toplama&#39; klonlar için rehber olarak siyah işaretleri kullanın (pipet bağlı, P200 tercihen). </li><li> 200 ul taze ortam ile 48 oyuklu plakalar içine aktarın klon (yarım bileşik konsantrasyonu hücrelerin uygun kurtarma izin vermek için). </li><li> Hücreler 200 ul taze medya / İdeal bileşik konsantrasyonu eklemeden önce 2-3 gün kurtarmak için izin verin. </li><li> Her 3-4 günde medya / bileşik değiştirebilir ve klonlar genişletmeye devam devam. </li></ol></li><li> Yaklaşım 2: Klonlama Diskleri Kullanma (Şekil 3) <ol><li> Aşama 3.2 &#39;de tarif edildiği gibi klonlar işaretleyin. </li><li> 5 ml% 0.25 t ihtiva eden bir 10 cm doku kültürü çanağı içinde 3 mm klonlama diskler yerleştirin2 dakika boyunca rypsin-EDTA. </li><li> Çanak medya aspire dayanıklı klonlar içeren ve steril tek kullanımlık forseps kullanarak tripsin batırılmış klonlama diskler ile klonlar bindirme. </li><li> Klonlar 37 ° C inkübatör, plakalar asansör ne kadar kolay bağlı olarak, 1-2 dakika boyunca bekletin. </li><li> Steril forseps kullanılarak klonlama diskler almak ve 200 ul taze ortam ve bileşik yarı konsantrasyonu ile 48 oyuklu plakalar içerisine aktarılır. </li><li> Pipet yukarı ve aşağı yavaşça klonlama diskler hücreleri çıkarmak ve 37 ° C (kuyularda diskleri klonlama bırakın) O / N inkübe. </li><li> Ertesi sabah, 48 oyuklu plakalar ile klonlama diskleri çıkarın ve 200 ul taze bir ortam / bileşik (yarım doğru bileşik konsantrasyonu) ile kuyu doldurun. </li><li> Üç gün sonra, bileşik ideal konsantrasyonu ile medya doldurmak. </li><li> Medya / bileşik 3-4 günde değiştirmek ve klonlar genişletmeye devam devam. </li></ol></li></ol> 4. Ar Derecesini Belirlemeİzole Klonların esistance <ol><li> 10-20 koloni genişletilmiş sonra direnç derecesini değerlendirmek için 1. adımda açıklandığı gibi, GI 50 eğrileri oluşturmak. </li><li> Her seçim sürecinde DMSO ile tedavi edilen kontrol popülasyonları içerir. Bu direncin spektrumu geniş olacak çok muhtemeldir (diğerleri tam direnç gösteren oysa bazı kısmi gösteriliyor). İki grup arasında değişebilir direnç mekanizması olarak bu sınıfların her biri bir kaç klon toplayın. </li></ol> 5. nesil Sıralama <ol><li> 15 ml 2 milyon hücre (kontrol ve dirençli klonlar) (5 dakika boyunca 500 xg) aşağı Spin gDNA ve RNA koleksiyonu hem konik şişeler (dolayısıyla 2 x 2 milyon dolar). </li><li> 1x PBS ile iki kez yıkanır ve izolasyon için hazır olana kadar -80 ° C&#39;de pelet dondurma. </li><li> Üreticinin protokolüne göre RNA veya gDNA izole etmek için ticari bir özütleme kiti kullanarak. </li><li> Yeni nesil dizileme için örnekler gönderinsatıcının protokolünü kullanarak 10. </li></ol> 6. Biyoinformatik örneklerin analizi (tam exome sıralama) <ol><li> Preprocess en iyi uygulama DNA seq boru hattı 16 göre verileri sıralamak. <ol><li> Tüm İKD 17 kullanılarak insan genom GRCh37 başvurmak için okur Harita. Samtools 18 ile sıkıştırılmış BAM formatında sıkıştırılmamış SAM biçimlendirilmiş hizalamalarını dönüştürün. Sıralama hizalamaların tarafından Samtools ile koordine. Picard kullanarak okuma grupları ekleyin. (Belirli İKD, Samtools ve Picard komutları için, çizgiler, 1-4 Yardımcı Metin 1) </li><li> Tümünü işaretle çiftleri Picard aracı 19 set gelen MarkDuplicates komutunu kullanarak okur. Index Samtools ile bu dosyayı. (Ek Metin 1, satır 5-6) </li><li> Tüm okur karşısında uyumsuz üsleri en aza indirmek için, yeniden hizalayın bir Indel realigner 20 kullanan küçük eklemeleri veya silmeleri barındıran bölgelerde lokal olarak okur. (Ek Metin 1, satır 7-8) </li><li> Ayrıca Accurac artırmak içinvaryant arama, bir baz kalite puanı kalibrasyon aracını kullanarak ampirik yeniden kalibre baz kalite puanları y. Baz kaliteli kalibrasyon aracı doğru ilk kalite puanı, aynı zamanda okunan bir grup, makine çevrimi, baz pozisyonu ve dinükleotid bağlamında (+ önceki akım bazlar) dahil olmak üzere birçok özellikleri, hesap Kovaryas içine almalıdır sadece. Picard PrintReads ile tekrar kalibre BAM oluşturun. (Bu adım için belirli komutlar için, çizgiler, 9-10 Yardımcı Metin 1) </li><li> Adımları tekrarlayın 6.1.1 sıralı her numune için (Ek Metin 1, satır 1-10) 6.1.4 ile. </li></ol></li><li> Eşleştirilmiş varyantı, 21-23 tool19 çağıran kullanarak her klon tek nükleotid değişimi (SNV) tanımlayın. Her klon sıralı için koşmak eşleştirilmiş varyant eşleşti &quot;normal&quot; olarak ebeveyn klon kullanarak çağırıyor. (Ek Metin 1, satır 11) </li><li> Tekrarlayan, yüksek kaliteli varyantlarını Filtre ve bir varyant açıklama aracı 24 ile açıklama için hazırlar. Va DeprioritizeTüm dirençli klonlar için yaygın riants. (Ek Metin 2 R komut bakınız) </li><li> Bir açıklama aracı 25, 26 ile varyantları açıklama. Birçok varyant açıklama araçları veri yükledi ve bir uzak sunucu tarafından işlenecek izin beraberindeki bir web uygulaması var. </li><li> Yüksek fonksiyonel etkiye sahip tahmin edilen türevleri öncelik fonksiyonel etki tahmin aracını 27-29 kullanın. Varyant açıklama gibi çeşitli araçlar bir web arayüzü aracılığıyla fonksiyonel etki tahmini için kullanılabilir. </li></ol>

<ol><li>Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blueprint+for+advancing+genetics-based+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A blueprint for advancing genetics-based cancer therapy.</a> Cell. 147 (1), 26-31 (2011).</li>
<li>Housman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+in+cancer%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Drug resistance in cancer: an overview.</a> Cancers (Basel). 6 (3), 1769-1792 (2014).</li>
<li>Balbas, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+mutation-based+resistance+to+antiandrogens+with+rational+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design.</a> Elife. 2, e00499(2013).</li>
<li>Joseph, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinically+relevant+androgen+receptor+mutation+confers+resistance+to+second-generation+antiandrogens+enzalutamide+and+ARN-509%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509.</a> Cancer Discov. 3 (9), 1020-1029 (2013).</li>
<li>Korpal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+F876L+mutation+in+androgen+receptor+confers+genetic+and+phenotypic+resistance+to+MDV3100+%28enzalutamide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">An F876L mutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance to MDV3100 (enzalutamide).</a> Cancer Discov. 3 (9), 1030-1043 (2013).</li>
<li>Lawrence, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+heterogeneity+in+cancer+and+the+search+for+new+cancer-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes.</a> Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>Whittaker, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+RNA+interference+screen+implicates+NF1+loss+in+resistance+to+RAF+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition.</a> Cancer Discov. 3 (3), 350-362 (2013).</li>
<li>Wacker, S. A., Houghtaling, B. R., Elemento, O., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transcriptome+sequencing+to+identify+mechanisms+of+drug+action+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Using transcriptome sequencing to identify mechanisms of drug action and resistance.</a> Nat Chem Biol. 8 (3), 235-237 (2012).</li>
<li>Adams, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAMPT+Is+the+Cellular+Target+of+STF-31-Like+Small-Molecule+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">NAMPT Is the Cellular Target of STF-31-Like Small-Molecule Probes.</a> ACS Chem Biol. 9 (10), 2247-2254 (2014).</li>
<li>Bhang, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+clonal+dynamics+in+response+to+cancer+therapy+using+high-complexity+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Studying clonal dynamics in response to cancer therapy using high-complexity barcoding.</a> Nat Med. 21 (5), 440-448 (2015).</li>
<li>Boland, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+National+Cancer+Institute+Workshop+on+Microsatellite+Instability+for+cancer+detection+and+familial+predisposition%3A+development+of+international+criteria+for+the+determination+of+microsatellite+instability+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 58 (22), 5248-5257 (1998).</li>
<li>Heinen, C. D., Richardson, D., White, R., Groden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsatellite+instability+in+colorectal+adenocarcinoma+cell+lines+that+have+full-length+adenomatous+polyposis+coli+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma cell lines that have full-length adenomatous polyposis coli protein.</a> Cancer Res. 55 (21), 4797-4799 (1995).</li>
<li>Yamada, N. A., Castro, A., Farber, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+extent+of+microsatellite+instability+in+human+cell+lines+with+defects+in+different+mismatch+repair+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Variation in the extent of microsatellite instability in human cell lines with defects in different mismatch repair genes.</a> Mutagenesis. 18 (3), 277-282 (2003).</li>
<li>Ahmed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+genetic+features+of+24+colon+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines.</a> Oncogenesis. 2, e71(2013).</li>
<li>GATK. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.broadinstitute.org/gatk/guide">https://www.broadinstitute.org/gatk/guide</a> (2015).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Picard. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://broadinstitute.github.io/picard">http://broadinstitute.github.io/picard</a> (2015).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20 (9), 1297-1303 (2010).</li>
<li>Cibulskis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+somatic+point+mutations+in+impure+and+heterogeneous+cancer+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).</li>
<li>Larson, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SomaticSniper%3A+identification+of+somatic+point+mutations+in+whole+genome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data.</a> Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).</li>
<li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VarScan+2%3A+somatic+mutation+and+copy+number+alteration+discovery+in+cancer+by+exome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing.</a> Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).</li>
<li>Oncotator. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.broadinstitute.org/oncotator">https://www.broadinstitute.org/oncotator</a> (2015).</li>
<li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANNOVAR%3A+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Res. 38 (16), e164(2010).</li>
<li>Cingolani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+program+for+annotating+and+predicting+the+effects+of+single+nucleotide+polymorphisms%2C+SnpEff%3A+SNPs+in+the+genome+of+Drosophila+melanogaster+strain+w1118%3B+iso-2%3B+iso-3%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3.</a> Fly. 6 (2), 80-92 (2012).</li>
<li>Reva, B., Antipin, Y., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+the+functional+impact+of+protein+mutations%3A+application+to+cancer+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Predicting the functional impact of protein mutations: application to cancer genomics.</a> Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).</li>
<li>Ng, P. C., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIFT%3A+Predicting+amino+acid+changes+that+affect+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3812-3814 (2003).</li>
<li>Adzhubei, I., Jordan, D. M., Sunyaev, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+functional+effect+of+human+missense+mutations+using+PolyPhen-2%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2.</a> Curr Protoc Hum Genet. Chapter 7, Unit 7.20(2013).</li>
<li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).</li>
<li>Abaan, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exomes+of+the+NCI-60+panel%3A+a+genomic+resource+for+cancer+biology+and+systems+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology.</a> Cancer Res. 73 (14), 4372-4382 (2013).</li>
<li>Forbes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cosmic+2005%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cosmic 2005.</a> Br J Cancer. 94 (2), 318-322 (2006).</li>
<li>Shah, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clonal+and+mutational+evolution+spectrum+of+primary+triple-negative+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers.</a> Nature. 486 (7403), 395-399 (2012).</li>
<li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+PTPRB+and+PLCG1+mutations+in+angiosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent PTPRB and PLCG1 mutations in angiosarcoma.</a> Nat Genet. 46 (4), 376-379 (2014).</li>
<li>de las Alas, M. M., Aebi, S., Fink, D., Howell, S. B., Los, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DNA+mismatch+repair%3A+effects+on+the+rate+of+mutation+to+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance.</a> J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).</li>
<li>Kotani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+miR-128b+gene+reduces+miRNA+processing+and+leads+to+glucocorticoid+resistance+of+MLL-AF4+acute+lymphocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).</li>
<li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).</li>
<li>Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stroma-mediated+resistance+to+FLT3+inhibitors+in+FLT3-ITD+AML+is+mediated+by+persistent+activation+of+extracellular+regulated+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase.</a> Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).</li>
<li>Arora, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+receptor+confers+resistance+to+antiandrogens+by+bypassing+androgen+receptor+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade.</a> Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).</li>
<li>Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li>
</ol>

Bu yazı için Yayın ücretleri H3 Biyotıp tarafından ödenir.

Hücre çizgisi (ler) in seçimi: Genetik durumuna ve genomik instabilite karakterizasyonu Kuşkusuz, başarılı klinik olarak anlamlı direnç mekanizmalarını açığa çıkarmak tek ve en önemli faktör ilk hücre çizgisi seçimidir. Iki faktör dikkate alınmalıdır. Birincisi, hastalığın tanımlanması, genetik özelliklerini barındıran, aynı soy / alt tipinin hücre çizgisi (ler) i seçmek hedefliyoruz (örn., Melanom BRAF V600E). Endikasyonlar 33,34 çeşitli hem hücre hatları ve primer 30-32 / metastaz tümörlerin kamuya açık transkriptomik ve mutasyon veri Sorgulama seçim sürecini kolaylaştırır. Klinik olarak ilgili genetik değişiklikler hücre hatlarının tespiti doğru olmasına rağmen, bazı durumlarda bu durum böyle bir tarama işleminin zorluğu ve uzunluğu gibi faktörler nedeniyle mevcut hücre çizgilerinin eksikliği ya da mümkün mümkün olmayabilir. <p class="jove_content"Söz konusu noktaya getirmedi, ikinci faktör hücre hattı seçimi sırasında daha sonra dikkate&gt; kolaylığı veya istenilen hattı kullanarak tarama direnç fizibilite olduğunu. Örneğin, bu tür proliferasyon ve içsel mutasyon oranları gibi faktörler büyük keşif hızına etkileyebilir. Bu amaçla, hücre çizgileri kendiliğinden direncinin ortaya çıkması 35 hızlandırılabilir umuduyla DNA MMR mekanizmalar hızlı büyüme kinetikleri ve noksan olan kullanılabilir. KOZMIK veri tabanına dayanarak, pek çok aday hücre çizgileri, iki &#39;sıklıkla mutasyon geçiren MMR genleri, Msh2 ya MLH1 birinde eksikliği mevcuttur (Tablo 2 ve 3). Ilgi hücre çizgileri, alkile edici ajan olarak MMR fiziksel ya da DNA reaktif kimyasal bir mutajen ile akut tedavisinde rulman kusurları mevcut olmayan, alternatif olarak, N-etil-N -nitrosourea (TRK), genomik instabilite geliştirmek için de kullanılabilir. Her ne kadar olabilir önemli ölçüde s her iki yaklaşımdirençli klonlar ulaşmak ve takip sıralama için zaman Horten, sıkı fonksiyonel test işlevsel olmayan daha büyük bir sayı olarak aday genler üzerinde yapılmalıdır, yolcu mutasyonlar ortaya çıkması muhtemeldir. SNVs işlevsel ilgili mutasyonları tanımlamak için şansını maksimize etmek emretti rütbe olabilir. Birincisi, seçme bağımsız klonlar Tekrarlayan olan bu mutasyonlar bu mutasyonlar direniş sürücüler olasılığını artıracaktır. Durumunda tekrarlayan mutasyonlar ilacın aksiyon mekanizması uygun SNVs odaklanan tespit değildir (örneğin, bir ilaç ya da ilaç hedefi hedef bilinen bir alt baş efektör) anlamlı olabilir. Sonuçta, altın standart her zaman ilaca duyarlı ebeveyn hücrelerde ektopik cDNA ifadesi ile aday SNVs bir direnç veren aktivitesinin deneysel değerlendirilmesidir. RNA sıralama vs DNA Bir kez dirençli klonlar, oluşturulan DNA ve / veya RNA edilmiştirihtiyaca bağlı olarak dizilebilir. DNA dizi analizi, exome veya tüm genom dizileme de böyle SNP, indellerin olarak germ ve somatik varyantları, tanımlanmasını sağlayacak ve sayı varyantları kopyalar. Üreten bilinen kodlama bölgelerden gelen okur üzerinde daha maliyet-dostu exome sıralama odaklanır Oysa, bütün genom dizileme gibi arttırıcı veya miRNA&#39;lar 36 olarak kodlayıcı olmayan elemanların mutasyonların belirlenmesi kolaylaştırabilecek tüm genom dizileme için veri üretecektir. Gen ekspresyonu verileri DNA dizilemesi sırasında teraziye olmadığı için, ancak, hangi mutasyon (lar) bir fonksiyonel sürücüsü olması muhtemeldir tahmin etmek zordur. Bu bağlamda, RNA dizi analizi, her ne kadar daha fazla maliyetli olarak, bu bir avantaj sunar. Mutasyon arama yalnızca İfade edilen RNA türleri üzerinde gerçekleştirilen olması ilgi mutasyonu fonksiyonel bir sürücü olması olasılığını da artırmaktadır. Izlem fonksiyonel test, aynı zamanda RNA sıralama için mutasyon daha odaklı bir anket sağlayan ek olarakAyrıca direniş gibi güçlü sürücüleri hizmet verebilir gen füzyonları dahil gen ifadesi değişikliklerini, alternatif bağlantı ve yeni kimerik RNA türlerinin, tespit edememek ekledi avantajı sunuyor. Biyoinformatik boru hattı Örnek komutları gösterim amaçlı verilmiştir, fakat daha ayrıntılı belgeler ve öğreticiler Enstitüsü 16 Geniş temin edilebilir ve NGS analizi başlamadan önce iyice okunmalıdır. Aşağıdaki komutlar tüm araçlar ve referans verileri önceden yüklenmiş olduğu bir sistemde bir UNIX kabuk ortamı için tasarlanmıştır. Bu komutlar ayrıca fastq dosyaları içeren paired-end dizisi &quot;ebeveyn&quot; ve &quot;dayanıklı&quot; satıcıdan alınan ve &quot;data&quot; dizininde konuldu adında iki örnek okur varsayıyorum. Çoğu durumda bu komutlar adapte edilmelidir veya ek komut satırı arg kullanarak belirli bir uygulama için optimizeuments (örneğin, bwa komutuna &quot;-t 8&quot; ekleyerek 8 CPU çekirdeği arasında okuyuculu çalışmasını sağlar). Bam dosya başına yalnızca bir örnek belirli araçlar için dosya formatı gereksinimlerine uymak için, olsa bile (biyolojik örnekler için hizalamalarını atamak) Okuma grupları, sık sık BAM dosyalarına eklenmesi gerekir. Grup parametreleri RGID, RGSM, RGPL, RGPU okuyun ve RGLB keyfi örnek adını açıklayan dizeleri, sıralama platformu ve kütüphane strateji olabilir. In vivo deneyler vs in vitro In vitro seleksiyon tarafından belirlenen çeşitli direnç mekanizmaları klinik olarak anlamlı olduğu doğrulanmış olmasına rağmen, mekanizmalar, klinik direnç alakalı ya da baskın mekanizmaları hizmet olmayabilir bir olasılık söz konusudur. Bunun bir nedeni, tedaviye direnç sürüş mikro çevre için önemli bir rol, deneysel protokol / ayar d yoksun olan bir bileşeni de içerebilirŞimdiye kadar iscussed. Gerçekten de, bazı çalışmalar tümör hücrelerinin stroma 37,38 ile sağlanan direnci doğal mekanizmalar ima stromal hücrelerin varlığında kültürlenir zaman tümör hücrelerini öldürme yeteneğine sahip anti-kanser maddeler etkisiz hale olduğunu göstermiştir. Böyle stroma kaynaklı kazanılmış direnç mekanizmalarını tanımlamak için, bir in vitro ko-kültür veya in vivo tümör direnci deneyleri performans düşünebilirsiniz. Eski tahlil oldukça karmaşık olduğundan, pek çok direnç sürüş stromasında potansiyel rolünü ele ilaca dirençli tümör xenografts üreten başvurdular. Bu tür çalışmalar, stroma gerçekten de ikinci bir rol oynayabileceğini ima in vitro seçime direnci nisbetle iki özdeş 5 ve eşsiz 39 mekanizmaları ortaya çıkardı. Ancak, bir böyle dirençli tümörleri üretmek için sürebilir sürenin uzunluğu ve takip genomik analiz-complexitie karmaşıklığı dikkatli olmalıdırintra-tümöral moleküler ve hücresel heterojenliği nedeniyle s. Hedef tanımlama Ilaç direnç mekanizmalarının açığa çıkarmak için ek olarak, bu NGS bazlı genomik profil yaklaşım aynı zamanda, kimyasal probların hücresel hedefleri tespit etmek uygulanabilir. Tarihsel olarak, birden fazla tarafsız yöntemler Kantitatif proteomik ile birleştiğinde afinite temizliği, maya genomik yöntemler, RNAi tarama ve bilgisayar çıkarım 40 yaklaşımlar da dahil olmak üzere biyolojik aktiviteleri, düşük molekül ağırlıklı kimyasal maddelerin hücresel etki mekanizmaları ve hedefleri tespit etmek için kullanılmıştır. Bileşiklerin fonksiyonel hücresel hedeflere içgörü sunabilir direnci sağlayan fenotipik dirençli hücre popülasyonlarının, benzersiz tekrarlayan tek nükleotid değişimleri (SNVs) veya ifade değişikliklerinin tanımlanması NGS merkezli genomik veya transkriptomik profilleme kullanarak ilaç direnç mekanizmalarının aydınlatılmasında bir uzantısı olarak. TOnun görülen direnç mekanizmalarının bir alt kümesi, küçük molekülün, doğrudan protein hedefleri kodlayan genlerdeki mutasyonlar, tekrarlayan içerebilir fikrine dayanmaktadır. Son zamanlarda, birçok rapor, özellikle 9,10 sondalar küçük molekülün hücresel hedefleri ortaya çıkmasına, büyük ölçekli kanser hücre hattı hassasiyeti profil dahil olmak üzere diğer yaklaşımlarla birleştirerek, yaklaşım programı onayladı.

Sağlam sıralama teknolojileri ve gelişmiş veri analitik araçlar ile tümör genomları detaylı moleküler karakterizasyonu belirli kanser türleri 1,2 anahtar genetik değişikliklerin keşfine yol açmıştır. Böyle HER2, BCR-ABL, EGFR ve ALK olarak bu genetik lezyonlar, amaçlayan hedefli tedavilerin geliştirilmesi, önemli ölçüde hastalar 1,2 yaşam kalitesini artırmıştır. Direnç sonuçta ortaya Ancak, bu yaklaşımın özgüllük rağmen, çoğu tek tedavilere klinik yanıt sub-optimal olmuştur. Son zamanlarda, önemli ilerlemeler hedeflenen terapötiklere direncinin moleküler temellerinin anlaşılmasında yapılmamıştır. Şaşırtıcı, bu direniş önemli bir mekanizma sürekli hedef / yolu aktivitesini içerdiğini açıkça hale gelmektedir. Noktada bir olgu olarak, androjen reseptörü (AR), prostat kanserinin tedavisi enzalutamide, AR kendisi aktive edici mutasyonlar muhafaza zenginleşmesine yol açar -directed AR-sinyal outpönleyicisi 3-5 mevcudiyetinde ut. Bu bilgi de WT ve mutant-AR fonksiyonu hem de bastırmaya devam edebilirsiniz üçüncü nesil antagonistleri geliştirilmesi) 1 saldırgan bir kampanya açmıştır enzalutamide dirençli PKa 3 ve 2) terapötik müdahale için hedeflenmiş olabilir AR sinyalizasyon potansiyel aşağı düğümleri tespit . Benzer şekilde, EGFR BRAF ve ABL hedef gibi inhibitörlerinin diğer sınıflara karşı direnç genellikle orijinal addicting kinaz yolunu 1 etkinleştirebilirsiniz mutasyonlara yol açar. Direniş kaçınılmaz hastaların çoğunda ortaya çıktığını bilgi ile, yaklaşımlar geliştirmek süratle etkin takip tedavilerin gelişimini sağlayacak ışık bu mekanizmaları getirmek. Yaygın olarak kullanılmakta olan bir yaklaşım d mükellef olabilir genetik lezyonlar zenginleşme / tüketilme tanımlamak için göreceli tedavi görmemiş veya -duyarlı tümörlerin klinik refrakter tümörlerin genomiğini analiz etmektirhalı keşif. Onun söze rağmen, hızlı keşif engel bu yaklaşımın iki önemli yükümlülükleri vardır. Öncelikle, genomik sorgulama için tümör malzemeye zamanında erişim sağlamasını tedavi terapi hareket önemli bir engel olarak hizmet edebilir. Tümörler belirgin intra-tümöral heterojenliğini 6,7 sunabilirim çünkü İkincisi, dirençli bir ortamda genetik lezyonların sayısız Dekonvolüsyonun zor olabilir. Bu zorlukların ışığında, direnç mekanizmaları preklinik keşif bağımlılığı var artmıştır. Bu yaklaşım önce direnç başlangıcından şu bu mekanizmaları ya tedaviden önce veya ayı hastalarda alternatif klinik yönetim stratejilerini yol gösterici olabilir klinik çalışmalarda 1 öne direnç mekanizmalarını tanımlanmasına izin verebilir. Yaygın olarak kullanılıyor Böyle bir klinik öncesi keşif aracı tarafsız fonksiyonel RNAi ekranları uygulamaktır. Sınavaple, Whittaker ve arkadaşları NF1 kaybı sürekli MAPK yolu aktivasyonu ile 8 RAF ve MEK inhibitörlerinin direnç aracılık ettiğini belirlemek için bir genom ölçekli RNAi ekran uyguladı. NF1 kayıp-fonksiyon mutasyonları RAF inhibisyonuna ve aktivasyonunu 8 vemurafenib dirençli melanoma tümörlerinin in dirençlidir BRAF -mutant tümör hücrelerinde gözlenmiştir Bu bulgular klinik olarak önemli olduğu bulunmuştur. Ancak, bu yaklaşımın başarısı rağmen, birçok klinik açıdan anlamlı hedefler genellikle muhtemelen nedeniyle bu yaklaşımın kaybı fonksiyon-önyargı tespit edilmemiştir. Bunun aksine, direnç mekanizmalarının klinik öncesi keşfi için daha az eğilimli bir araç NGS bazlı genomik veya transkriptomik profil ile birlikte ilgi bileşiğe uzun süre maruz kaldığında dirençli hücre hatlarının üretilmesini içerir. Bu yaklaşım başarılı kendiliğinden tespit için çeşitli gruplar tarafından uygulamaya konmuşturdirenci 5,9,10 sağlayan tekrarlayan tek nükleotid varyantları veya ifade değişiklikler. Örneğin, AR tekrarlayan F876L mutasyonu son in vitro 3-5 dirençli klonlar ve klinikte 4 öncesinde, bu mutasyonun belirlenmesi için, in vivo olarak 5 ksenograft tümörlerinin keşfedilmiştir. Çok yakın bir zamanda, Bhang ve arkadaşları çoğu, fonksiyonel olarak bağlantılı mutasyonlar düşündüren, önceden varolan bir alt populasyonun bir parçası olan uzun süreli ilaç maruziyeti sırasında ortaya çıkan dirençli klonların çoğunluğunun göstermek için iki klinik olarak anlamlı bir model ClonTracer kullanılan (2015) 11, önceden mevcut olan daha önce muhtemeldir Bu seçim sırasında 11 için seçilen hale gelir. Daha önce de tartışıldığı tümörlerin genomik profile Tersine, daha az heterojenlik Bu yaklaşımın yararları &quot;homojen&quot; dirençli klonlar, potansiyel sürücüsü daha doğru bir genetik diseksiyon kolaylaştırmak analizi için kullanılan gibidir. FurthermCevher, heyecan, direnç mekanizmalarını açığa çıkarmak için potansiyel ek olarak, bu yöntem, bu bilgilerin bilinmiyor 10 olduğu biyolojik olarak aktif küçük moleküllerin hücresel etki mekanizmaları ve hedeflerini tanımlamak için uygulanabilir. Net avantajları ve bu yaklaşımın birden kullanımları göz önüne alındığında, burada klinik olarak anlamlı keşifler potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için böyle bir preklinik ekranın başarılı bir şekilde uygulanması ayrıntılı bir protokol mevcut.

<table><tbody><tr><td>48 kuyulu plakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-86&nbsp;</td><td>Genişleyen klonlar</td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-588</td><td>GI < alt > < / alt> eğrileri oluşturma</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Canlılık testi</td></tr><tr><td>Klonlama diskleri (3 mm)</td><td>Sigma</td><td>Z374431</td><td>Klonların toplanması</td></tr><tr><td>Steril forseps</td><td>Unomedikal</td><td>DF8088S</td><td>Klonların toplanması</td></tr><tr><td>RNeasy Plus RNA ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RNA Kan</td></tr><tr><td>ve Doku İzole Etme DNeasy ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>69581</td><td>İzolasyon gDNA</td></tr><tr><td>GATK</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Indel yeniden hizalayıcı</td></tr><tr><td>MuTect</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Eşleştirilmiş varyant çağırma aracı</td></tr><tr><td>Oncotator</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Varyant açıklama aracı</td></tr><tr><td>MutationAccessor</td><td>The Broad Enstitü</td><td></td><td>İşlevsel etki tahmin aracı</td></tr></tbody></table>

uygulanması<em&gt; İn vitro</em&gt; İlaç direnci tahliller: klinik İlgili direnç mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik potansiyeli maksimize

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Hedefe yönelik tedaviler başlangıçta etkili olsa da direnç kaçınılmaz olarak ortaya çıkar. Takip bakımını kolaylaştırmak için bu direnç mekanizmalarını ortaya çıkarmak için dirençli klinik örneklerin genetik analizi gibi çeşitli yöntemler uygulanmıştır. Bu yaklaşımlar klinik olarak anlamlı keşiflere yol açmış olsa da, ilgili hasta materyaline ulaşmada veya bu örneklerden toplanan genomik verilerin dekonvolüsyonunu çözmede zorluklar, tedaviye giden yolu ciddi şekilde engellemiştir. Bu amaçla, burada birinci basamak tedavilerde ve alternatif klinik yönetim stratejilerinde iyileşmeye rehberlik edebilecek hızlı keşif için bir araç tanımlaıyoruz. Klinik öncesi in vitro veya in vivo ilaç seçimini yeni nesil dizileme ile birleştirerek, direncin fonksiyonel itici güçleri olarak hizmet edebilecek genomik yapısal varyasyonları ve/veya gen ekspresyon değişikliklerini tanımlamak mümkündür. Bu yaklaşım, değişikliklerin kendiliğinden ortaya çıkmasını kolaylaştırarak, bu mekanizmaların hastalarda gözlenme olasılığını artırır. Bu protokolde, yapışık çizgiler kullanarak direnci artıran tek nükleotid varyantlarını ortaya çıkarma potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için yönergeler sunuyoruz.

Direnişin önemli fonksiyonel sürücüleri keşfetmek için potansiyelini maksimize etmek için, genişleme, fenotipik test ve sıralama için tek bir hücre klonlar seçin. Şekil 4A&#39;da gösterildiği gibi, HCT116 hücreleri, tedaviden (kesikli siyah daireler) boyunca büyümeye devam etti dirençli klonların kendiliğinden ortaya çıkmasına yol sitotoksik Bileşik # 1 ile uzun bir süre işlemden geçirildi. Bu klonlar 1 Şekil 3&#39;te vurgulanan ve daha sonra fenotipik analiz için genişletilmiş yaklaşım # kullanarak aldı. Şekil 4B&#39;de gösterildiği gibi, tüm klonlar, bir ilişkisiz sitotoksik bileşik, Velcade duyarlılık göstermesine karşın, dirençli klonlar, 1-3 Tüm 1. bileşik önemli bir direnç gösterdi ve yakın analog bileşiği, # 2 (daha canlılığı / büyüme). Fenotipik direnç onayı takiben, gDNA izole edilmiş ve tam exome sıralama analizine tabi. Biyoinformatik araçları bu yapısal varyantları üzerinde daraltmak için uygulanan bu1) tekrarlayan ve 2), fonksiyonel etkisi (Şekil 5A) için potansiyel var. Bu iki kriterlerini karşılayan yapısal varyantları, bağımsız bir sıralama aracı ile doğrulanmıştır. Şekil 5B&#39;de, bütün exome sıralaması, Sanger sekanslama yöntemi kullanılarak teyit edildi kullanılarak belirlenmiştir heterozigot missens mutasyonu gösterildiği gibi (üst panel, WT sekansı; alt panel, mutant sekansı). Sekans doğrulandıktan sonra, başlangıçta direnci deneyi için kullanılan ebeveyn hücre hattı işlevsel mutasyon rolünü teyit etmek üzere mutant cDNA ifade gen tekniği ile yapıldı. Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi, WT cDNA&#39;nın aşırı ifadesi direnci vermek için başarısız ise, direncinin bir sürücü olarak bir yapısal versiyonunun işlevsel rolünü teyit 1. bileşik mutant cDNA önemli ölçüde tanınan fenotipik direnç ifade zorladı. Bu deney için kullanılan bütün reaktifler Tablo 1 &#39;de özetlenmiştir </s<html> trong&gt;. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> Tahlil ve kontrol plakaları 1. Düzeni Şekil. Mavi gölge, bileşik tedavi kuyuları. Beyaz gölge, sadece orta. Bileşikler seri şekilde 1 seyreltilir: 4 ve üç kez (BD ve EG) uygulanırlar. 2 bileşikleri, plaka başına uygulanabilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> 2. Temsilcisi canlılığı eğrileri Şekil. Kırmızı noktalı çizgi gün 0 yazma okuma. X-ekseni sağ ve y-ekseni bileşiğin artan dozları gösterir DMSO kontrol oyuklarına canlılığı göreceli temsil eder. GI% 100 gelişme inhibisyonu elde etmek için kullanılan 100 = dozu GI DMSO kontrolü% 50 canlılığı azaltmak için kullanılan 50 = doz. _upload / 52879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3. genişleme için dayanıklı klonların toplamak için iki yaklaşım. Yaklaşım 1- kullanım pipet pick up ve 48-kuyucuğu iyi tanımlanmış klonları aktarmak için. Yaklaşım 2- kullanımı klonlar kaldırın ve 48 oyuklu plakalara transfer klonlama diskler tripsin batırılmış. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> In vitro içerisinde 1 bileşik HCT116 klonlan için elde edilen direnç Şekil 4. teyidi. (A) Bileşik 1 dayanıklı HCT116 klonlan, sürekli üç haftalık seçmeyi takiben ortaya çıktı. Kontrol ve dirençli klonların (B) Canlılık, çeşitli bileşikler ile 72 saat muameleden sonra test edildi. Bileşik 2 Bileşik # 1 yakın bir analogudur. Velcade bir kontrol sitotoksik madde olarak kullanılmıştır. Veriler üç biyolojik çoğaltır ortalama + standart sapma olarak gösterilmiştir. Bileşik 1. dayanıklı HCT116 klonlar gen A eşsiz, tekrarlayan mutasyon Şekil 5. Kimlik (tek nükleotid varyantları, SNVs). (A) İş akışı tüm dirençli klonların mevcut SNVs belirlemek ve yüksek fonksiyonel etkiye sahip tahmin etmek MutationAssessor tarafından. Sanger dizileme ile gen A mutasyonunun (B) onay. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> Mutasyona uğramış gen A haiz direnç Şekil 6. Yeniden ifade vitro içerisinde 1. bileşik. Mühendislik HCT116 hücre hatlarının Canlılık bileşik 1. 72 saat tedaviden sonra test edildi. HCT116-WT veya mutant hücre çizgileri stabil bir şekilde, sırasıyla, WT veya gen A mutant cDNA&#39;larını ifade edilir. Veriler ortalama + standart sapma olarak gösterilmiştir oÜç biyolojik çoğaltır f. <table><tbody><tr><td> Örnek Adı </td><td> Amino asit </td><td colspan="2"> Birincil Doku </td><td> Zigosite </td></tr><tr><td> Cı-33-A </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> rahim boynu </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> Cı-33-A </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> rahim boynu </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> KML-T1 </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> cilt </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2"> yumurtalık </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> s.? </td><td colspan="2"> yumurtalık </td><td> Heterozigot </td></tr><tr> &lt;td&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> meme </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> LNCaP </td><td> s.? </td><td colspan="2"> prostat </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> LoVo </td><td> s.? </td><td colspan="2"> kalın bağırsak </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> MOLT-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> kalın bağırsak </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> Skut-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> Endometrium </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> Skut-1B </td><td> pL787fs * 11 </td><td colspan="2"> Endometrium </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr></tbody></table> Tablo 1. MSH2 -mutated Hücre Hatları. Hücre hattı (Örnek adı), amino asit substitüsyonu, menşe soyu ile zigosite gösterilir. <table><tbody><tr><td> Örnek Adı </td><td> Amino asit </td><td colspan="2"> Birincil Doku </td><td> Zigosite </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> kalın bağırsak </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> s.? </td&gt; <td colspan="2"> prostat </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> kalın bağırsak </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> yumurtalık </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> mide </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> P30-Ohk </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> PR-Mel </td><td> s.? </td><td colspan="2"> cilt </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> REH </td><td> s.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td&gt; <td> Homozigot </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> yumurtalık </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> SNU-1544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> kalın bağırsak </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> SNU-1746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> kalın bağırsak </td><td> Homozigot </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> pankreas </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pankreas </td><td> Heterozigot </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pankreas </td><td> Heterozigot </td></tr></tbody></table> Tablo 2. MLH1 -mutated Hücre Hatları. Hücre hattı (Örnek adı), amino asit substitüsyonu, menşe soyu ile zigosite gösterilir.

Klinik başlangıcından önce aşağıdaki ya da - - hedefli tedavilerin ilaç direnci yaygın ve direniş mekanizmaları tanımlamak için ihtiyaç alternatif klinik yönetim stratejileri rehberlik için kritik öneme sahiptir. Burada, bu mekanizmaların keşfini hızlandırmak için sıralama ile in vitro ilaca dirençli hatların çift türetme bir protokol mevcut.

Uygulanması<em&gt; İn Vitro</em&gt; İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli tedavi sınıflarına karşı direnci fonksiyonel olarak tetikleyebilecek, klinik olarak ilgili tek nükleotid varyantlarının hızlandırılmış preklinik keşfini kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, onkoloji alanındaki temel sorulara yanıt vermeye yardımcı olabilir; örneğin, klinik ortamda tedavilere karşı fonksiyonel dirence hangi gen mutasyonlarının katkıda bulunabileceği, bu sayede nihayetinde tedavilerin iyileştirilmesine ve ilaç dirençli hastalar için alternatif klinik yönetim stratejilerine nasıl rehberlik edilebileceği gibi. Bu tekniğin temel avantajı, spontan mutasyonların ortaya çıkmasını kolaylaştırmamız ve dirençli klonlarda tarafsız bir tarama teknolojisi uygulamamız nedeniyle, bu varyantların klinik ortamda hedefe yönelik tedavilerde nüksü tetikleme olasılığının daha yüksek olmasıdır.Prosedür, hücre hatları için GI 50 değerini belirlemek üzere laboratuvarımdan çok yetenekli bir araştırmacı tarafından uygulamalı olarak gösterilecektir. Hücreleri, burada gösterilen haritaya göre 100 µL hücre besiyerinde, şeffaf tabanlı 96 kuyucuklu plakalara ekerek bir analiz plakası hazırlayın.Mavi kuyucuklara hücreleri, beyaz kuyucuklara ise sadece besiyeri ekleyerek benzer bir şekilde bir kontrol plakası hazırlayın. Plakaları 37 °C'de gece boyu inkube ettikten sonra, lüminesans hücre canlılığı reaktifini oda sıcaklığına getirip ters çevirerek nazikçe karıştırın. Homojen bir çözelti elde etmek için, kontrol plakasının kuyucuklarına 80 µL reaktif ekleyin ve içeriği 30 dakika boyunca çalkalayın.Hücre lizini indüklemek için. Lüminesansı kaydetmek için 0,1 ila 1,0 saniye pozlama süresine ve 560 nanometre tespit dalga boyuna sahip bir lüminometre kullanın. Ardından, test bileşiklerini assay plakalarına eklemek için, 2000 mikromolar konsantrasyonla başlayarak DMSO içinde bileşiklerin toplam 10 dilüsyondan oluşan bir dizi dörtte bir seri dilüsyonunu hazırlayın.Ardından, 10 x son konsantrasyonda bir bileşik-besiyeri karışımı oluşturmak için seri dilüsyonu yapılmış bileşikleri besiyerine ekleyin. Bileşik plakasını, deneyin üçüncü gününde kullanmak üzere -20 °C'de saklayın. Sonrasında, en yüksek doz 10 µM olacak şekilde, dilüe edilmiş bileşiklerden 10 µL'yi hücrelere üç paralel (triplicate) olarak ekleyin.Plakaları 37 °C'de üç gün boyunca inkübe edin. Üçüncü günde, üç gün önce hazırlanan bileşik plakalarını kullanarak 400 µL 1X bileşik besiyeri karışımı hazırlayın. Besiyerini uzaklaştırmak için analiz plakalarını ters çevirin ve otoklav kağıt havluları üzerinde iki ila üç kez tamponlayarak kurulayın.Mavi ile gölgelenmiş kuyuya bir x bileşiği ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için çevre kuyularına 100 µL besiyeri ekleyin. Altıncı günde, videonun önceki kısımlarında gösterildiği gibi lüminesans okuması yaparak canlı hücrelerin göreceli sayısını değerlendirin. Ardından, PRISM gibi bir yazılım kullanarak GI 50 değerlerini hesaplayın; hesaplanan GI 50 değerlerini kullanarak ilaç direnç deneyleri için hücreleri hazırlayın.Sitosatitik bir ajanla çalışılıyorsa, hücreler 150 milimetrelik kare kültür kaplarına %30 ila %40 konfluansta ekilmelidir. Toksik bir ajanla çalışılıyorsa, hücreler %70 ila %80 konfluansta ekilmelidir. Metin protokolüne göre başlangıç bileşik konsantrasyonları belirlendikten sonra; altı günlük viabilite analizinde hücre ölümüne neden olan yüksek derecede toksik bileşikler için hücreler test bileşikleri ile işleme tabi tutulur.GI 50 ile başlayın ve güçlü bir direnç gözlemlenene kadar konsantrasyonu her iki ila üç haftada bir kademeli olarak artırın. Tek hücreli klonları izole etmek için, kültür kabını incelemek ve kabın tabanındaki canlı hücre kümelerini belirlemek amacıyla 40 x büyütmede faz kontrast mikroskopisi kullanın. P 200 pipetleyici kullanarak klonları seçmek için, ortalama boyutta olan ve diğer kolonilerden iyi izole edilmiş klonları bir kalemle işaretleyin.Büyüme besiyerini kapta kaldırın ve yüzen hücreleri durulamak için bir kez XPBS kullanın. Pipet ucuyla klonları kaldırın ve her bir kuyucuğunda 50 µL %0,25 Trypsin bulunan 48 kuyucuklu bir plakaya aktarıp 37 °C'de bir ila iki dakika inkübe edin. Ardından, hücrelerin optimal şekilde toparlanmasını sağlamak için, bileşiğin yarı konsantrasyonunda olduğu 200 µL taze besiyeri ekleyin.Üç milimetrelik klonlama disklerini kullanarak klonları izole etmek için, diskleri 5 mL %0,25 tripsin EDTA içeren 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına iki dakika boyunca yerleştirin. Ardından, dirençli klonları içeren kaptaki medyumu aspire edin ve klonların üzerine tripsinle ıslatılmış klonlama disklerini yerleştirin. Klonların plakalardan ne kadar kolay ayrıldığına bağlı olarak 37 °C'de bir ila iki dakika inkübe edin.Ardından steril pensler kullanarak klonlama disklerini alın ve 200 µL taze besiyeri içeren 48 kuyucuklu plakalara aktarın; hücrelerin klonlama disklerinden ayrılması için bileşik konsantrasyonunu nazikçe pipetle yukarı-aşağı çekin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün klonlama disklerini çıkarın, hücreleri inkübe edin ve ardından ilaç direncini değerlendirin. Burada gösterildiği gibi, metin protokolüne göre, uzun süre sitotoksik bileşik 1 ile işlem gören HCT 116 hücrelerinde, tedavi sırasında büyümeye devam eden dirençli klonların spontan olarak ortaya çıktığı görülmüştür.Klonlar bir pipet yardımıyla seçildi. Bu şekilde, birden üçe kadar olan dirençli klonların tamamı, 1 numaralı bileşiğe ve onun yakın analoğu olan 2 numaralı bileşiğe karşı belirgin direnç gösterirken; tüm klonlar, ilişkisiz bir sitotoksik bileşik olan Velcade'ye karşı duyarlılık gösterdi. Fenotipik direncin doğrulanmasının ardından, gDNA izole edildi ve tüm ekzom dizileme analizine gönderildi.Tekrarlayan ve fonksiyonel etki potansiyeli olan yapısal varyantlar, Sanger dizileme gibi bağımsız bir dizileme aracıyla doğrulanmıştır. Burada gösterilen bir örnek heterozigot bir missense mutasyon taşımaktaydı ve ebeveyn hücre hattı daha sonra mutasyona uğramış CDNA'yı eksprese edecek şekilde modifiye edilmiştir. Vahşi tip CDNA'nın aşırı ekspresyonu ise ilaç direncini sağlamada yetersiz kalmıştır.Mutant CD NA, bileşik bir numaraya karşı belirgin bir fenotipik direnç sağlamış ve böylece yapısal varyasyonun direnci tetikleyen fonksiyonel rolü doğrulanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kanser hücrelerinde ilaç direnci geliştikten sonra bu dirençten sorumlu genleri taramak amacıyla spontan dirençli büyümenin nasıl geliştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, onkoloji alanındaki araştırmacıların hem kanser hücre hatlarında hem de hayvan modellerinde ilaç direnci mekanizmalarını tarafsız bir şekilde keşfetmelerine olanak tanır.

implementation-vitro-drug-resistance-assays-maximizing-potential-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Antiretroviral tedavisi (ART) başarısız HIV-1 enfekte bireyler için ilaç direnci test gelecekteki tedaviler rehberlik ve tedavi sonuçlarını artırabilir. HIV yaygınlığının yüksek ama kaynak sınırlı ayarları optimize bireysel ve nüfus sağlık çıktıları sonuçta uygun fiyatlı ve erişilebilir ilaç direnci genotiplendirmesi ve yorumlama yöntemlerini gerektirir.

Kaynak Sınırlı Ayarlar için uygun bir HIV-1 İlaç Direnci İzleme Yöntemi

Kinaz inhibitörü tedavisi karşı genetik direnç ortaya çıkması etkili kanser tedavisi için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Yeni geliştirilen ilacın karşı tanımlanması ve dirençli mutasyonların karakterizasyonu daha iyi klinik yönetim ve yeni nesil ilaç tasarımında yardımcı olur. Burada, in vitro tarama ve dirençli mutasyonların doğrulama için bizim protokol açıklar.

Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem

Burada, tümör hücresi metabolizmasının gerçek zamanlı izlenmesi, in vivo tavuk embriyosu koryo-allantoik membran (CAM) metastaz modeli ile birleştirildiğinde, tümör hücrelerini DNA'ya zarar veren kemoterapötiklere duyarlı hale getirme yetenekleri açısından yeni anti-kanser hedeflerini/ajanlarını değerlendirmek için kullanılır.

Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Primer multipl miyelom hücreleri için yüksek verimli bir ilaç duyarlılık testi tanımlıyoruz. Çok kuyulu plakalarda kemik iliği mikro çevresinin (hücre dışı matriks ve stroma dahil) yeniden yapılandırılmasından ve hücre canlılığının uzunlamasına ölçülmesi için invaziv olmayan bir yöntemden oluşur.

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

Burada katı tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran amaçlayan bir protokol açıklar. Bu hedefe, biz RNA seq ile ebeveyn ve in vitro dirençli modellerin transkriptomik profillerini analiz ve aday genler doğrulamak için bir QRT-PCR tabanlı bir yöntem kurdu.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

EGFR TKI ve MET-TKI kanser hücrelerinin içinde çift direnç kurmak için bir vitro yöntemi açıklanmıştır. MET-güçlendirme ile EGFR-TKI tedaviye rağmen hastalık ilerleme sergileyen EGFR mutasyon, hastalar için tedavi geliştirmek için yararlı bir yöntemdir. Ayrıca diğer molekülleri hedefleme inhibitörleri için değiştirilebilir.

2-adım doz-yükseltme yordamını akciğer adenokarsinom hücre Vitro EGFR-TKI ve bir araya geldi-TKI çift direnç kurulması

Bu kanser yönetimi yüksek karşılanmamış bir tıbbi ihtiyaç olduğu hedeflenen terapötik ajanlar, Edinsel direnç mekanizmaları araştıran bir zaman ve cost effective vitro protokoldür.

Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme

Bir lentiviral shRNA havuzu kullanılarak yüksek verimli RNA girişimi (RNAi) taraması, malignitelerde terapötik olarak ilgili sentetik ölümcül hedefleri tespit etmek için bir araç olabilir. Akut miyeloid lösemide (AML) epigenetik efektörleri araştırmak için havuzlanmış bir shRNA tarama yaklaşımı sunuyoruz.

Bir İlaç Direnci Fenotipini Modüle Eden Faktörleri Tanımlamak için Havuzlanmış shRNA Kütüphanesi Taraması

Katarakt dünyada körlüğün en önde gelen nedenidir. Güneş ultraviyole radyasyon (UVR) katarakt gelişimi için en önemli risk faktörüdür. Kadar UVR-B ile indüklenen katarakt bir hayvan modeli geliştirilmiştir. UVR, kantitatif RT-PCR ve immünohistokimyasal maruziyet: Bu yazıda katarakt oluşumu soruşturma yöntemleri açıklanmaktadır.

Moleküler Mekanizmalarının Karakterizasyonu<em&gt; In vivo</em&gt; UVR İsteyerek Katarakt

Basınç myography basınçlı zaman sürekli daralma geliştirmek küçük arterlerin vazoaktiviteye değerlendirmek için kullanılır. Bu yazıda sıçanların, vazoaktiviteye ve damar çapı intraluminal basıncın etkisi küçük mezenterik arterler izole segmentlerinde değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Basınç myography kullanma Direnç Mezenterik Arter ise andMyogenic Tepkisi ve vazoaktiviteye Değerlendirilmesi

Keşfedin, hedefli tedavilere direnç mekanizmalarını hızla belirlemek için in vitro ilaç direnci hattı türetme ve dizileme protokolünü. Bu yöntem, klinik yönetim stratejilerini geliştirmeye yardımcı olur.

Uygulanması

Daha fazla video keşfet