Uygulanması İn Vitro İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli tedavi sınıflarına fonksiyonel olarak direnç sağlayabilen klinik olarak anlamlı tek nükleotid varyantlarının hızlı preklinik keşfini kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, onkoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin hangi gen mutasyonlarının klinikte tedavilere karşı fonksiyonel dirence katkıda bulunabileceği ve sonuçta tedavilerde iyileşmeye ve ilaca dirençli hastalar için alternatif klinik yönetim stratejilerine rehberlik edebileceği gibi. Bu tekniğin temel avantajı, spontan mutasyonların ortaya çıkmasını kolaylaştırdığımız ve dirençli klonlarda tarafsız bir tarama teknolojisi uyguladığımız için, bu varyantların klinikte nüks hedefli tedavileri yönlendirme olasılığının daha yüksek olmasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan çok yetenekli bir araştırmacı olacak Hücre hatları için GI 50'yi değerlendirmek için. Hücreleri şeffaf olmayan berraklıkta tohumlayarak bir tahlil plakası hazırlayın. Burada gösterilen haritaya göre 100 mikrolitre hücre ortamında alt 96 kuyucuklu plakalar.

Benzer şekilde bir kontrol plakası hazırlayın, mavi kuyucuklara hücreler ve beyaz kuyucuklara sadece orta ekleyin. Plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, ışıldayan hücre canlılık reaktifini oda sıcaklığına dengeleyin ve ters çevirerek hafifçe karıştırın. Homojen bir çözelti elde etmek için, kontrol plakasının kuyucuklarına 80 mikrolitre reaktif ekleyin ve içeriği 30 dakika çalkalayın.

Hücre lizizini indüklemek için. Lüminesansı kaydetmek için 0,1 ila 1,0 saniye pozlama ve 560 nanometre algılama dalga boyuna sahip bir luminometre kullanın. Daha sonra, test bileşiklerini tahlil plakalarına eklemek için, toplam 10 seyreltme için 2000 mikromolar konsantrasyondan başlayarak DMSO'da bileşiğin dörtte biri seyreltmesinden oluşan bir seri yapın.

Daha sonra, 10 x nihai konsantrasyonda bir bileşik ortam karışımı yapmak için seri olarak seyreltilmiş bileşikleri ortama ekleyin. Bileşik plakayı, testin üçüncü gününde kullanmak üzere eksi 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, seyreltilmiş bileşiklerin 10 mikrolitresini, en yüksek doz 10 mikromolar olacak şekilde üç kopya halinde hücrelere ekleyin.

Plakaları üç gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Üçüncü günde, üç gün önce hazırlanan bileşik plakaları kullanarak 400 mikrolitrelik bir X bileşik orta karışımı hazırlayın. Ortamı çıkarmak için tahlil plakalarını ters çevirin ve otoklav kağıt havlular üzerinde iki ila üç kez kurulayın.

Mavi renkte iyi gölgelenmiş bir x bileşiği ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için çevre kuyularına 100 mikrolitre orta ekleyin. Altıncı günde, videoda daha önce gösterildiği gibi lüminesans okuması yaparak canlı hücrelerin nispi sayısını değerlendirin. Ardından, hesaplanan GI 50 değerlerini kullanarak PRISM gibi bir yazılım kullanarak GI 50 değerlerini hesaplayın, ilaç direnci tahlilleri için hücreler ayarlayın.

Sitostatik bir ajanla çalışıyorsanız, tohum hücreleri% 30 ila 40 oranında 150 milimetre kare kültür kaplarında birleşir. Toksik bir ajanla çalışıyorsanız, hücrelerin% 70 ila 80 oranında birleştiğini görün. Metin protokolüne göre ilk bileşik konsantrasyonlarını belirledikten sonra, hücreleri, altı günlük bir canlılık testinde hücre ölümüne neden olan yüksek derecede toksik bileşikler için test bileşikleri ile tedavi edin.

GI 50 ile başlayın ve sağlam direnç gözlenene kadar konsantrasyonu her iki ila üç haftada bir kademeli olarak artırın. Tek hücre klonlarını izole etmek için, kültür kabını incelemek ve çanağın altındaki canlı hücre kümelerini belirlemek için 40 x büyütmede faz kontrast mikroskobu kullanın. Bir P 200 pipetleyici kullanarak klonları seçmek için ortalama büyüklükte ve diğer kolonilerden iyi izole edilmiş klonları işaretlemek için bir kalem kullanın.

Büyüme ortamını tabaktan çıkarın ve yüzen hücreleri durulamak için bir XPBS kullanın. Pipet ucu ile klonları kaldırın ve 50 mikrolitre% 0.25 Tripsin içeren 48 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın ve bir ila iki dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, hücrelerin en iyi şekilde geri kazanılmasını sağlamak için bileşik konsantrasyonunun yarısı ile 200 mikrolitre taze ortam ekleyin.

Klonları üç milimetre klonlama diski kullanarak izole etmek için, diskleri iki dakika boyunca beş mililitre% 0.25 tripsin EDTA içeren 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin. Daha sonra, besiyerini dirençli klonları içeren çanaktan aspire edin ve klonları geziler ve ıslatılmış klonlama diskleri ile kaplayın. Klonların plakalardan ne kadar kolay kalktığına bağlı olarak 37 santigrat derecede bir ila iki dakika inkübe edin.

Daha sonra steril forseps kullanarak, klonlama disklerini alın ve 200 mikrolitre taze ortam ile 48 oyuklu plakaya aktarın ve hücreleri klonlama disklerinden çıkarmak için bileşik konsantrasyonunun hafifçe yukarı ve aşağı pipetlenmesini sağlayın ve ertesi gün gece boyunca 37 derecede inkübe edin, klonlama disklerini çıkarın, hücreleri inkübe edin, Daha sonra ilaç direncini değerlendirin. Metin protokolüne göre, burada gösterildiği gibi, HCT bir 16 hücresi sitotoksik ile uzun süre tedavi edilir. Bir numaralı bileşik, tedavi sırasında büyümeye devam eden dirençli klonların kendiliğinden ortaya çıkmasına neden oldu.

Klonlar bir pipet adam kullanılarak toplandı. Bu şekilde, bir ila üç arasındaki dirençli klonların tümü, bir numaralı bileşiğe ve iki numaralı yakın analog bileşiğe karşı önemli direnç gösterirken, tüm klonlar ilgisiz bir sitotoksik bileşiğe duyarlılık göstermiştir. Velcade. Fenotipik direncin doğrulanmasını takiben, GDNA izole edildi ve tüm ekzom sekanslama analizi için gönderildi.

Tekrarlayan ve fonksiyonel etki potansiyeline sahip yapısal varyantlar, Sanger dizilemesi gibi bağımsız bir dizileme aracı ile doğrulandı. Burada gösterilen bir örnek, heterozigot bir yanlış anlamlı mutasyon taşıdı ve ebeveyn hücre hattı daha sonra mutasyona uğramış CDNA'yı ifade etmek için tasarlandı. Vahşi tip CDNA'nın aşırı ekspresyonu ise ilaç direnci sağlayamadı.

Mutant CD NA, bir numaralı bileşiğe önemli ölçüde fenotipik direnç kazandırdı ve yapısal varyasyonun direncin itici gücü olarak işlevsel rolünü doğruladı. Bu videoyu izledikten sonra, kanser hücrelerinde gelişim sonrası ilaç direncinden sorumlu olan genleri taramak için spontan dirençli büyümenin nasıl geliştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, onkoloji alanındaki araştırmacıların hem kanser hücre hatlarında hem de hayvan modellerinde ilaç direnç mekanizmalarını tarafsız bir şekilde keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.