Name: Sınıf 1 integronlar ve Gen Kasetleri için gıda maddelerinin taranması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Keşfedin, gıda maddelerinden sınıf 1 integronları ve antibiyotik direnç gen kasetlerini tespit etmek için PCR ve DNA dizileme yöntemlerini kullanarak bakteri izolasyonu ve moleküler tarama tekniklerini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Michaela Hall, Larissa Bispo ve Teknik Yardım Gustavo Tavares teşekkürler.

Çiğ veya hafifçe pişirilir Gıda insan sağlığı için en endişe vardır. Örnekler salata sebze, meyve, kabuklu deniz ürünleri ve kabuklular yer alıyor. 1. Örnek Toplama <ol><li> Kontaminasyonu en aza indirmek koşullarda örnekleri toplamak ve taşıma sırasında ayrı, temiz torbalar içinde saklanan. Toplanan sonra, numuneler 4 ° C&#39;de saklandı ve 24 saat içinde işleme tabi tutulmalıdır. </li></ol> 2. Zenginleştirilmiş Kültür Hazırlık <ol><li> Meyve ve sebzeler: <ol><li> Dayanıklı bir plastik torba içinde malzemenin, yaklaşık 10 g yerleştirin. Daha büyük malzeme işleme durumunda, meyve veya sebze cilt üzerinde yoğunlaşırlar. 30 sn için bir kanatlı karıştırıcı içinde 90 ml 0.1 M sodyum fosfat tamponu, pH 7.0 ve işlem ekleyin. Bir kanatlı karıştırıcı mevcut değildir Alternatif olarak, malzemenin elle çalkalanır edilebilir. </li><li> Iki adet 50 ml Falcon tüpler içine sıvı toplayın. Pelet bakteri 7 dakika boyunca 4.000 xg&#39;de santrifüj tüplerine. </li&gt; <li> Dikkatle steril Luria Bertani (LB) suyu 30 ml pelet bakteri süpernatant kaldırmak ve askıya. </li><li> 37 ° C sıcaklıkta başka 25 ° C de bir tüp tutarak ve bir çalkalayıcı O / N üzerinde inkübe edin. Kültürler dakikada 200 salınım (OPM) de çalkalanmalıdır. 4 ° C&#39;de saklayın kültürleri kadar gerekli. </li></ol></li><li> Deniz ürünleri: <ol><li> Steril forseps ve cımbız kullanarak mide (istiridye) ya da sindirim sistemi (karides) inceleyin ve 0.1 M sodyum fosfat tamponu, pH 7.0 200 ul içeren steril 1.5 ml tüp içine yerleştirin. Bir Homojenat oluşturmak için örnek ıslatarak yumuşatmak. </li><li> Iki steril 5 ml tüpler içine LB suyu 5 ml koyun ve deniz homojenatı ile zerk. </li><li> 25 ° C&#39;de ve diğer 37 ° C&#39;de bir tüp tutarak, bir çalkalayıcı, O / N üzerinde inkübe edin. Kültürler 200 orijinale de çalkalanmalıdır. 4 ° C&#39;de saklayın kültürleri kadar gerekli. </li></ol></li></ol> Integron 3. Tarama Kültürleri MgCI2 konsantrasyonu. Gerekirse, Lorenz (2011) 24, bu derginin bir önceki sayısında PCR optimizasyon ve sorun giderme yöntemleri sıraladı. <ol><li> Haşlanmış DNA hazırlığı: <ol><li> Steril 0.5ml PCR tüpüne zenginleştirilmiş kültür, 100 ul koyun. Bir su banyosu ya da ısıtma bloğu kullanılarak, 10 dakika boyunca 99 ° C&#39;ye kadar örnek ısıtın. 2 dakika boyunca buzda çekin. </li><li> 5 dakika için 14,000 x g&#39;de Mikrosantrifüj hücre yıkıntıları pelet haline getirildi. Buz dönün. DNA örnekleri gerekene kadar -20 ° C&#39;de dondurulur, ancak buz üzerinde eritildi olmalıdır. </li></ol></li><li> PCR kullanılarak 1. sınıf İntegronların için tarama: Not: O / N inkübasyon Karışık kültürler HS463a / HS464 PCR protokolü (Tablo 1) kullanarak Sınıf 1 İntegronların için taranır. <ol><li> Olası sou uzakta, buz üzerinde tüm PCR reaktifler çözülmeDNA kontamine rces. Negatif kontrol (Tablo 2) de dahil olmak üzere, örnek başına 48 | il PCR MasterMix hazırlayın. Bariyer ipuçlarını kullanarak, her tüpe PCR master karışımı 48 ul koyun. </li><li> Bariyer ipuçlarını kullanarak bireysel PCR tüplerine çözülmüş DNA 2 ul ekleyin. PCR PCR uygun programını çalıştırın. </li><li> Amplifikasyon sonuçlarını değerlendirmek için, dökülmüş ve TBE tamponu (90 mM tris-borat, 2 mM EDTA) içinde işletilen bir% 2 agaroz jeli üzerinde PCR ürünün 7 ul Electrophorese. Bir 100 bp merdiven gibi bir molekül ağırlığı işaretleyici, içerir. </li><li> Mesaj DNA leke jel leke ve UV transilluminator kullanarak görselleştirmek. Negatif kontrolde hiçbir amplifikasyon olmamıştır olmadığını kontrol edin. Herhangi bir numune için yaklaşık 470 bp de güçlü bir bant karışık kültür sınıf 1 integron taşıyan bakteri içerdiğini gösterir. Saf koloniler artık pozitif PCR iade edilen karma kültüründen izole edilecektir. </li></ol></li></ol><ol><li> Seri dilüsyonları ve yayılma plakaları: Not: PCR-Pozitif karışık kültürlerden tek koloniler izole etmek için, karışık kültür seri sodyum fosfat tamponu içinde 10-kat seyreltilmiştir, ve daha sonra tek koloniler kurtarmak için kaplanır. <ol><li> 0.1 M sodyum fosfat tampon maddesi, pH 7.0, 9 ml karışık kültür 1 ml ilave edilir ve ters çevirme ile karıştırın. 10 -8 bir seri dilüsyona kadar fosfat tampon maddesi bir başka 9 ml seyreltme 1 ml ilave edilir ve tekrar ulaşılır. </li><li> Nüsha halinde, LB agara 10 -4 -8 10 dilüsyonlarının 100 ul yayıldı. Ilk karma kültürü için kullanılan aynı sıcaklıkta plakaları O / N inkübe edin. Plakalar daha sonra bununla birlikte oldukça derhal tek koloniler işlemek için en iyi, gerekli olana değin 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> Tek bir koloni seçimi ve kaynatıldı DNA hazırlığı: <ol><li> Se seri seyreltme plakaları, gelen tek koloniler seçinBöyle bir koloni, boyut, şekil ve renk gibi kriterler kullanılarak, mümkün olduğunca çok sayıda farklı koloni türleri çildiğinde. Yayılmış plaka tek koloniler seçmek için steril kürdan kullanın. </li><li> Koloni kürdan dokunun ve sonra steril su 100 ul içeren bir PCR tüpüne aktarın. Kolonilerin çok sayıda taranması için ise, daha sonra koloniler, bir mikrotitre tepsi hazırlanabilir. Suya bazı hücreler çıkarmak için parmaklar arasında kürdan Spin. </li><li> Aynı kürdan kullanarak, koloninin bir çizgi ile bir LB plaka aşılamak. Her bir çizgi yaklaşık 1 cm uzunluğunda olduğunda koloniler çok sayıda etiketli plakaları üzerinde saklanabilir. Eğer izolatların uygun sayıda seçilmiş kadar 1 3 arası adımları tekrarlayın. </li><li> Başlangıç ​​zenginleştirilmiş kültür için kullanılan ile aynı sıcaklıkta, LB plakaları O / N inkübe edin. Gerekene kadar Kültürler daha sonra 4 ° C de muhafaza edilebilir. </li><li> Bakteriyel süspansiyonlar DNA hazırlamak için, ou adımları izleyinBölüm 3.1&#39;de tlined. Bölüm 3.2 de tarif edilen saf kültür lizatlarının tarama için, HS463a / HS464 PCR işlemi gerçekleştirmek. Bu olumlu bir PCR genomik DNA (bölüm 5) bileşiğinin hazırlanması için kullanılan ve ayrıca analiz için olan geri izole eder. </li></ol></li></ol> Boncuk 25 Dayak Kullanılması 5. Genomik DNA Ekstraksiyon integron pozitif Tek Kolonileri <ol><li> Bölüm 4.2&#39;de izole saf kültürünün bir numunesi ile LB suyu 5 ml inoküle. Başlangıç ​​zenginleştirilmiş kültür için kullanılan aynı sıcaklıkta çalkalanarak, O / N inkübe edin. </li><li> Pelet hücreleri 7 dakika boyunca 4.000 xg&#39;de sonra süpernatant kaldırmak. Bir Parçalama Matrix E hızlı hazırlık tüp içinde 1 ml CLS-TC çözeltisi içinde pelet hücreleri tekrar süspansiyon. Bir kordon çırpma makinesi kullanılarak, 30 saniye süre ile 5.5 m / sn örnek işlem. </li><li> Santrifüj 5 dakika için 14,000 x g&#39;de boru ve steril bir 1.5 ml tüp içine süpernatant 700 ul iyileşir. </li><li> 6 M Guan ile 5: 1 oranında sulandırılmış bağlayıcı matrisin 700 ul ekleidinium tiyosiyanat ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırılır. 1 dakika, ıskarta süpernatant 14,000 xg&#39;de Santrifüj. </li><li> Topak yeniden süspansiyon haline getirildi, tam kadar 800 ul bir tuzu etanol yıkaması (% 70 etanol, 0.1 M sodyum asetat) ve vorteks ekleyin. 1 dakika için 14,000 x g&#39;de oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj için yıkayın ve süpernatant atılır. Ve daha sonra 5 dakika boyunca kurumaya bırakın gerektiğinde bir mikropipet kullanılarak, üstte kalan maddenin hepsi kaldırıldı emin olun. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme 200 ul TE (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 7.6) &#39;de pelet matrisi süspanse edin. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 3 dakika ve steril bir tüpe transferi elüt DNA 160 ul 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin. DNA ekstraksiyonu verimini ve bütünlüğünü kontrol etmek için bir% 2 w / v agaroz jeli üzerinde genomik DNA izolasyonu bir kısım çalıştırın. Saflaştırılmış genomik DNA, -20 ° C&#39;de saklandı ve PCR testleri için gerekli olduğunda buz üzerinde buzu çözülür. </li></ol> 6. Tanı PCR&#39;ler ve DNA Dizi NOT:5. bölümünde hazırlanan genomik DNA, tüm tanı PCR&#39;ler için kullanılacak, ve sınıf 1 İntegronların için pozitif test teyit etmek için. <ol><li> Kısaca 20 saniye boyunca 14.000 xg&#39;de DNA örneği ve nabız sıkma vorteks, buz üzerinde genomik DNA çözülme. Izolat 471 bp amplikon (Kısım 3.2) için olumlu olduğunu teyit HS463a / HS464 (Tablo 1) kullanarak sınıf 1 integron-entegraz geni için PCR tekrarlayın. </li><li> Tür düzeyinde pozitif kültür tanımlanması küçük alt-ünite rRNA geninin (16S rDNA) analizi ile elde edilmektedir. Primerleri F27 &#39;yi / r1492 (Tablo 1) kullanarak 16S geni yükseltin. Elektroforezi kullanılarak PCR ürünleri kontrol edin. Tüm bakteriyel hedef yaklaşık 1450 bp&#39;lik bir 16S amplikon oluştursun. </li><li> Sıra 16S rRNA gen amplikon tür kimliğini belirlemek için, aynı bakteri türü olacak adım 6.2 birden fazla pozitif PCRlar olması muhtemeldir ve bu pozitiflerin çoktur çünkü, biz ilk istimal farklı türler ayırt edecek16S PCR ürününün g restriksiyon sindirimi. <ol><li> Restriksiyon enzimi Hinf 1 ile 16S PCR bir kısım Digest. Herhangi bir 4 bp bölünme siteleri yapacak tanır enzim, ancak Hinf 1 16S hedeflerden iyi çeşitliliği oluşturur ve güvenilir, ucuz bir enzimdir. </li></ol></li><li> 30 ul bir kısıtlama steril bir tüpe, master (Tablo 2) sindirimi ve BM-purfied 16S PCR ürününün 20 ul ekle ayarlayın. 37 ° C su banyosu O / N inkübe edin. % 2 agaroz jeli üzerinde özet edin. </li><li> Hinf 1 tarafından üretilen sindirim desenleri Puan. Aynı 16S kısıtlama profili ile İzolatlarının aynı tür olması muhtemeldir. Aksine, her Hinf 1 sınırlandırma modeli çoğu üç temsilci her 16S PCR ürünü, diziyi sıralanmasıyla daha. </li><li> Bir ticari kit kullanılarak 16S PCR ürünleri arındırın. Tek şeritli ekzonükleaz kiti kullanılabilir, ancak sütun bazlı veya çöktürme yöntemleri de uninc kaldırmak için iyi işorporated primerleri ve tek şeritli DNAlar. Dizi, astar R910 (Tablo 1) kullanarak sıralama tesisi tarafından belirtilen reaksiyonlar kurma 16S amplikonlarının. </li><li> Blastn fonksiyonu ile (NCBI DNA veritabanı sorgulamak için elde edilen DNA dizisini kullanın <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). Büyüktür% 97 nükleotid kimliği genellikle türler kimlik olarak alınır. </li></ol> 7. Haritalama ve integronlar ve Kaset Diziler Karakterizasyonu NOT: İnsan-egemen ekosistemlerin kaynaklanan Sınıf 1 integronlar tüm örneklerinde en sık integronlar olması muhtemeldir. Bu integron Tüm yapılan tek bir kökene sahip ve bu nedenle yüksek oranda korunmuş bir DNA sekansı 5 sahiptir. <ol><li> Bir sınıf olarak 1, insan kaynaklarından yayılan integron ve performans ile çevre numuneleri içinde doğal olarak o ayırtAstar ile PCR intI1F165 / intI1R476 10 (Tablo 1) ayarlayın. NOT: Çevresel sınıfı 1 integronlar herhangi bir ürün üretmek olmaz ise klinik veya ortakçı bakterilerden Sınıf 1 integronlar bir ~ 300 bp ürünü üretecektir. </li><li> Primer seti HS458 / HS459 ile kaset dizisi yükselterek klinik integronlar karakterize. Bu PCR çoğu kaset dizilerin ucundaki intI1 ve 3 &#39;korunmuş segmentinde arasındaki bölgeyi yükseltmek olacaktır. Kasetlerin numarası ve kimlik değişken olduğu için, PCR ürününün boyutu da değişir. </li><li> Amplikonları arındırmak ve amplifikasyon primerlerinin her biri kullanılarak DNA sekansı. Blastn işlevini (kullanılarak DNA veritabanlarını sorgulamak için dizileri kullanın <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li><li> Integron gen kasetinin için birçok veri yeminli beri, standart isimlendirme 9 izleyin kaset adlandırma oluns tutarsız veya belirsiz adları kullanabilirsiniz. Bu geçirgenlik, patojenitesini veya virülans 8,21 artış kazandıran genler de dahil olmak üzere, yeni fenotipleri kodlayabilmektedir beri yeni gen kasetleri özellikle dikkat verin. NOT: Sınıf 1 integron preklinik formları hala doğal ortamlarında dolaşır. Özel olarak, aktif Tn 402 transpozonlar bağlantılı olanlar en çok ilgi 26 arasında bulunmaktadır. Bu İntegronların kaseti dizileri primer seti HS458 / HS459 ile amplifiye değil, ancak kaset içeriğine bağlı olarak farklı boyutlarda amplıkonları üreten MRG284 / MRG285 primer kümesi (Tablo 1) ile amplifiye edilebilir. PCR ürünleri saflaştınldı ve 7.2 de tarif edilen bir DNA dizisi gerekmektedir. </li></ol>

<ol><li>Bush, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tackling antibiotic resistance.</a> Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).</li>
<li>Davies, J., Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+evolution+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Origins and evolution of antibiotic resistance.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).</li>
<li>Costa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+is+ancient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance is ancient.</a> Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+consequences+of+antibiotic+use+for+the+resistome%2C+mobilome+and+microbial+pangenome%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome.</a> Front. Microbiol. 4, 4(2013).</li>
<li>Gillings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+class+1+integrons+and+the+rise+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance.</a> J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).</li>
<li>Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+relative+strength+of+tandem+promoters+for+the+antibiotic-resistance+genes+of+several+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons.</a> Gene. 142 (1), 49-54 (1994).</li>
<li>Partridge, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+attI1+site+of+class+1+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Definition of the attI1 site of class 1 integrons.</a> Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrons%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrons: Past, Present, and Future.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).</li>
<li>Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+cassettes+and+cassette+arrays+in+mobile+resistance+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+class+1+integron-integrase+gene+as+a+proxy+for+anthropogenic+pollution%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution.</a> ISME J. In press, (2014).</li>
<li>Gaze, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impacts+of+anthropogenic+activity+on+the+ecology+of+class+1+integrons+and+integron-associated+genes+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment.</a> ISME J. 5, 1253-1261 (2011).</li>
<li>Gerzova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microbiota+composition+and+presence+of+selected+antibiotic+resistance+genes+in+carriage+water+of+ornamental+fish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish.</a> PLoS ONE. 9, e103865(2014).</li>
<li>Power, M., Emery, S., Gillings, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+the+wild%3A+dissemination+of+antibiotic+resistance+determinants+via+a+species+recovery+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program.</a> PLoS ONE. 8, e63017(2013).</li>
<li>Stokes, H. W., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+flow%2C+mobile+genetic+elements+and+the+recruitment+of+antibiotic+resistance+genes+into+Gram-negative+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).</li>
<li>Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+diversity+of+conjugative+plasmids+in+integron-carrying+bacteria+from+wastewater+environments%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments.</a> FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+and+composition+of+a+plasmid+metagenome+from+a+wastewater+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant.</a> J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).</li>
<li>Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+systems%3A+maintaining%2C+mixing+and+mobilising+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22TREE%22%5BJournal%5D)">Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance.</a> TREE. 26 (6), 278-284 (2011).</li>
<li>Stalder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+impact+of+hospital+effluent+on+dissemination+of+the+integron+pool%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool.</a> ISME J. 8, 768-777 (2014).</li>
<li>Allen, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Call+of+the+wild%3A+antibiotic+resistance+genes+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments.</a> Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).</li>
<li>Wellington, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+natural+environment+in+the+emergence+of+antibiotic+resistance+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria.</a> Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+a+Tn402-like+class+1+integron+with+a+novel+cassette+array+via+flanking+miniature+inverted-repeat+transposable+element-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures.</a> Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).</li>
<li>Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underappreciated+role+of+regionally+poor+water+quality+on+globally+increasing+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance.</a> Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).</li>
<li>Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibiotic+resistome%3A+what%27s+new%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The antibiotic resistome: what's new.</a> Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+PCR-Competent+DNA+from+Recalcitrant+Environmental+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples.</a> Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).</li>
<li>Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+class+1+integron+with+a+complete+Tn402-like+transposition+module%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module.</a> Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).</li>
<li>Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+in+the+environment%3A+A+link+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic.</a> Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).</li>
<li>Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+1+integrons+predating+the+association+with+Tn402.-like+transposition+genes+are+present+in+a+sediment+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community.</a> Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).</li>
<li>Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+DJ+%22Nucleic+Acid+Techniques+in+Bacterial+Systematics%22">Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics</a>. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).</li>
<li>Holmes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+activity+of+a+distinctive+integron-gene+cassette+system+associated+with+stutzeri.+populations+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil.</a> Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa ilgili hiçbir şey yok.

İntegronların ve bunların ilişkili gen kasetlerinin tanımlanması potansiyel, yeni fırsatçı patojenlerin ortaya çıkması tahmin insan besin zincirine patojenler için yollar izleme ve yeni direnç belirlenmesinde önemli bir adımdır ve virülans 8,21,26 determinantlar. Bu yazının amacı, sınıf 1 İntegronların için örnek tarama onların kaset dizileri karakterize ve ikamet ettikleri bakteri türlerinin belirlenmesi için bir aerodinamik yaklaşım tanımlamak için oldu. Protokolde Kritik adımlar iyi mikrobiyolojik uygulama...

Antibiyotiklerin keşfi 20. yüzyılın en büyük bilimsel başarılarından biri oldu. Ancak, antibiyotik kullanımı ve kötüye antibiyotiğe dirençli bakterilerin hızlı evrim yol açmıştır ve bu artık 21. yüzyılda halk sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. En tedavi seçenekleri dirençli bakteri suşlarının yükselişi biz antimikrobiyal ilaçlar artık 1,2 etkili bir döneme giriyoruz olasılığını yükseltir. Antibiyotik direnci kazandıran genetik makine yıl 3 milyonlarca insanları ve antibiyotik seçimi baskıları predating, antik bir sistemdir. Örneğin plazmidler, transpozonlar, genomik adaları, bütünleştirici konjugatif elemanlar ve İntegronların gibi mobil genetik elementler içinde ve bakteri türlerinin 4 ile, her iki antibiyotik direnç genlerini (ARG) yayabilirler. Bunlardan, integronlar rağmen, ARG yayılmasında önemli bir rol oynamıştırOnlar bakteri genomları 5 içine plazmidler ve seferberlik ve ekleme için transposonların güvenmeye gerçeği. Integron bir integron-integraz kullanılarak gen kasetleri yakalama ve daha sonra kodlanmış bir integron promotör 6,7 (Şekil 1) kullanılarak kasetleri ifade eder. Gen integron kasetleri, ürünleri antibiyotik veya dezenfektanların 8 direnç kazandırabildiği tek bir açık okuma çerçeveleri (ORF) &#39;den oluşan küçük mobil elemanlardır. Sınıf 1 integronlar en yaygın toplu olarak 130 farklı antibiyotik direnç geni kasetleri üzerinden 9 edindikleri klinik izolat 5, kurtarıldı integronlar vardır. İnsan ilişkili ortakçı ve patojenik bakterilerin içine Sınıf 1 İntegronların yayılması bu genetik elementlerin 10 büyük sayı içeren insan atık akımlarını oluşturur. Sınıf 1 integronlar içerirler tahmini 10 19 bakteri kanalizasyon çamuru her yıl i yoluyla yayımlanann Birleşik Krallık 11. Bu antibiyotik dirençleri veren 1. sınıf integronlar artık yabani kuşlar, balıklar ve diğer yerli yaban hayatı 12-14 Mikrobiyota tespit ediliyor, bu nedenle şaşırtıcı değildir. Yeni gen kasetleri ve diğer mobil unsurları ile karmaşık düzenlenmeleri kazanılması, özellikle kanalizasyon arıtma tesisleri ve diğer su kütleleri 15-18 yılında, oluşmaya devam beri geri çevreye integronlar Salıcı, önemli bir halk sağlığı tehdit oluşturuyor. doğal çevre ardından yeni direniş belirleyicileri ve fırsatçı patojenler 19,20 için verimli bir işe zemin haline gelir. Roman integron içeren bakteri ve yeni argüman kontamine su ve gıdalarla 21,22 yoluyla insan toplum içine geri daire. Çevre args gözetim anlayışı ve gelecek 23 yılında antibiyotik direnci yönetmek için temel bir stratejidir. Özellikle dikkat çiğ yenen veya olduğu gıda maddelerine dikkat edilmelidirBu yeni mobil elemanlar ve patojenlerin bulaşma için en büyük tehdit teşkil beri hafifçe pişirilir. Bu protokol, 1 integron ve gıda maddelerinde, ilişkili gen kasetleri, saptanması, tanımlanması ve sınıfı karakterize etmek için düzenlenmiş bir yaklaşımda, (Şekil 2) tarif edilmektedir. Kültürleme ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir arada kullanarak, integronlar hızla karmaşık bakteri toplulukları ve bireysel izolatların tespit edilebilir. Bakteri ve integron-ilişkili gen kasetlerinin uyum ve kimlik türlerin belirlenmesi için yöntemler verilmiştir. yöntem, bitki ve hayvan gıdaların geniş bir aralığı için uygundur, ve tipik iş akışları örnekleri bu gıda türlerinin her biri için verilmiştir.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Renksiz Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>Tüm PCR'lerde kullanılır</td></tr><tr><td>RNAse (sığır pankreasından Ribonükleaz A)</td> <td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>Tüm PCR'lerde kullanılır</td></tr><tr><td>HinFI kısıtlama enzimi</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>16S rDNA PCR ürünlerini sindirmek için kullanılır. Enzim, optimum tampon ve BSA</td></tr><tr><td>100 bp merdiven</td> ile birlikte gelir <td>GE Sağlık</td><td>27400701</td><td>Tüm agaroz jellerinde boyut standardı olarak kullanılır</td></tr><tr><td>GelRed DNA lekesi</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>DİKKAT: Bu malzemeyi tutarken kişisel koruyucu giyilmelidir</td></tr><tr><td>Guanidinyum tiyosiyanat</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM9422</td><td>DİKKAT: Bu malzemeyi tutarken kişisel koruyucu giyilmelidir</td></tr><tr><td>CLS-TC Çözelti</td><td>MP Biyomedikal</td><td>6540409</td><td>Genomik DNA ekstraksiyonunun başlangıcında kullanılan resüspansiyon çözeltisi</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E FastPrep tüpleri</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>Bakteri hücre duvarlarının mekanik olarak bozulması için gerekli olan tüp. Bu kod 500 tüplük paketler için kullanılır, daha küçük miktarlar mevcuttur.</td></tr><tr><td>Bağlayıcı matris</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>116540408</td><td>6 M guanidinyum tiyosiyanat ile 1:5 oranında seyreltilir ve genomik DNA ekstraksiyon yönteminde kullanılır.</td></tr><tr><td>Hızlı Hazırlık makinesi</td><td>MP Biyomedikal</td><td>Mevcut seçenek sayısı</td><td>MP Biomedicals, satın alınabilecek bir dizi FastPrep makinesine sahiptir. Daha fazla bilgi için <a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">http://www.mpbio.com</a> adresini ziyaret edin</td></tr></tbody></table>

sınıf 1 integronlar ve gen kasetleri için gıda maddelerinin taranması

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Antibiyotik direnci, 21. yüzyılda sağlığa yönelik en büyük tehditlerden biridir. Yanal gen transferi yoluyla direnç genlerinin elde edilmesi, çeşitli direnç mekanizmalarının yayılmasında önemli bir faktördür. Lateral transferi kolaylaştıran DNA elementleri arasında, sınıf 1 integronlar, Gram negatif patojenler arasında antibiyotik direnç belirleyicilerinin yayılmasından büyük ölçüde sorumlu olmuştur. Toplamda, bu integronlar 130'dan fazla farklı antibiyotik direnç geni edinmiş ve yaymıştır. Devam eden antibiyotik kullanımı ile, sınıf 1 integronlar, insanların ve evcilleştirilmiş hayvanlarının kommensallerinde ve patojenlerinde her yerde bulunur hale gelmiştir. Sonuç olarak, artık yeni genler edinmeye devam ettikleri ve besin zinciri yoluyla insanlara geri dönme potansiyeline sahip oldukları tüm insan atık akışlarında bulunabilirler. Bu protokol, kültür ve PCR kullanarak gıda maddelerinde sınıf 1 integronları ve bunlarla ilişkili direnç gen kasetlerini tespit etmek için kolaylaştırılmış bir yaklaşımı detaylandırır. Bu protokolü kullanarak, araştırmacılar şunları yapabilmelidir: zenginleştirilmiş kültürler yapmak ve sınıf 1 integronları taramak için örnekler toplayın ve hazırlayın; integron-pozitif izolatları tanımlamak için tek bakteri kolonilerini izole edin; sınıf 1 integronları içeren bakteri türlerini tanımlamak; ve bu integronları ve bunlarla ilişkili gen kasetlerini karakterize eder.

Karışık kültürler ve intI1 bakteriyel izolatlar taranması Primer seti HS463a / HS464 PCR sınıfı 1 integron-integraz geninin intI1 (Şekil 1) varlığını tespit etmek için kullanılabilir. Bu primer kümesi karışık kültürlerinde intI1 saptanması için çalışır, ve ayrıca dağılma plakalarından (Şekil 2) hasat bakteri kolonileri taranması için kullanılır. Pozitif izolatlar bu primer seti (Şekil 3A) kullanılarak 471 bp tek bir güçlü bant...

Bu protokol, gıda maddelerinde sınıf 1 integronlarının ve bunlarla ilişkili gen kasetlerinin tespitini açıklar.

Sınıf 1 integronlar ve Gen Kasetleri için gıda maddelerinin taranması

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

Bu prosedürün genel amacı, gıda maddelerinden birinci sınıf integronların ve bunlarla ilişkili gen kasetlerinin tespitine yönelik kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunmaktır. Bu işlem, öncelikle seçilen gıda maddesinden zenginleştirilmiş bir bakteri kültürü oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adımda, PCR kullanılarak kültürde birinci sınıf integronların varlığı taranır ve integron pozitif karışık kültürden tekil koloniler izole edilir.Tek kolonlar integron varlığı açısından tarandıktan sonra, bakteri türlerini ayırt etmek ve gen kasetlerinin varlığını tespit etmek amacıyla tanısal PCR'lar için tek kolonlardan genomik DNA hazırlayın. Son adım, PCR ürünlerini saflaştırmak ve bunları DNA dizileme analizine göndermektir. Nihayetinde, DNA dizileme analizi, birinci sınıf bir integron içindeki gen kasetlerini karakterize etmek ve bunların hangi türlerde bulunduğunu belirlemek için kullanılır.Antibiyotik direnci, 21. yüzyılda tıbbi tedavilerin karşı karşıya olduğu temel sorunlardan biridir. Antibiyotik direncini yönetebilmenin yollarından biri, antibiyotik direnç genlerini insanlardan çevreye ve çevreden tekrar insanlara geçişlerini izlemek ve saptamaktır. Bu protokol, antibiyotik direncini

screening-foodstuffs-for-class-1-integrons-and-gene-cassettes

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Önceden hazırlanmış alıcı suşlar olarak adlandırılan iniş takımı suşları, içine faiz yabancı DNA entegre hızlı ve verimli bir yöntem tarif edilmiştir. Metodu ΦC31 integraz konjugasyonu ve ifadesi ile, belirli bir lamine suşun iniş pedi odağına içine bir DNA kasetinin site-specific entegrasyon sağlar.

Siteye özgü Bakteriyel Kromozom Mühendislik: ΦC31 integraz Aracılı Kaset Borsası (IMCE)

Bakteriler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini etkileme potansiyeline sahip salgılanan bileşikler üretirler. Burada katı ortam üzerinde Bacillus subtilis flüoresan raportör transkripsiyon suşlar ile toprak mikrop karıştırılarak gibi kimyasal olarak aracılık edilen türler arası etkileşimlerin saptanmasına imkan veren bir kokültürü ekran tarif eder.

Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

Bu çalışma, teorik olarak 200'den fazla enzime uygulanabilen evrensel bir genetik enzim tarama sistemi kullanarak yüksek verimli bir tarama yöntemi sunmaktadır. Burada, tek tarama sistemi, kullanılan substratı (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosit ve fenil fosfat) değiştirerek üç farklı enzimi (lipaz, selülaz ve alkalin fosfat) tanımlar.

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

Salmonella spp. /Shigella spp. ortak patojenler için ishal atfedilen. Burada, biz yüksek üretilen iş platformu Salmonella spp. testi ile taranması için tarif / gerçek zamanlı PCR kullanarakShigella spp. rehberli kültürü ile kombine.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Burada bir protokol antibiyotik direnç-kaset silme yapıları silme mutantlar diğer E. coli suşları yapmak için bir temel olarak önceden var olan kullanım için mevcut. Böyle silme mutasyonlar seferber ve büyük bir alıcı yük P1 bakteriyofaj iletim kullanarak odağı karşılık gelen eklenmiş.

Escherichia coli Excisable antibiyotik direnci kasetleri ile P1 iletim tarafından üreten gen silme

Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), patojen tespit alanında geniş ilgi gören bir izotermal nükleik asit amplifikasyon testidir (iNAAT). Burada, Salmonella'yı hayvansal gıdalarda taramak ve tahmin edilen Salmonella'yı kültür izolasyonundan doğrulamak için hızlı, güvenilir ve sağlam bir yöntem olarak çok laboratuvar onaylı bir Salmonella LAMP protokolü sunuyoruz.

Hayvansal Gıdalarda Salmonella Taramak ve Salmonella'yı Kültür İzolasyonundan Doğrulamak için Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon

Protokol, φC31 sistemini kullanarak Anopheles sıtma sivrisineklerinin genomunda bölgeye yönelik değişikliklerin nasıl eldeılacağını açıklar. Açıklanan değişiklikler, attP taşıyan yerleştirme hatlarının genomunda transgenik kasetlerin hem entegrasyonunu hem de değişimini içerir.

Sıtma Anopheles Vektörlerinde SiteYe Yönelik φC31 Aracılı Entegrasyon ve Kaset Değişimi

Campylobacter , dünya çapında bakteriyel gıda kaynaklı gastroenteritin önde gelen nedenidir. Kuruluşların tesislerinde yaygınlığı azaltmak için önlemler almasına rağmen, kontamine ürünler sürekli olarak tüketicilere ulaşmaktadır. Son on iki yılda geliştirilen teknik, Campylobacter spp.'yi çiğ etten izole etmek ve tespit etmek için mevcut yöntemlerin sınırlamalarını ele almaktadır.

Campylobacter spp.'nin Çiğ Etten Tespiti ve İzolasyonu

Mini-Tn7 tabanlı bir ekspresyon sistemi kullanarak bir akış pompası geninin tek kopyalı kromozomal tamamlayıcısı için tasarlanmış bir akış eksikliği olan Acinetobacter baumannii suşuna kolay bir prosedür tarif ediyoruz. Bu hassas genetik araç, çoklu ilaca dirençli patojenlerde akış pompalarının karakterizasyonu için anahtar olan kontrollü gen ekspresyonuna izin verir.

Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Bu çalışma, C-glikozitleri parçalayabilen bağırsak bakterilerini verimli bir şekilde taramak ve izole etmek için bir dizi standart işletim prosedürü (SOP) oluşturur.

C-Glikozit-Parçalayan Bağırsak Bakterilerinin Taranması ve İzolasyonu

Keşfedin, gıda maddelerinden sınıf 1 integronları ve antibiyotik direnç gen kasetlerini tespit etmek için PCR ve DNA dizileme yöntemlerini kullanarak bakteri izolasyonu ve moleküler tarama tekniklerini.

Sınıf 1 integronlar ve Gen Kasetleri için gıda maddelerinin taranması

Daha fazla video keşfet