Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, çift zincirli DNA kırılmaları çevresindeki DNA onarım proteinlerinin dağılımını nanokütçekte haritalandırmaktır. Bunun amacı, onarım sürecindeki hasarlı kromatinin ultra yapısını elektron spektroskopik görüntüleme kullanarak incelemektir. Bu işlem, DNA hasar yanıt proteinlerinin, floresan bir protein ve mini SOG etiketi içeren füzyon proteinlerini kodlayan DNA ekspresyon konstrüktları oluşturularak gerçekleştirilir.

İkinci adım olarak, konstrüktler transfeksiyonda hücrelere aktarılır ve ardından hücreler lazer veya gama ışınlamasıyla hasara uğratılır. Sonrasında, ışınlanmış ve fikse edilmiş hücreler, mini SOG etiketli onarım proteininin dağılımını elektron mikroskobunda görünür kılmak amacıyla elektron mikroskobu preparasyon aşamalarına tabi tutulur. Elde edilen elektron spektroskobik görüntüleme, kromatin ultra yapısının ve belirli proteinlerin DNA onarım odaklarıyla ilişkisinin analizine olanak tanıyan ayrıntılı görüntüler sağlar.

Bu teknolojinin ImmunoGold işaretleme gibi mevcut diğer teknolojilere göre temel avantajı, antikorların erişilebilirliğine bağımlı olmaması ve ilgilenilen yapıları oldukça yoğun bir şekilde işaretlemesidir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, foto-oksidasyonun pH'a, ışık şiddetine ve oksijen satürasyonuna karşı çok hassas olması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Foto-oksidasyon, oksijen satürasyonu ve aydınlatma adımları çok küçük değişikliklere karşı hassas olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir; bu nedenle yöntemin tekrarlanabilmesi için nasıl uygulandığının örneklendirilmesi önemlidir.

Laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Hilmar Fadden, kültürleme yöntemini size gösterecektir. Eşlik eden metin protokolünde açıklandığı üzere, mini SOG ve M cherry etiketli onarım proteinlerini stabil olarak eksprese eden insan osteosarkom hücrelerini kullanın. Hücreleri 10 santimetrelik bir kapta pasajladıktan sonra, %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar büyütün.

Ardından, hücreleri bir floresan mikroskobunun altına yerleştirin ve daha önce işaretlenmiş olan ektopik proteinleri eksprese eden hücreleri içeren yaklaşık bir kare milimetrelik küçük bir alanı ana hatlarıyla belirlemek için steril bir elmas kalem kullanın; nihai konsantrasyon 0,5 µg/mL olacak şekilde solisyona herx ekleyerek hücreleri hassaslaştırın ve ardından hücreleri 20 dakika boyunca 37 °C'deki inkübatöre yerleştirin. Daha sonra, DNA hasarı indüklemek için bir konfokal mikroskobun 405 nm katı hal lazerini kullanarak hücreleri lazerle mikro-irradiyasyona tabi tutun; DNA hasarının ardından, 30 dakika sonra oda sıcaklığında 0,1 M sodyum kat buffer içinde %4 paraformaldehitin 1 mL'si kullanılarak hücreleri karanlıkta sabitleyin.

Hücreleri pH 7,4'te 0,1 molar sodyum sitrat tamponu ile iki kez, her seferinde dört mililitre kullanarak yıkayın. Ardından, fikse edilmiş hücreleri pH 7,4'te 50 milimolar glisin, beş milimolar amino triazol ve 10 milimolar potasyum siyanür içeren iki mililitrelik bir solüsyonla 30 dakika boyunca muamele edin. Tamponu, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlanan pH 7,4'teki iki mililitre foto oksidasyon tamponu ile değiştirin.

Ardından, çözeltinin oksijenle doygun kalması için içine oksijen kabarcıkları göndererek örneği buz üzerinde karanlıkta inkübe edin. Daha sonra, fikse edilmiş hücrelerin bulunduğu kabı, 40 x yağ daldırma objektif lensle donatılmış ters floresan mikroskoba dikkatlice yerleştirin ve daha önce belirlenmiş olan ilgili bölgeye taşıyın. Yeşil floresan proteinler için kullanılan filtre küplerini kullanarak mini SOG etiketini mavi ışıkla uyarın.

Yeşil mini SOG floresansı tamamen kaybolduktan sonra bile aydınlatmaya devam edin. Polimerize diaminobenzidine'in kahverengi foto-oksidasyon ürünü iletim ışığı kanalında belirene kadar işlemi sürdürün. Ardından hücreleri, pH 7,4'te 0,1 molar sodyum fosfat tamponu içindeki %2'lik glutaraldehitin bir mililitresi ile 30 dakika boyunca sabitleyin.

Ardından, hücresel membranları 0,1 molar sodyum kat tamponu içerisinde %0,1 ile %0,5 osmiyum tetroksit ile pH 7,4'te 20 dakika boyunca sabitleyin. Sabitleme işleminden sonra, hücreleri bir dizi etanol yıkamasıyla susuzlaştırın. Daha sonra hücreleri, %100 etanol ve akrilik reçine içeren bir bire bir karışım içerisinde, bir çalkalayıcı üzerinde dört saat boyunca inkübe edin.

Ardından, karışımı çıkarın ve numunelere ek olarak dört saat boyunca %100 akrilik reçine ekleyin. Reçineyi polimerize etmek için, etiketlenmiş iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünün kapağını bir jiletle kesin ve kenarını akrilik reçine hızlandırıcı ile kaplayın. Tüpü, bir pastör pipeti kullanarak yaklaşık üçte iki oranında LR beyaz reçine ile dikkatlice doldurun.

Reçinenin, kenardaki hızlandırıcı ile temas etmediğinden emin olun. Kapta hücrelere sızmış olan reçineyi temizleyin ve kabı, tüpün genişliği kabın cam kaplı gözlem penceresini neredeyse tamamen dolduracak şekilde, dik duran mikro santrifüj tüpünün üzerine ters olarak yerleştirin. Hızlandırıcının tüpü ve lamı mühürlemesi için bir ila iki dakika bekleyin.

Ardından, tüpteki reçine hücreleri kaplayacak şekilde tüpü ters çevirin. Tüpün bulunduğu petri kabını 60 °C'ye ayarlanmış bir fırına yerleştirin ve 12 saat boyunca kürleyin. Blok kürlendiğinde, reçine dolgulu mikro santrifüj tüpünün takılı olduğu petri kabını fırından çıkarın ve mikro santrifüj tüpünü petri kabından ayırın.

Cam tabanlı kabı atın ve bloğu çıkarmak için mikro santrifüj tüpünü bir jiletle dikkatlice kesin. Jilet kullanarak, bloğu yalnızca daha önce elmas veya tungsten kalemle işaretlenmiş alanı içeren bir kare milimetrelik bölge kalacak şekilde kırpın. Ardından, bloğu bir ultra mikrotoma yerleştirin ve hücrelere ulaşana kadar bir kırpma bıçağı ile bloğu düzeltin.

Ardından elmas bıçağa geçerek hücreler üzerinden yaklaşık 50 nanometre kalınlığında ultraince kesitler alın. Kesitleri yüksek transmisyonlu 300 mesh ızgaralar üzerine toplayın. Daha sonra ızgaraları bir karbon kaplayıcıya yerleştirin ve transmisyon elektron mikroskobunun elektron demeti altında stabilize olmalarına yardımcı olmak için kesitleri yaklaşık 0,2 ila 0,4 nanometre karbon ile kaplayın.

Izgaraları, enerji filtresi ile donatılmış bir transmisyon elektron mikroskobuna yerleştirin. Kesitlerdeki hücreleri düşük büyütmeli normal transmisyon modunu kullanarak inceleyin ve bunları daha önce alınmış floresan görüntülerle karşılaştırın. DNA hasar izine veya DNA onarım odaklarına sahip bir çekirdek bulunduğunda, enerji filtreleme moduna geçin ve örneği bir kalınlık haritasıyla birlikte kaydedin.

Ardından, 20 elektron volt yarık genişliğinde, 175 elektron enerji kaybında fosfor haritası sonrası kenar görüntülerini kaydedin. Ayrıca, azot haritaları kaydı için 20 elektron volt yarık genişliğinde, 120 elektron volt enerji kaybında ön kenar görüntülerini kaydedin. 35 elektron volt yarık genişliğinde, 447 elektron volt'ta sonrası kenar görüntülerini ve 358 elektron volt'ta ön kenar görüntülerini kaydedin.

Ayrıca 35 elektron voltlik bir yarık genişliği ile. Elemental oran haritalarını, buna benzer bir görüntü işleme yazılımında açın. Azot haritasını bir RGB görüntüsünün kırmızı kanalına, fosfor haritasını ise yeşil kanalına kopyalayın.

Ardından haritaları üst üste getirin ve hizalayın. Kompozit görüntüyü etiketli görüntü dosyası formatında (TIFF) dışa aktarın ve ardından görüntüyü katmanları kullanabilen bir görüntü işleme yazılımında açın. Sonrasında, görüntüdeki minimum ve maksimum değerleri sekiz bitlik bir veri setine yeniden ölçeklendirerek her bir kanalın dinamik aralığını ayarlayın.

Ardından, katmanlar penceresi içerisindeki azot haritasından fosfor içeriğini çıkarın. Görüntüyü indekslenmiş renge dönüştürün ve nükleik asit dağılımını gösteren harita için CMYK renk uzayında sarı bir arama tablosu (lookup table), kromatin dışı protein haritasını göstermek için ise siyan bir arama tablosu oluşturun. Sonra yeni bir görüntü oluşturun ve fosfor ile kromatin dışı protein dağılımlarını gösteren haritaları farklı katmanlar olarak içe aktarın.

Her iki katmanın birbiri üzerine bindirilmiş halini görmek için ekran şeffaflık modunu kullanın. Burada, iki oran haritası RGB renk uzayında birbiri üzerine bindirildiğinde, bir hücre çekirdeğinin içindeki fosfor ve azot konumlarını gösteren elektron spektroskopik oran haritaları sunulmuştur. Bu görüntüde, burada gösterilene benzer bir görüntü elde edilir.

Sarı yapılar, hem fosforun hem de azotun varlığını yansıtan nükleer proteinleri temsil etmektedir. Burada, U2 OS hücrelerinde gama ışınlaması sonrası odak yapısındaki değişiklikleri görüntülemek için elektron spektroskopik görüntüleme kullanılmıştır. Üst sırada, M cherry etiketli onarım proteinlerini stabil olarak eksprese eden hücrelerin ışınlanmamış görüntüleri yer almaktadır.

İkinci sıra, radyasyondan üç saat sonra fikse edilmiş hücreleri göstermektedir. Üçüncü sıra ise radyasyondan altı saat sonra fikse edilmiş hücreleri göstermektedir. Elektron spektroskopik görüntülemesi, azot sinyalindeki artışla belirtilen odaklardaki 53 BP one proteininin göreceli miktarının artarken, fosfor sinyaliyle belirtilen kromatinin daha periferik bir konuma geçmesiyle, odakların yapısının zamanla yeniden organize olduğunu ortaya koymaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, elektron spektroskopik görüntüleme kullanarak DNA onarım odaklarındaki kromatinin ultra yapısını analiz etmek amacıyla, mini so onarım proteinleri eksprese eden ışınlanmış hücrelerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Sodyum klorür tamponu, potasyum siyanür ve osmiyum oksit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken çeker ocak içinde çalışmak ve eldiven giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.