Name: İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Öğrenin, yüksek kapasiteli adenoviral vektörlerin klonlanması ve büyük ölçekli üretimini. Homing endonükleazlarla transgen klonlama ve yardımcı virüsle amplifikasyon yöntemleri gen tedavisi uygulamaları için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, DFG hibesi EH 192/5-1 (A.E.), AB (E-nadir-2) projesi Transposmart (A.E.), UWH Forschungsförderung (E.S. ve W.Z) ve Witten/Herdecke Üniversitesi'nin (PB) doktora programı tarafından desteklenmiştir. JL, Çin Burs Konseyi'nin bir bursu ve T.B. ve M.G, Else Kröner-Fresenius vakfı (EKFS) tarafından desteklendi.

<ol><li>Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus vectors for gene delivery.</a> Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).</li>
<li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus%3A+the+first+effective+in+vivo+gene+delivery+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector.</a> Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).</li>
<li>Parks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13565-13570 (1996).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol Ther. 8 (5), 846-852 (2003).</li>
<li>Morral, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+a+helper-dependent+adenoviral+vector+yield+supraphysiological+levels+of+alpha1-antitrypsin+with+negligible+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity.</a> Hum Gene Ther. 9 (18), 2709-2716 (1998).</li>
<li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-dependent+adenovirus+vectors+elicit+intact+innate+but+attenuated+adaptive+host+immune+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo.</a> J Virol. 78 (11), 5966-5972 (2004).</li>
<li>Ehrhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-deleted+adenoviral+vector+results+in+phenotypic+correction+of+canine+hemophilia+B+without+liver+toxicity+or+thrombocytopenia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia.</a> Blood. 102 (7), 2403-2411 (2003).</li>
<li>Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper+dependent+adenovirus+vectors%3A+progress+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects.</a> Curr Gene Ther. 13 (5), 370-381 (2013).</li>
<li>Mizuguchi, H., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+a+recombinant+adenovirus+vector+by+an+improved+in+vitro+ligation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method.</a> Hum Gene Ther. 9 (17), 2577-2583 (1998).</li>
<li>Mizuguchi, H., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+constructing+E1-+and+E1%2FE4-deleted+recombinant+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors.</a> Hum Gene Ther. 10 (12), 2013-2017 (1999).</li>
<li>Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+adenoviral+helper-dependent+vector+results+in+long-term+therapeutic+levels+of+human+coagulation+factor+IX+at+low+doses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo.</a> Blood. 99 (11), 3923-3930 (2002).</li>
<li>Jager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+construction+and+production+of+high-capacity+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors.</a> Nat Protoc. 4 (4), 547-564 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

Burada sunulan protokol daha önce tarif edilen prosedürlere göre 4,12 insan adenovirüs tip 5 göre HCAdV vektörlerinin saflaştırılmasına olanak tanımaktadır. PAdFTC plasmidinin içinde HCAdV genom Tüm adenovirüs genlerin yoksun olan ve 5&#39;- ve 3&#39;- ITR&#39;ler ve paketleme sinyalini taşır. Bu stratejide HV AdNG163R-2 4 trans etkili bir virüs üretimi için gerekli tüm genleri içerir. Veya adeno bağlantılı virüs (AAV) vektörleri tabanlı - Bu, açık bir şekilde, birinci ve ikinci nesil ADVS...

Gen terapötik uygulamalar için, viral proteinlerin tanımlanması, transgen tarafından ya gelen viral proteinler kaynaklanan sitotoksik ve immünojenik yan etkileri önlemek için büyük bir önem taşımaktadır. Adenovirüs vektörleri (AdV), yaygın olarak transgen ekspresyonu 1,2 etkisini araştırmak için hücreler, çok çeşitli yabancı DNA&#39;nın için kullanılır. AdV en gelişmiş versiyonu tüm viral kodlama dizilerinin 3,4 ve böylece düşük immünojenikliğe ve düşük toksisite 5-8 ile birlikte 35 kb bir ambalajlama kapasitesi sunan yoksun yüksek kapasiteli adenovirüs vektörleri (HCAdV) ile temsil edilir. Sahip oldukları yüksek paketleme kapasitesi tek bir vektör doz kullanılarak büyük veya çok sayıda transgenlerin dağıtılmasına izin. Bu nedenle, araştırma toplum için değerli bir araç temsil etmektedir. Bunun aksine, VEC birinci veya ikinci kuşak AdV kolayca ticari kitler kullanılarak üretilebilir erken gende, E1 ve / veya E3 yoksun içintor HCAdV genomu yapımı ve virüs üretimi daha karmaşıktır. HCAdV genomlarının yapımı için sistem, bütün viral kodlayıcı sekansların ve mekik plazmidinin pHM5 9-12 yoksun bir HCAdV genomu taşıyan plazmid pAdFTC dayanmaktadır. Kadar 14 kilo bazların (kb) ilgi duyulan herhangi bir gen çoklu klonlama bölgesini tanıma ile takviye edildiği mekik vektörü pHM5 klonlanabilir / homing endonükleazlar siteleri yaran Sce I ve I-Ceu I. PI Bu nedenle, ilgi konusu bir klonlanmış genin üst üste PI Sce I ve I-I Ceu plazmid pAdFTC içinde ihtiva HCAdV genomunda bulunan, aynı restriksiyon sitlerine sonra yönlendirilmiş sokulması için digests serbest bırakılabilir. PAdFTC olarak PI Sce I ve I-CEU I sitesi yarığa arasında bulunan transgen yerleştirme sahası stuffer DNA ve 5 &#39;ve 3&#39; ters terminal tekrarları genom paketleme için gerekli kodlama yapmayan adenoviral sekansından (ITR) tarafından kuşatılırbiter ve 5&#39;ITR bölgesinin paketleme sinyaline akım aşağı hem de. Ek stuffer DNA virüs üretimi sırasında etkin bir paketleme sağlamak için 27 ile 36 kb arasında değişen nihai HCAdV genomunun en uygun boyutu sağlar. PAdFTC (sokulan transgenin boyutuna bağlı olarak) 45 kb olan büyük bir plasmid ve nispeten uzun DNA tanıma mevkileri ile homing endonükleazlar kullanım olduğu bağlanması güçlü bir DNA, çok sayıda temizlik adım pHM5 gelen transgenin transferi sırasında gerekli olan sergileyen pAdFTC için. Kesme kuvvetleri kaçınarak dikkatli kullanım tavsiye edilir. HCAdV genomunun ITRler 5&#39;ITR yukarı doğru doğrudan doğruya bulunur ve 3&#39;ITR 12 alt baş Not I sınır enzimi tanıma bölgeleri tarafından takviye edilir. Bu nedenle, HCAdV Not I HCAdV üretici hücre hattı viral genomun daha sonra transfeksiyonu için sindirimi ile serbest bırakılabilir. Not sınırlama enzimi kullanımı değil ben rel içinplazmid pAdFTC viral genomun kolaylığı eklenen transgen Not I DNA tanıma sitelerinin yoksun olduğunu gösterir. HEK293 hücre bazlı üretici hücreler (116 hücreleri) kararlı bir şekilde Cre rekombinaz ifade eder. Virüs amplifikasyonu için 116 hücre trans-3,4 replikasyon ve paketleme için gerekli olan tüm AdV genlerin temin Bir yardımcı virüs (HV) ile birlikte enfekte edilir. HV 116 hücrelerinde 4 olarak ifade edilmiştir Cre rekombinaz virüs amplifikasyonu sırasında uzaklaştırılır floxed paketleme sinyali ile bir birinci kuşak AdV olup. Bu, sağlam bir ambalaj sinyalini içeren, ağırlıklı olarak HCAdV genomları kapsül içine alınır sağlar. HCAdV Ön amplifikasyon doku kültürü çanakları içinde yüzeyler üzerinde büyümüş 116 hücreleri seri pasajlama aşamaların uygulanması ile gerçekleştirilir. Her geçiş sonrasında viral partiküller üç ardışık dondurma-eritme aşamaların uygulanması ile enfekte olmuş hücrelerden salınırlar. Hücrelerin sayısını artan her geçiş ile enfekte olanÖnceki geçit hücre lizatı 1/3. Son ön amplifikasyon aşaması, büyük ölçekli amplifikasyonu için, dönen bir şişede süspansiyon içinde yetiştirilmiş üretici hücrelerin enfeksiyonu için kullanılır son olarak lizata. Viryonlar 4,12 gradyan sezyum klorür yoğunluğunda ultrasantrifüj gerçekleştirerek süspansiyon hücrelerinden saflaştırılır. Bu prosedür ile, boş parçacıklar ve tam olarak monte parçacıkları iki farklı bantlar ayrılır. Ayrıca HCAdV konsantre ikinci bir sigara kademeli ultrasantrifügasyon adımı gerçekleştirilir parçacıklar. Daha sonra elde edilen bant HCAdV içeren toplandı ve fizyolojik tampon karşı diyaliz edilir. Nihai vektör hazırlıkları mutlak viral parçacıkların, enfeksiyöz partiküller ve HV kirlilik seviyeleri numaralarına göre karakterize edilir. Mutlak viral parçaları viral partikülleri parçalama ve 260 nm&#39;de absorbans ölçülerek ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) 12 gerçekleştirilerek belirlenebilir. Pur enfektivitesiified virüs parçacıkları enfekte olmuş hücrelerde 3 saat enfeksiyon sonrası içinde mevcut qPCR ölçüm HCAdV genomlarının belirlenebilir.

<table><tbody><tr><td>I-CeuI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0699S</td><td>kısıtlama özeti</td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td>kısıtlama özeti</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>New Engand Biolabs</td><td>M0202S</td><td>ligasyonu</td></tr><tr><td>SwaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td><td>kısıtlama özeti</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td>kısıtlama özeti</td></tr><tr><td>Buzağı Bağırsak Alkalin Fosfataz (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>sindirilmiş plazmitlerin defosforilasyonu</td></tr><tr><td>Higromisin B</td><td>PAN</td><td>Biotech P02-015</td><td>116 hücreli CRE seçimi</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Hek293T hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Minimal Esansiyel Ortam (MEM) Eagle</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-08500</td><td>116 hücre kültürü ortamı&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s fosfat tampon salin (DPBS)</td> <td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td>hücrelerin yıkanması, hücrelerin yeniden süspansiyonu</td></tr><tr><td>250 ml saklama şişesi</td><td>Sigma</td><td>CLS430281-24EA</td><td>süspansiyonda büyütülen 116 hücrenin enfeksiyonu</td></tr><tr><td>500 ml PP Santrifüj Tüpleri</td><td>Sigma</td><td>CLS431123-36EA</td><td>süspansiyon kültüründen hücrelerin sedimantasyonu</td></tr><tr><td>Spinner şişesi</td><td>Bellco</td><td>1965-61030'da</td><td>116 hücrenin büyümesi süspansiyon</td></tr><tr><td>Ultra Şeffaf Ultrasantrifüj tüpleri</td><td>Beckmann Coulter</td><td>344059</td><td>yoğunluk gradyan santrifüjleme</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>yoğunluk gradyan santrifüjleme</td></tr><tr><td>SW-41 rotor</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>yoğunluk gradyan santrifüjleme</td></tr><tr><td>Spektrum Laboratuvarları Spectrapor Membran</td><td>VWR</td><td>132129</td><td>diyaliz tüpleri</td></tr><tr><td>Kullanıma hazır diyaliz kasetleri&nbsp;</td><td>Termo</td><td>66383</td><td>diyaliz</td></tr><tr><td>tek atış DH10B elektroyetkin E. coli</td><td>invitrojen</td><td>C4040-52</td><td>ligasyon reaksiyonlarının dönüşümü</td></tr><tr><td>PureYield Plazmid Midiprep Sistemi</td><td>Promega</td><td>A2495</td><td>midiprep</td></tr><tr><td>peqGOLD Doku DNA Mini Kiti ve nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>12-3396-02</td><td>genomik DNA</td></tr><tr><td>SuperFect Transfeksiyon Reaktifinin</td><td>izolasyonu Qiagen</td><td>301305</td><td>116 hücrenin transfeksiyonu</td></tr><tr><td>opti MEM (% 10 FBS)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>116 hücrenin transfeksiyonu</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Supermix BioRad</td><td>&nbsp; 170-8882</td><td>q-PCR</td></tr><tr><td>CFX 96 C1000 dokunmatik&nbsp;</td><td>Biorad</td><td></td><td>qPCR makinesi</td></tr><tr><td>Fenol / Kloroform / İzoamil alkol &nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td>DNA</td></tr><tr><td>Sezyum klorürün</td> saflaştırılması <td>Carl Roth</td><td>8627.1</td><td>yoğunluk gradyan santrifüjleme</td></tr><tr><td>sodyum asetat %99</td> <td>Carl Roth</td><td>6773.2</td><td>DNA çökeltme</td></tr><tr><td>LB ortamı&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.3</td><td>bakteri üreme ortamı</td></tr><tr><td>etanol & nbsp;% 99.8 saf</td><td>Carl Roth</td><td>9065.5 & nbsp;</td><td>DNA çökeltme ve yıkama</td></tr><tr><td>SDS %99,5Carl</td> <td>Roth</td><td>2326.2</td><td>lizis&nbsp; tampon</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td>lizis&nbsp; tampon</td></tr><tr><td>Tris-HCl %99Carl</td> <td>Roth</td><td>9090.3</td><td>diyaliz tamponu/ lizis&nbsp; tampon</td></tr><tr><td>gliserol %99,5Carl</td> <td>Roth</td><td>3783.1</td><td>diyaliz tamponu</td></tr><tr><td>MgCl2 98.5%</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.2</td><td>diyaliz tamponu</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td>isteğe bağlı diyaliz tamponu</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td>isteğe bağlı diyaliz tamponu</td></tr><tr><td>sükroz</td><td>Carl Roth</td><td>9286.1</td><td>isteğe bağlı diyaliz tamponu</td></tr><tr><td>Na2HPO4x2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4984.2</td><td>İsteğe bağlı diyaliz tamponu</td></tr><tr><td>1.5 ml tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>72.730.005</td><td>Virüs preparatlarının -80 ° C'de saklanması; Ç</td></tr></tbody></table>

İnsan adenovirüs tip 5 dayanarak yüksek kapasiteli adenoviral vektörler klonlanması ve büyük Ölçekli Üretim

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Tüm viral kodlama dizilerinden yoksun yüksek kapasiteli adenoviral vektörler (HCAdV), yüksek paketleme kapasiteleri (35 kb'a kadar), düşük immünojenisiteleri ve düşük toksisiteleri nedeniyle en gelişmiş gen dağıtım vektörlerinden birini temsil eder. Bununla birlikte, birçok laboratuvar için HCAdV kullanımı, vektör genom yapımı ve virüs üretimi için karmaşık prosedür tarafından engellenmektedir. Burada, HCAdV genomunu içeren plazmid pAdFTC'ye dayalı olarak HCAdV'nin verimli klonlanması ve üretilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. HCAdV genomlarının inşası, hedef güdümlü endonükleazları (I-CeuI ve PI-SceI) kullanan bir klonlama vektör sistemine dayanmaktadır. 14 kb'ye kadar olan herhangi bir ilgilenilen gen, I-CeuI ve PI-SceI ile çevrili çoklu klonlama bölgesi içeren mekik vektörü pHM5'e alt klonlanabilir. Transgenin mekik vektöründen I-CeuI ve PI-SceI aracılı salınımından sonra, transgen HCAdV klonlama vektörü pAdFTC'ye yerleştirilebilir. pAdFTC plazmidinin büyük boyutu ve güçlü DNA bağlanması ile ilişkili kullanılan enzimlerin uzun tanınma bölgeleri nedeniyle, klonlama parçalarının dikkatli bir şekilde ele alınması gerekir. Virüs üretimi için, HCAdV genomu, NotI digest tarafından salınır ve Cre rekombinazı stabil bir şekilde eksprese eden HEK293 tabanlı bir üretici hücre hattına transfekte edilir. Adenovirüs amplifikasyonu için tüm adenoviral genleri sağlamak için, loxP bölgeleri ile çevrili bir paketleme sinyali içeren bir yardımcı virüs ile ko-enfeksiyon gereklidir. Vektörün ön amplifikasyonu, yüzeylerde büyütülen üretici hücrelerde gerçekleştirilir ve vektörün büyük ölçekli amplifikasyonu, süspansiyon içinde büyütülen üretici hücreleri ile döner şişelerde gerçekleştirilir. Virüs saflaştırması için, sezyum klorür gradyanlarına dayalı iki ultrasantrifüj aşaması gerçekleştirilir ve ardından diyaliz yapılır. Burada, bu HCAdV vektör sistemiyle çalışarak son yıllarda geliştirilen ipuçları, püf noktaları ve kısayollar sunulmaktadır.

Klonlama, amplifikasyon ve HCAdV preparasyonlar saflaştırılması için Burada temsili örnekleri gösterilir. Enzim restriksiyon dijest ile bir klonlama stratejisi genel (Şekil 1) ve klonlama için temsili örnekler ve HCAdV genomunun salma (Şekil 2) temin edilmiştir. Sindirimi I PI Sce I ve I-CEU tarafından pHM5 gelen GOI-sentezleme kaseti ve daha sonra fenol-kloroform ekstraksiyonu ve EtOH çökeltme serbest bırakılmasından sonra tipik bir sı...

Tüm viral kodlama dizilerinden yoksun yüksek kapasiteli adenoviral vektörlerin üretilmesi için bir protokol sunulmuştur. Vektör genomunda bulunan transgenlerin klonlanması, hedef güdümlü endonükleazlara dayanmaktadır. Yapışık hücreler olarak büyütülen ve süspansiyon halinde üretilen üretici hücrelerde virüs amplifikasyonu, trans halinde viral genler sağlayan yardımcı bir virüse dayanır.

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelere veya organizmalara terapötik transgenlerin iletilmesi ve ekspresyonu için genleri silinmiş, yüksek kapasiteli bir adenoviral vektör üretmektir. Bu yöntem, gen tedavisi alanında, diğer viral vektörlere sığmayan büyük transgenlerin iletilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yüksek kapasiteli adenovirüslerin viral genlerden yoksun olmasıdır.Bu vektörler kullanılarak 35 kb'ye kadar yabancı DNA iletilebilir. Bu tekniğin uygulaması, gen düzeltme veya gen eklemesi için terapötik girişimlerin iletilmesine yardımcı olduğu için kalıtsal hastalıkların tedavisine kadar uzanır. Bu yöntem, terapötik transgenlerin biyolojik iletimi için gelişmiş bir araç sağlar ve hem hücre kültürlerinde hem de canlı organizmalarda uygulanabilir.Vektör amplifikasyonu ve vektör saflaştırması belirli bir deneyim gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi büyük önem taşımaktadır. Vektör saflaştırma işlemi sırasında hassas bir yaklaşım sergilemek gerekir. On kat dilüe edilmiş lineerleştirilmiş yüksek kapasiteli adenovirüs genom ekspresyon plazmidinin bir alikotunu jel elektroforezi ile kontrol edin.pAd-FTC plazmit omurgası için dokuz kilobazlık bir fragman ile yüksek kapasiteli adenovirüs genomu ve ilgi alanı olan gen için 28 ila 36 kilobazlık ikinci bir DNA fragmanı saptanabilmelidir. Ardından, standart prosedürlere uygun olarak, %50 ila %80 konfluens düzeyindeki 116 hücre içeren 60 milimetrelik bir çanağa, beş mikrogram lineerize edilmiş yüksek kapasiteli adenovirüs genomu transfekte edin. Transfeksiyondan 16 ila 18 saat sonra, besiyerini dikkatlice uzaklaştırın ve üç mililitre taze besiyeri ekleyin.Ardından, hücre başına beş transduksiyon birimi uygulayarak hücreleri AdNG 163R2 yardımcı virüsü ile enfekte edin. 37 °C ve %5 CO2 koşullarında bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin. Yardımcı virüsün tüm hücrelere eşit şekilde dağılmasını sağlamak için inkübasyonun ilk saati boyunca plakayı her 20 dakikada bir çalkalayın.Enfeksiyondan 48 saat sonra, hücreleri kültür ortamı kullanarak kültür kabından yıkayarak toplayın. Genomik DNA izolasyonu için pasaj sıfır hücrelerinden 0,5 mililitrelik bir alikot ayırın. Ardından, pasaj sıfır hücrelerinin 2,5 mililitrelik bir alikotunu sıvı azota daldırarak tekrar tekrar dondurup çözdürün.Veya hücreleri -80 °C dondurucuya yerleştirip ardından 37 °C'lik bir su banyosuna 3 ila 4 kez transfer edin. 2,5 mL lizatı bir mL taze besiyeri ile karıştırın ve hücre başına iki transformasyon birimi olacak şekilde yardımcı virüs ekleyin. %90 ila %95 konfluense ulaşmış 116 hücre içeren 60 mm'lik bir kaptaki besiyerini aspire edin ve viral karışımı hücrelere ekleyin.Hücreleri daha önce olduğu gibi 48 saat boyunca inkübe edin. Ardından hücreleri hasat edin ve pasaj bir ve pasaj iki lizatlarını elde etmek için dondurma/çözme ve enfeksiyon prosedürlerini iki kez tekrarlayın. Pasaj iki lizatı elde edildikten sonra, 2,5 mililitre lizatı 17,5 mililitre taze besiyeri ile karıştırın ve hücre başına iki transformasyon birimi yardımcı virüs ekleyin.%80 ila %100 konfluensle dolmuş, 150 milimetrelik bir kapta bulunan 116 hücrelerinden medyumu aspire edin ve hücreleri viral karışımla enfekte edin. Enfeksiyondan 48 saat sonra, az önce gösterilen prosedürü kullanarak pasaj üç lizatı hasat edin. Bu adıma başlamak için, üç litrelik bir spinner kültür flaskına 900 mililitre önceden ısıtılmış medyum ekleyin.%90 ila %100 konfluense sahip, en az 10 adet ayrı 150 milimetrelik kapta bulunan 106 hücrelerinin medyasını uzaklaştırın. Ardından hücreleri 10 mililitre taze, önceden ısıtılmış medya ile yıkayın. Homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için pipetle birkaç kez yukarı ve aşağı çekin.Ardından hücreleri doğrudan spinner flask içerisine aktarın. Spinner flask'ı, bir doku kültürü inkübatöründe, manyetik karıştırıcı üzerinde 24 saat boyunca 37 °C ve %5CO2 koşullarında inkübe edin. Hücrelerin cam yüzeylere yapışmasını önlemek için manyetik karıştırıcıyı 70 RPM'e ayarlayın.Spinner kültür balonu hazırlandıktan 24 saat sonra, 500 mililitre taze ortam ekleyin. Bu adımı 24 saat sonra tekrar edin. Kültür hazırlandıktan 72 saat sonra, balona bir litre taze ortam ekleyerek toplam üç litrelik hücre süspansiyonu hacmine ulaşın.24 saat sonra, 1x10⁶ süspansiyon hücresini oda sıcaklığında 500 ×g'de on dakika boyunca santrifüjleyerek hasat edin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pelletlemi hücreleri, pipetle yaklaşık sekiz ila on kez yukarı-aşağı çekerek 150 mL besiyerinde yeniden süspanse edin. Hücreleri, steril bir manyetik karıştırıcı çubuk bulunan 250 mL'lik bir saklama şişesine aktarın.Ardından, hücreleri üçüncü pasaj lizatı ve hücre başına iki transforme eden birim yardımcı virüs ile birlikte enfekte edin. Burada toplam hücre sayısı yaklaşık 9 × 10⁸ hücredir, bu nedenle 1,8 × 10⁹ transforme eden birim eklenir. Hücre-virüs karışımını doku kültürü inkübatöründe, manyetik bir karıştırıcıyla 60 RPM hızında iki saat boyunca karıştırın.Hava sirkülasyonuna izin vermek için saklama şişesinin tamamen kapatılmadığından emin olun. Enfeksiyondan iki saat sonra, hücre-virüs karışımının toplam hacmini tekrar üç litrelik spinner kültür balonuna aktarın. 1850 mililitre taze, önceden ısıtılmış besiyeri ekleyin ve doku kültürü inkübatöründe 70 RPM'de 48 saat boyunca inkübe edin.48 saat sonra, hücre virüs süspansiyonunu 500 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Ardından, oda sıcaklığında 890 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Besiyerini uzaklaştırın ve çökelmiş hücreleri toplam 28 mililitre DPBS hacminde yeniden süspanse edin.Hücre virüs süspansiyonunu, virüs saflaştırmasına hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. Sezyum klorür gradyan saflaştırması için viral lizatı hazırlamak amacıyla, hücre virüs süspansiyonunu dört kez dondurup çözün. Ardından, viral lizatı oda sıcaklığında 500 ×g'de sekiz dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, yüksek kapasiteli adenovirüs içeren süpernatanı toplayın. Sezyum klorür çözeltilerini tüplere şu sırayla, dikkatlice ve yavaşça pipetleyin: 0,5 mililitre 1,5 g/cm³ çözelti, 3 mililitre 1,35 g/cm³ çözelti ve 3,5 mililitre 1,25 g/cm³ çözelti. 1,25 g/cm³ tabakasının üzerine yaklaşık 4,5 mililitre berraklaştırılmış vektör süpernatanı ekleyin.Yüksek kapasiteli adenovirüs genomu içeren viral partikülleri, boş partiküllerden ve hücre kalıntılarından ayırmak için gradyanları, bir ultra santrifüjde, salınımlı rotor kullanarak 12 °C'de, en az iki saat boyunca 226.000 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, tüplerin üst kısmında hücre kalıntılarından oluşan yaygın bir bant oluşur. Bunun altında iki beyaz bant gözlemlenebilir.Üst bant boş partikülleri içerirken, alt bant yüksek kapasiteli adenovirüstür. Hücre döküntüsü ve boş partikül katmanlarını dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, her tüpün alt bandından bir mililitre toplayın.Virüsü steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Toplanan virüs partiküllerine 24 mililitreye kadar 1,35 g/cm³ sezyum klorür çözeltisi ekleyin ve dikkatlice karıştırın. Santrifüj tüplerini 1,35 g/cm³ sezyum klorürlü virüs çözeltisi ile tamamen doldurun.Ardından, yavaş hızlanma ve yavaşlama ayarlarına sahip, açılır rotorlu bir ultra santrifüj kullanarak 12 °C'de 226.000 ×g'de gece boyunca santrifüjleyin. Üst katmanları bir pipet yardımıyla üstten uzaklaştırın. Son olarak, belirgin alt bantta bulunan yüksek kapasiteli adenovirüsü yeni bir pipet ucu kullanarak toplayın.Son olarak, tampon değişimi için toplanan virüs partiküllerinile diyaliz yapın. Ardından, nihai preparatı yazılı protokoldeki detaylı talimatlara göre titre edin. Bu histogram, tek bir vektör preparatı için üç farklı yöntemle belirlenen partikül sayılarını göstermektedir: optik yoğunlukla ölçülen OD titresi, enfeksiyon titresi ve qPCR ile ölçülen yardımcı virüs kontaminasyonu.Toplam enfeksiyöz, yüksek kapasiteli adenovirüs partikülleri ile qPCR ile ölçülen yardımcı virüs kontaminasyon seviyeleri arasındaki oran burada gösterilmiştir. Eğer vektörünüzde floresan bir belirteç gen mevcutsa, vektörün ön-amplifikasyonunu izlemek ve nihai vektör preparasyonunun enfeksiyözlüğünü karakterize etmek için floresan mikroskopi uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, genleri silinmiş, yüksek kapasiteli adenovirüslerin nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Özellikle transgeninizin nasıl yerleştirileceği ve vektörlerin nasıl amplifiye edilip saflaştırılacağı.

cloning-large-scale-production-high-capacity-adenoviral-vectors-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Son 15 yılda, köpek adenovirüsü tip 2 (CAV2) türevi vektörler, in vitro ve in vivo hücreleri dönüştürme etkinliklerini kanıtlamıştır ve aşılama ve gen tedavisi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, yüksek titreli viral süspansiyonlara yol açan CAV2 vektörlerini oluşturmak, üretmek ve saflaştırmak için bir prosedür açıklıyoruz.

Non Replikatif Kanin adenovirüs tip 2 türetilmiş vektörler üretimi ve saflaştırılması

Burada, bir proof-of-prensibi iki değerlikli adenovirüs tip 5 (Ad5) vektörü oluşturmak için bir protokol mevcut Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi kullanılarak. Bu vektör nitel uygunluk arzettiği gösterilmiştir, yetenek dahil antijenlere Ad5-pozitif in vitro sera'yı ve antijenikliği yanı sıra immünojenitesini kaçmak için.

Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

Burada, biz üretmek için verimli ve tekrarlanabilir bir strateji, titresi ve adeno ilişkili virüs vektörlerin kalite kontrol toplu işlemleri açıklanmaktadır. Bir vektör hazırlık ile yüksek-titresi elde etmek kullanýcýnýn (≥1 x 1013 vektör genleri/mL) ve yüksek saflıkta, vitro veya vivo içinde kullanıma hazır.

Üretim, arıtma ve kalite kontrol için virüs tabanlı vektörel çizimler Adeno ilişkili

Burada, pAdEasy sistemini kullanarak adenovirüs üretimi için bir protokol sunuyoruz. Teknoloji, pAdTrack ve pAdEasy-1 plazmidlerinin rekombinasyonunu, adenovirüs paketleme ve amplifikasyonunu, adenoviral parçacıkların hücre lysate ve kültür ortamından arındırılmasını, viral titrasyonunu ve adenovirüsün fonksiyonel testini içerir.

Adenovirüs Üretimi İçin Verimli Bir Yöntem

Burada, hücre yığınlarında yetişen yapışan HEK 293 hücrelerini ve benzeşim kromatografisi saflaştırmayı kullanarak araştırma sınıfı AAV vektörlerinin büyük ölçekli üretimi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak &gt;1 x 1013 vektör genomları /mL verir ve büyük hayvan çalışmaları için uygun vektör miktarları sağlar.

Büyük Hayvan Modellerinde Preklinik Çalışmalar İçin Hücre Yığınlarında Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Üretimi

Burada, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü sunulmakta olup, ticari satıcılardan araştırma amacıyla temin edilebilen bileşenleri kullanarak vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azaltılmasına neden olmaktadır.

HEK293 Süspansiyon Hücreleri Kullanılarak Yüksek Verimli Adeno İlişkili Vektör Partilerinin Üretimi

Gen terapisi alanı gelişmeye devam ettikçe, bu zorlukların üstesinden gelebilecek yenilikçi yöntemlere artan bir ihtiyaç var. Burada, in vivo çalışmalar için kalite standartlarını karşılayan, bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek verimli ve yüksek saflıkta AAV vektörleri üretme sürecini kolaylaştıran benzersiz bir yöntem sunulmaktadır.

Bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek titre, yüksek kaliteli adeno-ilişkili virüs vektörleri oluşturmak için kolaylaştırılmış ve standartlaştırılmış bir prosedür

Örümcek ipek ve üstün mekanik özellikleri ve biyokimyasal rağmen, bu malzeme geleneksel yollarla, büyük miktarlarda hasat edilemez. Burada nesil Biyomalzeme olarak örümcek ipeği üretimi ve kullanımı eğitimi araştırmacılar için önemli bir süreç olan yapay örümcek ipeği lifleri, spin etkili bir strateji tanımlamak.

Bir Laboratuvar Ölçekli Sentetik Örümcek İpek Üretimi

Bir iletken polimer (CP) dönüştürücü inşa All-katı hal iyon seçici elektrotlar (ASSISEs) sıvı ortamda fonksiyonel ömür boyu birkaç ay sağlar. Burada, bir laboratuar-on-a-chip biçimde ASSISEs ve imalat ve kalibrasyon süreci tanımlamak. Assise karmaşık biyolojik medyada uzun süre saklandıktan sonra yakın bir Nernst eğimi profil korumuştur için gösterilmiştir.

Fizyolojik Araştırma All-katı hal İyon seçici elektrotlar (Assise) dayanarak Çok analit Biochip (MAB)

Öğrenin, yüksek kapasiteli adenoviral vektörlerin klonlanması ve büyük ölçekli üretimini. Homing endonükleazlarla transgen klonlama ve yardımcı virüsle amplifikasyon yöntemleri gen tedavisi uygulamaları için güçlü bir araç sunar.

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

Daha fazla video keşfet