Biyolojik Sıvı Ortamda Ölçeklenebilir, Metalik Yüksek Aspect Ratio Nanokompositlerin Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, bakır içeren başlangıç materyalleri ve sistein kullanarak lineer, yüksek görünüş oranlı, mikro ve nano kompozitler üretmektir. Bu işlem, öncelikle sonike edilmiş bakır nanoparçacıkların veya bakır sülfatın, steril havalandırmalı bir kültür balonunda sistin ve su ile birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Sentezin ikinci adımı, balon içindeki birleştirilmiş bileşenlerin 37 °C'de, %5 CO2 içeren bir inkübatörde en az altı saat boyunca bekletilmesidir.

Ardından, balon gözle ve beyaz ışık mikroskobu ile incelenir. Lineer yapı oluşumunun derecesini belirlemek için son adım, sentez balonunu dört santigrat dereceye sabitlenmiş bir buzdolabına yerleştirerek sentezi sonlandırmaktır. Son olarak, sentezlenen yapıları karakterize etmek için dijital mikroskopi kullanılır. Bu tekniğin elektrot konumlandırma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sentezin sıvı formda kolayca ölçeklendirilebilmesi ve sürecin fizyolojik koşullar altında gerçekleşmesidir.

Sentezlenen yapıların hücreler tarafından yıkılabilmesi, potansiyel olarak ilaç iletimi için bir yol sağlayabileceğinden, bu tekniğin etkileri kanser gibi hastalıkların tedavisine veya teşhisine kadar uzanmaktadır. Bu yönteme dair ilk fikrim, farklı nanomalzemelerin potansiyel toksisitesini araştıran deneyler yürüttüğümüz sırada oluşmuştu. Nihai sentez basamaklarının öğrenilmesi zor olabildiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Yanlış prosedürler, agregat yapıların oluşmasına veya hiçbir yapının oluşmamasına neden olabilir. Bakır nanopartiküller veya CMP'ler kullanılarak kendi kendine montaj sentezini gerçekleştirmek için, en az iki miligram CMP tartarak bir bakır nanopartikül çözeltisi hazırlayın. CMP'lerin ciltle olası temasını önlemek için bu adım sırasında tek kullanımlık eldiven giyin.

Nanoparçacıkları, CMP'leri içeren şişeye, boş steril 16 mililitrelik bir cam şişe aracılığıyla aktarın. 2 mg/mL konsantrasyonunda bir çözelti hazırlamak için uygun hacimde steril deiyonize su ekleyin ve sentez başlamadan önce nanoparçacıkların dağılımını sağlamak için çözeltiyi 20 saniye boyunca vorteksleyin. Şişeyi yarıdan fazla suyla doldurmayın, çünkü bu durum işlemi engelleyecektir.

Vorteks ile karıştırıldığında CMP'ler hızla tüpün dibine çökecek ve koyu renkli görünecektir. Sentez başlamadan önce CMP'lerin maksimum dağılımını sağlamak için CNP çözeltisini oda sıcaklığında 17 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. CMP'lerin sonikasyon nedeniyle karıştığından emin olmak için periyodik olarak kontrol edin; başarılı bir sonikasyon sonrası CMP'ler çözeltide en az 30 dakika boyunca süspansiyon halinde kalır ve çözelti koyu renkte olur.

Sentez için 7,29 miligram sistin tartın. Sistin suda doğrudan çözünmediği için, tartılan sistini sistein içeren tartım kabına yerleştirin. Sistinin tamamen çözünmesi ve 72,9 miligram/mililitre konsantrasyonda bir çözelti elde etmek için yeterli miktarda steril 1 M sodyum hidroksit ekleyin.

Sisteini, 100 µL 1 M sodyum hidroksit içinde tamamen çözün. Ardından, çözünmüş sisteinin 7 µL'sini, steril bir sentez balonunda 6.643 µL steril su ile birleştirin. Karışımın bulunduğu balonu, etkili bir karışım sağlamak için balon kapağı havalandırılarak, 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.

Bu, sistein çalışma çözeltisi olacaktır. Toplam yedi mililitrelik sentez hacmi için, sonikasyon aşamasından sonra CMP'ler çökeceği için, mililitre başına iki miligramlık CNP çözeltisini 30 saniye boyunca vorteksleyerek yeniden süspande edin. Sistein çalışma çözeltisini 25 santimetrekarelik bir hücre kültürü flaskına aktarın ve 350 mikrolitre yeniden süspande edilmiş CMP ekleyin.

Balonun kapağını kapatın ve güvenli olduğundan emin olmak için sıkın. Sentez için gerekli tüm bileşenleri birleştirdikten sonra, balonu dört beş kez hafifçe çalkalayarak karıştırın. Balonu karbondioksit inkübatörüne yerleştirin ve balonla dış ortam arasında gaz alışverişi gerçekleşebilmesi için kapağı gevşeterek hava tahliyesi sağlayın.

Sentez sırasında, sentezin inkübatörde yaklaşık 24 saat boyunca devam etmesine izin verin. Sentez esnasında, mikroskopi ile ve gözle yüksek derecede lineer kompozitlerin oluşumu gözlemlenebilir. Bu adım, bazı yapıların oluştuğundan ve kendi kendine düzenlenme sürecinin çok uzun sürmediğinden emin olmak için kritiktir.

Balonda lineer yapılar gözlemlendiğinde, sentez balonunu sıkıca kapatarak biokompozitlerin sentezini sonlandırın; balonu, sentez ve inkübasyonun gerçekleştirildiği tarih ile sonlandırmadan önceki sentez süresi dahil olmak üzere sentez koşullarıyla etiketleyin. Ardından, oluşturulan yapılar bu formda en az bir yıl boyunca stabil kaldığından, kabı bir buzdolabında saklayın. Alternatif olarak, bakır sülfat kullanarak kendi kendine montaj sentezini gerçekleştirmek için, steril teknik kullanarak CMP'lerin yerine bakır sülfat tuzu koyun ve 2 mg/mL'lik bir çözelti hazırlamak için en az iki miligram bakır sülfatı yeterli hacimdeki steril deiyonize su içerisinde çözün.

Bakır sülfat kristalleri bu konsantrasyonda kolayca çözünür, ancak gerekirse tüpü vorteksleyin ve bakır sülfat hazırlığından sonra tüm kristallerin çözündüğünden emin olmak için gözle kontrol edin. Sentezi az önce gösterildiği gibi gerçekleştirin, ancak CMP'lerin yerine bakır sülfat kullanın. CMP'lerden ve bakır sülfattan türetilen biyokompozitleri, biyokompozitlerin karakterizasyonu ve incelenmesi için beyaz ışık mikroskobisi ve elektron mikroskobisi ile karakterize edin.

Beyaz ışık mikroskobisi ile parasyentez işlemi için ters mikroskop kullanılır. Kompozitler, balonun düz bir şekilde yatırılmasından birkaç dakika sonra balonun alt yüzeyine çökecek ve ardından odağa getirilebilecektir. Biyo kompozitler ile sıvı ortam arasındaki kontrastı maksimize etmek için mikroskoptaki parlak alan ayarı kullanın; CMP'lerden ve bakır sülfattan türetilen kompozitlerin her ikisi de şeffaftan opak renklere kadar görünecek, ancak reaksiyona girmemiş CNP agregatları çok koyu renkte görünecektir.

Belirli bir deney için sentezin etkinliğini değerlendirmek amacıyla ters beyaz ışık mikroskobu kullanın. Örneğin, sentez sırasında reaksiyona girmemiş CMP'lerin varlığını veya yokluğunu belgeleyin. İnkübasyon süresi veya sonikasyon süresi gibi farklı parametrelere sahip flasklardan elde edilen CNP türevli biyo-kompozitler için kullanılan flaskları inceleyin.

Bireysel CMP'ler ışık mikroskobuyla gözlemlenemeyecek kadar küçüktür, ancak reaktif olmayan CNP agregatları yuvarlak şeklinde ve koyu renkli nesneler olarak görünecektir. Bu durum, yüksek en-boy oranına, doğrusal forma ve farklı uzunluklara sahip olacak olan başarıyla sentezlenmiş CNP kompozitlerinin aksine bir durumdur. Sentezi sonlandırmadan önce çok uzun süre devam ettirmekten kaçının; çünkü bu, bir kez oluştuktan sonra bireysel yapılara dağıtılması zor olan, yüksek derecede dallanmış deniz kestanesi tipi yapıların oluşmasına neden olacaktır.

Ayrıca, bakır sülfat kullanılan belirli bir deney için sentezin etkinliğini değerlendirmek amacıyla ters beyaz ışık mikroskobu kullanın. Bu protokol kullanıldığında bakır sülfat tamamen çözündüğünden, çözelti sentezden elde edilen çözeltiye göre daha az koyu görünecektir. CMP'ler kullanılarak.

Sentez sonlandırma süresi gibi farklı sentez koşullarına sahip erlenleri karşılaştırarak bakır sülfat kompozitlerinin boyutunu ve kapsamını belgeleyin. Biyo kompozitleri öncelikle parasyentez ile konsantre etmek için, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne altı mililitre CNP türevli yapılar veya bakır sülfat türevli yapılar ekleyin. Daha küçük hacimler için bir pelet oluşturmak amacıyla, oda sıcaklığında 500 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüj edin.

0,6 mililitrelik tüplere 500 µL çözeltideki yapı ekleyin; bir pelet oluşturmak için oda sıcaklığında ve 2000 ×g'de en az 10 dakika santrifüjleyin. Yapıları steril deiyonize suya yerleştirin ve yeniden süspande etmek için en az 10 dakika sonikasyon uygulayın. Bu işlem zamanla tekrarlandığında, yapılar fragmente olur ve ortalama uzunlukları kısalır.

Ters beyaz ışık mikroskobu ve dijital kamera kullanarak farklı sonikasyon sürelerine göre kompozit boyutlarındaki değişiklikleri belgeleyin; hücre kültürü medyumlarındaki biyokompozitlerin keşfine dair temsilci sonuçlarımız, 82 saat boyunca CMP'lerin başlangıçtaki homojen dağılımlarının mikroyapılar şeklinde agregasyona uğradığını göstermiştir. Zamanla partiküller temizlenir ve daha büyük agregatlar oluşur. Son olarak, lineer yapılara sahip daha büyük agregatlar belirerek deniz kestanesi tipi yapılar oluşturur.

CMP'lerin doğrusal biyokompozitlere dönüşümü gösterilmiştir. CMP'ler, başlangıçtaki homojen CMP dağılımları kullanılarak sistein ve su ile birleştirilmiştir. Üç saat sonra agregatlar mikro yapılar oluştururken, altı saat itibarıyla ara yapılar oluşmuştur.

Elektron mikroskobunda yüksek en-boy oranlı yapılar oluşur. Sentezlenen biyokompozitlerin karakterizasyonu ile transmisyon elektron mikroskobisi, doğrusal kompozitlerin oluştuğu CNP başlangıç materyalini göstermektedir; başlangıç CMP'leri, taramalı elektron mikroskobisi veya SEM ile gösterildiği üzere yuvarlaktır. CMP'ler ve sistein ile oluşturulan kompozitlerin nano ve mikro özellikleri SEM ile gösterilmiştir.

Bakır sülfat ve sisteinden oluşturulan kompozitlerin özellikleri SEM Enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi ile de gösterilmiştir. Başlangıç maddelerinin ve sentezlenen doğrusal bileşenlerin elementel analizleri sunulmuştur. Başlangıç CMP'leri, kükürt içermeyen belirgin bir bakır piki göstermektedir.

CMP'lerden ve sistinden elde edilen biyo kompozitler, sistinle başlayan bakır sülfat nedeniyle kükürt ve karbon piklerinin ortaya çıktığını göstermektedir. Malzeme, bakır ve kükürt için pikler göstermektedir. Bakır sülfat ve sistinden elde edilen biyo kompozitler, sistin nedeniyle karbon piklerinin ortaya çıktığını göstermektedir. Bu teknikye hakim olunduğunda, uygun şekilde uygulandığı takdirde işlem 12 ila 24 saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, sentezlenen yapıların aşırı derecede kümelenmemesi için sentez ilerlemesini hem gözle hem de mikroskopla izlemenin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, sentezlenen yapıların hücrelere bağlanıp bağlanmadığı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla yapıların floresan işaretlenmesi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra; sentez için reaktiflerin nasıl hazırlanacağı, bunların nasıl doğru şekilde birleştirileceği, sentez ilerlemesinin nasıl izleneceği ve sentez sonrası yapıların nasıl konsantre edilip modifiye edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.