Name: İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin, insan pluripotent kök hücrelerinde transkripsiyon faktörleri aşırı ifadesiyle hemogenik endotel ve çok potansiyelli hematopoietik öncü hücrelerin etkili indüksiyonu. Bu yöntem, endotelyal-hematopoietik geçişi in vitro çalışmak için hızlı ve güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Editör yardımı için Matt Raymond'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü (U01HL099773, R01HL116221 ve P51 RR000167) ve Charlotte Geyer Vakfı'ndan sağlanan fonlarla desteklenmiştir.

1. Virüs Hazırlıklar ve Transkripsiyon Faktör Birleşmeleri <ol><li> PSIN-EF1α lentiviral sentezleme plasmidi ETV2, gata1, GATA2, TAL1 ve LMO2 (Tablo 1) için protein kodlayıcı DNA&#39;yı içeren çözelti hazırlayın. </li><li> 230 nm, 260 nm ve 280 nm&#39;de bir spektrofotometre UV absorpsiyonu kaydederek lentiviral üretimi için kullanılan plazmid preparasyonlarının konsantrasyon ve saflık ölçün. Not: 1.8 daha fazla DNA preparatları gösteren A260 / 280 ve A260 / 230 değerleri genellikle kaliteli olarak kabul edilir. Alt A260 / 230 değerleri tuzları ya da bazı çözücü gibi fenol ile kirleri işaret ederken alt A260 / 280 değerleri protein kontaminasyonu gösterebilir. Önerilen plazmid konsantrasyonu 1-3 mg / ml olduğunu. </li><li> Daha önce yayınlanmış protokollere 11&#39;de tarif edildiği gibi transdüksiyon için lentivirüsler üretir. Pan-miyeloid potansiyeli olan HE indüksiyonu ETV2 ve gata1 veya ETV2 ve GATA2 ko-ifadesini gerektirir.Eritro- ve megakaryositik potansiyeli olan HE indüksiyonu GATA2 ve TAL1 gerektirir. LMO2 ilavesi, GATA2 ve TAL1 10 mevcudiyetinde hPSCs gelen eritro-megakaryositik hücrelerin verimini geliştirir. </li></ol> 2. hPSCs Kültür Protokolü <ol><li> Alt kültüre önce% 70-80 confluency keskin kenarlı dar kolonilerde pluripotent kök hücreleri büyütün. Mark ve kaldırmak kendiliğinden hücrelerin Pasajlanması önce koloniler farklılaşmış. </li><li> Gece boyunca 4 ° C &#39;de, üreticinin talimatlarına ve kılıf 6-çukurlu plakalara göre, ticari hücre dışı matris jel (bakınız Tablo 2) ile seyreltilir, veya kullanımdan önce 37 ° C&#39; de en az bir saat karıştırıldı. Hücreleri Pasajlanması önce, matris aspire taze ticari komple culturemedium 2 ml ekleyin (bakınız Tablo 2) ve 37 plakaları tutmak ° C, hücreler kadar% 5 CO 2 tohumlama için hazırız. </li><li> Passage hPSCs <ol><li> Aspira(0.22 um filtre içinden süzme ile sterilize edilmiş DMEM / F12 içinde 2 mg / ml), bir konfluent hPSCs ile 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu ve önceden ısıtılmış Dispase II çözeltisi 1.5 mi ilave gelen te ortamı. Kolonilerin kenarları yüzeyinden kaldırılması için başlayana kadar 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 5-7 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Aspire Dispase II çözümü ve dikkatle ekleme ve sonra taze DMEM / F12 orta 2 ml aspire kez koloniler yıkayın. Daha sonra, 5 ml&#39;lik serolojik cam pipet ile, taze ticari tam kültür ortamı içinde 3 ml hPSCs ayrıştırmaları yukarı ve aşağı birkaç kez hücre süspansiyonu pipetleme (bakınız Tablo 2). </li><li> Her bir oyuğa, ticari tam kültür ortamı içinde 1.5 ml ihtiva eden bir 6-yuvalı plaka hücre süspansiyonu 0,5 ml ilave edilir (bakınız Tablo 2). Kuvöz içine plaka situating zaman homojen hücre dağılımını sağlamak için ileri ve geri ve sağa sola birkaç kez plaka çalkalayın. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 1 için hücreleri tutun8-24 saat. </li><li> Taze ticari komple kültür ortamına ertesi gün değişim ortamı (bakınız Tablo 2) ve hPSCs morfoloji inceleyin. HPSC morfoloji istinat küçük, iyi-ekli kolonilerde Başarılı Pasajlanması sonuçları. hPSCs de günlük olarak 2.5-3 ml freshmedium başı ile beslenen ve 70-80% konfluansa fazla olmayacak şekilde, her 4-5 gün geçişli olması gerekir. Not: hiPSCs fare embriyonik fibroblastlar (MEF&#39;ler) muhafaza edildi, bunlar besleyici içermeyen koşullar aktarılır ve etkin farklılaşmasını sağlamak için transdüksiyon önce 2-3 kez geçirilmiştir gerekmektedir. </li></ol></li></ol> HPSCs (gün 0, hPSCs transdüksiyonu) için Hematoendothelial Pprecursors 3. İndüksiyon <ol><li> Reaksiyon ortamı, ticari komple serumsuz ortam içinde 1.3 ml kombine hazırlamak için, virüs, polybrene ve Y27632 ROCK inhibitörü (Tablo 1) (bakınız Tablo 2): nihai konsantrasyonları 1.3 ml ortama 10 mM ROCK inhibitörü 1,3 ula bir nihai konsantrasyonu 6 ng / ml, 10 uM tion ve polibren. <ol><li> Hücre başına her virüsün 0,5-1,0 MOI değerinde bir nihai konsantrasyona (enfeksiyon çokluğu), viral bir konsantre (ler), uygun bir miktarda ekleyin. Tek bir hücre süspansiyonu hazır olana kadar buz üzerinde ya da 4 ° C &#39;de, reaksiyon ortamı tutun. Not: gata1 / ETV2, GATA2 / TAL1 bölgesindeki her bir virüs için MOI aynı miktarda ve GATA2 / TAL1 / LMO2 reaksiyon karışımları farklılaşmasının indüksiyonu için en uygunudur. ETV2 göre GATA2 için MOI katlama Ancak ETV2 in / GATA2 transduse kültürler, türev geliştirir. Bu nedenle, bu kültürlerin, oran 1: ETV2 MOI&#39;de ve GATA2 1 MOI 2 önerilir (viral konsantre, yaklaşık 6.8 x 10 7 parçacık / ml olduğu tahmin edilmektedir, eğer, ETV2 10 ul ve GATA2 viral konsantreleri 20 ul ekle örn Bir 6-plaka, 35 mm oyuk bir ETV2 / GATA2 reaksiyon başına 0,68 x 10 6 hücre). </li></ol></li><li> Tek bir hücre asmalar içinde hPSCs hazırlayınension. <ol><li> 4. günde bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi, en son geçiş aşağıdaki besleyici içermeyen koşullarda hPSCs büyümeye tersine bir mikroskop altında hücre yoğunluğu ve şekil görmekteyiz. hPSCs iletimi gününde ~% 60-70 confluency hiç kendiliğinden farklılaşma ile keskin kenarlı sıkı koloniler halinde büyür ve ulaştırılması gerekmektedir. </li><li> Kültür ortamı basınçla, oyuk başına ticari hücre ayırma reaktifi (Tablo 1) 1,5-2 ml ekleyin ve 5-7 dakika için% 5 CO2 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Ticari tam orta eşit hacimlerde içine hücreleri toplamak hücrelerin sayısı ve canlılığı belirler, ROCK inhibitörünün 10 uM (bakınız Tablo 2). Santrifüj Pelet hücreleri 5 dakika 200 x g&#39;de ve daha sonra, ml başına 3,4-5 x 10 6 hücre konsantrasyonunda ROCK inhibitörünün 10 uM ticari tam bir ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. NOT: Hücre canlılığı, başarılı bir viral transdüksiyon ve daha sonra farklılaşması için çok önemlidir.Tipik haliyle, transdüksiyon önce hücre yaşayabilirliği% 90 fazla olmalıdır. </li></ol></li><li> 3.1 hazırlanan reaksiyon ortamının 1.3 mi içine 0,68-1 x10 6 hücreleri ihtiva eden bir hücre süspansiyonu 200 ul ilave edin. </li><li> 2.2 hazırlanan gece boyunca kaplanmış 6-çukurlu plaka matrisi çözeltisi aspire., 6-çukurlu bir levhanın bir oyuğuna, reaksiyon karışımı transferi ve hücreler eşit dağıtırlar. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. 24 saat sonra hücreler en az 80% matrisine bağlı olmalıdır. </li></ol> HPSCs gelen Hematoendothelial Öncülerinin 4. indüksiyonu (Gün 1-7) <ol><li> SCF 100 ng / ml, TPO: 24 saat sonra transdüksiyonu, virüs ihtiva eden orta kaldırmak ve ticari tam olmayan hücre kültür ortamı ile bağlanmış yıkama hücreleri, hematopötik sitokinler (Tablo 1 e bakınız) ve daha sonra ticari bir tam olmayan hücre kültür ortamında oyuk ihtiva başına 3 ml ilave 50 ng / ml bFGF (bundan sonra 3F-ortam olarak adlandırılır), 20 ng / ml. </li><li> Ölü hücreleri ve enkaz kaldırmak için günde 2, 3 ve 4. günde taze 3F-orta toplam orta yerine. Yüzen hematopoietik hücreler ortaya çıkıyor zaman 4 ml toplam hacim korurken 4 gün sonra, her gün 3F-orta yarısı değiştirin. Not: pSIN-EF1α lentiviral sentezleme plasmidleri, böylece kalıt aktarımlı hücrelerin pozitif seçimi için izin puromisin direnç geni içermektedir. Puromycin 1 ug / ml herhangi bir kalıntı farklılaşmamış hPSCs ortadan kaldırmak için farklılaşma ilk 1-2 gün boyunca ortama ilave edilebilir. </li><li> Tersine bir mikroskop altında, 4. günde hücre morfolojisi dikkate alınmalıdır: tipik bir endotel morfolojisi olan hücrelerin yoğun kümeleri ortaya çıkmaya başlar (Şekil 2A, 3A). Bazı alanlarda hPSCs morfoloji tutabilir ise Yuvarlak kan hücreleri, farklılaşma günde 7 günden 5 anlaşılmaktadır. Aşağıda tarif edildiği gibi HE ve hematopoetik farklılaşma analiz edin. NOT: Başarılı hematoendothelial farklıiation gevşek yatan düz bir endotel hücrelerine bağlı olarak refraktil Yuvarlak hücreleri görünür kan hücrelerinin üretimi ile sonuçlanır. Bu hücreler, aktif ayırmak ve şamandıra (Şekil 2A ve 3A) sonunda küçük agregalar oluşturan çoğalırlar ve. Canlı kan hücreleri ışığı yansıtır ve kültür koşullarında genişletmek için kendi yeteneklerine göre ölü ve ölmekte olan hücrelerden görsel ayırt edilebilir. </li></ol> 5. Farklılaşma Hemogenic Endotel (HE) Sahne Analizi. <ol><li> Endotel morfolojisi hücrelerin mikroskobik gözlem yoluyla günde 3 ve farklılaşma 4 arasında HE oluşumunu algılar. Farklılaşma, bu aşamada kültürde yüzen kan hücreleri bulunmaktadır. HE varlığı immunofluorescent boyama ile doğrulandı ve VE-kaderin, CD73, CD226 ve CD43 antikorları kullanarak flow sitometri yöntemi olabilir. <ol><li> 3. günde akım sitometri analizi kullanımı hücreleri tarafından HE oluşumunu değerlendirmek içintek deneyden ve gün 4. Ticari hücre ayrışma reaktifi ile kültürlerin inkübe hücreleri toplamak, 37 ° C&#39;de 5-10 dakika süreyle (Tablo 1 e bakınız), daha sonra% 5 CO2 ve boyama reaksiyon başına 1 x 10 5 hücre kullanabilir (anlatılan boyama işlemi akış sitometrisi 12). NOT:-kaderin VE + HE hücrelerin erken hematopoetik işaretleyici CD226 ifadesini elde, ama CD73 ve CD43 6 ifadesini yoksundur. Tersine, HE-hücreleri CD73 (Şekil 2B, 3B) ifade etmektedir. </li></ol></li><li> HPSC türetilmiş HE için immünofloresan boyama. <ol><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hücrelerin bağlanmış tek tabaka yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika ila 60 den% 4 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit. </li><li> Yıkama Hücreler tekrar PBS ile ve daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 kullanarak Permeabilize. </li><li> Üç kez PBS, iki hücrelerin yıkayın ve daha sonra inkübe30 ila 120 dakika süre ile,% 10 cenin sığır serumu (FBS) ile PBS oluşan blokaj tamponu. </li><li> Birincil antikorlar hem de içeren, boyama çözeltisi hazırlayın (1: 1000 seyrelti) fare anti-insan CD43 ve tavşan anti-insan% 5 FBS içeren PBS içinde (Tablo 1)-kaderin. A.Ş. </li><li> Hücrelerinden engelleme tampon aspire ve ilave primer antikorlar ile lekeleme tampon maddesi içinde oyuk başına 1 ml ekleyin; Oda sıcaklığında 3 saat veya gece boyunca 4 ° C enkübe edilir. </li><li> % 5 FBS içeren PBS içinde 2 ml ekleyerek hücreler üç kez yıkayın. </li><li> 1 de sekonder antikorlar ihtiva eden, ikinci bir boyama tamponu hazırlayın: 5% FBS içeren PBS içinde 500 seyreltme: eşek, yeşil floresan boya ve kırmızı bir floresan boya (Tablo 1) ile konjuge edilmiş anti-fare ile konjüge edilmiş anti-tavşan. İkincil lekeleme tampon maddesi, oyuk başına 1 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Serum olmaksızın PBS ile üç kez yıkanır. 300 nM DAPI dH çözüm çalışma ile Leke hücreleri10-15 dakika süreyle 2 O. </li><li> PBS ile hücreler iki kez yıkayın ve içine de lekeli hücreleri ile PBS 2-3 ml ekleyin. Yeşil, kırmızı ve mavi mikroskop filtreleri ile floresan gözlemleyin. </li></ol></li></ol> Kaynaklı Hematopoetik Öncülerinin 6. Analizi <ol><li> 3.1 açıklandığı gibi yüzen hücreleri 3F-orta yarısını değiştirerek, 10-14 güne kadar, önemli ölçüde genişletmek kadar her iki günde bir, farklılaşma kültürleri korumak. </li><li> Ayrıştırmaları ticari bir hücre ayrışma reaktifi ile muamele etmek suretiyle hücrelerin hücrelerin tek tabakalarını ayırt toplamak 37 ° 5-10 dakika için (Tablo 1 e bakınız) ° C,% 5 CO2. </li><li> Kültürler 12 hematopoezisi değerlendirmek için anti-VE-kaderin, CD43 ve CD45 antikorları kullanarak flow sitometri gerçekleştirin. Kadar ETV2 ve GATA2 kalıt aktarımlı hücrelerin% 40 hücrelerinin büyük bir kısmı, eş-ifade eder VE-cad olduğu ve CD43 edin. Aşağıdaki antikorlar e, aşağıdaki spesifik hücre soyları tespit etmek için kullanılabilirXpansion veya indüklenmiş kan progenitörlerinin farklılaşması: CD235a (eritroid hücreleri), CD41a (megakaryositik), CD32 (miyeloid hücrelerin her türlü), CD66b (nötrofiller) ve CD163 (makrofajlar) vardır. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir ticari klonojenik ortamı (Tablo 1) kullanarak CFC tahlil gerçekleştirin. <ol><li> Ticari klonojenik ortamının 3 ml 2/1 x 10 4 hücreleri aktarın koloni oluşturan hücreler ve hematopoietik koloni tiplerinin sayısını belirlemek için (bakınız Tablo 3). Optimal tohum yoğunluğu birbirinden ayrı büyür ve üst üste gelmez tek koloniler tanımlanması ve izole edilmesi için izin verir. Tohum yoğunluğu farklılaşma verimliliğine bağlı olarak deneyler arasında değişebilir, ancak ticari klonojenik ortamının 1 ml&#39;si başına 1 x 10 4 hücrelerini geçmemelidir. </li><li> Yumuşak bir girdaplamadan ticari klonojenik hücrelerin ortam içinde karıştırın ve iki adet 35 mm&#39;lik çok düşük bağlanma yemekler süspansiyonun 3 ml aktarmakCFC tahlilinde, her bir çanak süspansiyonun 1.5 ml için. Eşit orta dağıtın ve 14 gün süreyle 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edilir. Yemekler rahatsız etmemek; Gün 7 ve analiz gününe 10 koloni oluşumunu görmekteyiz. </li><li> 14. günde kendi morfolojilerine göre hematopoetik koloniler tespit ve sayım. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zape, J. P., Zovein, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemogenic+endothelium%3A+origins%2C+regulation%2C+and+implications+for+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).</li>
<li>Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history+of+hemogenic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Mol+%26+Dis%22%5BJournal%5D)">A short history of hemogenic endothelium.</a> Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+and+hematopoietic+cell+fate+of+human+embryonic+stem+cells+originates+from+primitive+endothelium+with+hemangioblastic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties.</a> Immunity. 21, 31-41 (2004).</li>
<li>Rafii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ESC-derived+hemogenic+endothelial+cells+undergo+distinct+waves+of+endothelial+to+hematopoietic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition.</a> Blood. 121 (5), 770-780 (2012).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+hemogenic+endothelial+progenitor+and+its+direct+precursor+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2, 553-567 (2012).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukosialin+%28CD43%29+defines+hematopoietic+progenitors+in+human+embryonic+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures.</a> Blood. 108, 2095-2105 (2006).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+inhibition+enhances+the+generation+of+hematopoietic+progenitors+from+human+ES+cell-derived+hemogenic+endothelial+cells+using+a+stepwise+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy.</a> Cell Res. 22, 194-207 (2012).</li>
<li>Uenishi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin+C+promotes+hematoendothelial+development+and+T+lymphoid+commitment+from+human+pluripotent+stem+cells+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions.</a> Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).</li>
<li>Elcheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+induction+of+haematoendothelial+programs+in+human+pluripotent+stem+cells+by+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators.</a> Nat Commun. 5, 4372(2014).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoendothelial+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6(2007).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imgn+and+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).</li>
</ol>

IS Cynata için kurucu ortağı ve danışmanlık yapmaktadır.

TFs aşırı ifadesi ile hPSCs hematopoietik farklılaşması için yukarıda tarif edilen yöntem olup, HESC ve böylece en fazla 30 milyon kan hücrelerinin üretimini gelen izin iPSCs gelen HE ve miyeloid ve eritropent-magakaryocytic öncüller için hızlı ve etkili bir yaklaşımı temsil etmektedir Bir milyon pluripotent kök hücreleri 10. Bu yöntem, çok sayıda HESC ve iPSCs hatları 10 tutarlı farklılık sergiledi. ETV2 ve GATA2 tarafından farklılaşma sırasında gata1 faktörleri yanı sıra GATA2 ve TAL1 faktörleri,...

Kendini yenilemek ve kanda olmak üzere üç germ, hücre içine ayırt etmek, hematopoetik gelişim mekanik çalışmalar için onlara değerli bir araç yapmak, kan hastalıkları modellenmesi, ilaç taraması insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) benzersiz yeteneği, toksisite çalışmaları ve hücresel tedavilerin geliştirilmesi. Endotel hematopoetik geçiş 1,2 ile (HE) hemogenic endotel embriyo hasılatı kan oluşumu, kültürlerde HE nesil hematopoetik geçiş ve hematopoetik şartnameye endotelyal düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için gerekli olacaktır çünkü. HE çalışmaları için geçerli yöntem hematopoez destekleyici stromal hücreler 6,7 ya da hücre dışı olan iki boyutlu kültürlerde hPSCs hematopoietik sitokinlerin 3-5 ilavesi ile agrega (EBS) &#39;de hematoendothelial farklılaşmanın başlaması ve birlikte-kültür dayanmaktadır matrisler ve c8,9 ytokines. Bu, klasik yöntemler farklılaşma, hücre yüzeyinde hareket eden ve en sonunda hematoendothelial gelişimi yol transkripsiyonel program aktivasyonuna yol molekül yolların kaskadlar başlatılması harici sinyaller giriş dayanmaktadır. Bu nedenle, bu sistemlerde hPSCs farklılaşmalar etkinliği bu sinyallere etkili bir indüksiyonu, çekirdeğe sinyal iletimi, spesifik kopyalama düzenleyicilerinden oluşan elde edilen aktive edilmesine dayanır. Buna ek olarak, geleneksel bir farklılaşma kültürlerde HE çalışma hücre sıralama kullanarak HE hücrelerin izole edilmesi ek aşamasını gerektirmektedir. Burada, hematopoetik transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi ile HE ve kanın doğrudan indüksiyon için basit bir protokol açıklar. Bu yöntem, bir hantal hücre sıralama işlemi kullanılarak HE ayırmaya gerek olmadan, bir çanak ve hematopoietik geçiş endotelyal doğrudan gözlem HE etkin aşılanmasını da olanaklı kılar. Insan pluripotent kök hücrelerden HE oluşumu ve kan verimli bir kaç transkripsiyon faktörlerini (TF) aşırı eksprese eden indüklenebilir. HPSCs gelen sağlam pan-miyeloid hematopoeze indükleyebilen TFs optimal kombinasyonu ETV2 ve gata1 veya GATA2 içerir. Bunun aksine, GATA2 ve TAL1 kombinasyonu erythromegakaryocytopoiesis 10 neden olur. CD73 - - yavaş yavaş, erken hematopoietik markör CD43 7 ekspresyonu ile tanımlanan hematopoietik fenotipi edinebilir HE hücreleri bu faktörlerin aşırı ekspresyonu yoluyla hPSCs Programlama şirketinden The için hPSCs VE-cad + CD43 ayırır. İnsan pluripotent kök hücreleri, bir yöntem doğrudan programlanması için bu lentiviral bazlı yöntem mekanik çalışmalar, hematopoietik geçiş endotelyal çalışmaları ve hematopoietik gelişimi ve tarifnamenin transkripsiyonel düzenleme için olan HE ve kan hücrelerinin üretimi için de geçerlidir. C rağmeneçerli protokolü benzer sonuçlar modifiye mRNA 10 kullanılarak elde edilebilir transgenlerin bünyesel anlatımı ile, kan üretimini açıklar.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tablo 1. Dilimleme faktörleri ile hPSC farklılaşmasının indüksiyonu ve hemojenik endotel ve kan hücrelerinin analizi.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #61061</td><td>Lentiviral Vektör</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plazmid # 61063</td><td>Lentiviral Vektör</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #61062</td><td>Lentiviral Vektör</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #61062</td><td>Lentiviral Vektör</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plazmid # 61064</td><td>Lentiviral Vektör</td></tr><tr><td>Heksadimetrin bromür (Polibren)&nbsp;</td>Enfeksiyon etkinliğini artırmak için kullanılan <td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Katyonik polimer</td></tr><tr><td>Y-27632 (Dihidroklorür) ROCK inhibitörü</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td>RHO/ROCK yol inhibitörü ROCK</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Hücre Ayrışması Reaktifini</td> İnhibe Eder <td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/ stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>A11105-01</td><td>Hücre Ayrışması Reaktifi</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eksik (büyüme faktörü içermeyen) kültür ortamı&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; mTeSR1 Özel formülasyon&nbsp;</td><td>WiCell Araştırma Enstitüsü (Madison, WI)</td><td>MCF</td><td><a name="RANGE! D12 "> bFGF ve TGFb&nbsp; içermeyen serumsuz mTeSR1 ortamı; </a></td></tr><tr><td>insan SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>Birinci sınıf</td></tr><tr><td>insan TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>Araştırma sınıfı</td></tr><tr><td>insan FGF-temel</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Premium sınıf</td></tr><tr><td>CD144 (VE-cad) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>560411</td><td>Endotelyal belirteç (FACS)</td></tr><tr><td>CD226 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>338305</td><td>Hematopoietik ( FACS)</td></tr><tr><td>CD43 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560199</td><td>Hematopoietik (FACS)</td></tr><tr><td>CD73 APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5795A</td><td>Endotel belirteç (FACS)</td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555485</td><td>Hematopoietik (FACS)</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Life Technologies</td><td>A1310</td><td>Canlı/Ölü tahlil (FACS)</td></tr><tr><td>Paraformaldehit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Hücre fiksasyonu&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML&nbsp;</td><td>Geçirgenlik&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td>Fetal sığır serumu</td></tr><tr><td>Fare anti-insan CD43</td><td>BD Biosciences</td><td>551457</td><td>İmmünofloresan (IF) boyama için saf, birincil antikor</td></tr><tr><td>Tavşan anti-insan VE-cadherin</td><td>BenderMedSystem</td><td>BMS158</td><td>Birincil (IF)</td></tr><tr><td>Anti-tavşan Alexa Fluor 488-konjuge</td><td>JacksonResearch</td><td>715-486-152</td><td>İkincil (IF)</td></tr><tr><td>Anti-fare Alexa Fluor 594-konjuge</td><td>JacksonResearch</td><td>715-516-150&nbsp;</td><td>İkincil (IF)</td></tr><tr><td>DAPI nükleik asit</td> <td>boyası<a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Yaşam Teknolojileri</a></td><td>D1306&nbsp;</td><td>Canlı/Ölü tahlil (IF)</td></tr><tr><td>Klonojenik ortam MethoCult H4435 Zenginleştirilmiş</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>4435</td><td>CFC testi</td></tr><tr><td>Wright Leke çözeltisi</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>32857</td><td>Boyama sitospinleri</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 2. hPSCs culture.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan Pluripotent Kök Hücreleri (hPSCs)&nbsp;</td><td>WiCell Araştırma Enstitüsü (Madison, WI)</td><td>hESC'ler (WA01, WA09) insan Embriyonik Kök hücreleri; iPSC'ler (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgen içermeyen indüklenmiş pluripotent kök hücreler</td><td>hPSC'ler kendi kendini yenileyebilir ve üç gerg tabakasından oluşan hücrelere farklılaşabilir</td></tr><tr><td>hPSC'lerin kültürü için tam serumsuz ortam&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; mTeSR1 medya&nbsp; &nbsp;</td><td>WiCell Araştırma Enstitüsü (Madison, WI)</td><td>M500&nbsp;</td><td>Serumsuz&nbsp; besleyici içermeyen ESC / iPSC kültürü için büyüme faktörlerine sahip ortam</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biyobilimler / Corning&nbsp;</td><td>İnsan</td><td>ESC / iPSC'lerin bakımı için 356234 Matrisi</td></tr><tr><td>DMEM / F-12, toz &</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>12500-062</td><td>Bazal Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco'nun PBS tozu</td><td>Fisher Scientific</td><td>dSH30013.04</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Dispase II, powder</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>17105-041</td><td>Nötr proteaz, Hücre ayrışması</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 3. Virüs genomik entegrasyonunun tespiti için primerler.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer'ın Adı</td><td><güçlü>İleri (İleri)&nbsp; 5' -->3' </güçlü></td><td><güçlü> Ters (Rev) 5' - >3' </td><td>Discription&nbsp; </td></tr><tr><td>pSIN EF1a Fwd</td><td>TTC CAT, TTC, AGG, TGT, CGT, GA</td><td>--</td><td>EF1a, promotör dizisi</td></tr>, <tr><td>GATA1, Rev</td><td>--</td><td>TCC, CTG, ETIKET ETIKETI, GCC, AGT, GC</td><td>&nbsp; Kodlama Bölgesi&nbsp;</td></tr><tr><td>GATA2 Rev</td><td>--</td><td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td><td>&nbsp; Kodlama Bölgesi&nbsp;</td></tr><tr><td>TAL1 Rev</td><td>--</td><td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td><td>&nbsp; Kodlama Bölgesi&nbsp;</td></tr><tr><td>LMO2 Rev</td><td>--</td><td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td><td>&nbsp; Kodlama Bölgesi&nbsp;</td></tr><tr><td>ETV2 Rev</td><td>--</td><td>GAA, CTT, CTG, GGT, GCA, GTA, AC&nbsp;</td><td>&nbsp; Kodlama Bölgesi&nbsp;</td></tr></tbody></table>

İnsan pluripotent kök hücreleri transkripsiyon faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan hemogenic endotelyumunun uyarılması ve kan

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Gelişimi sırasında, hematopoietik hücreler endotel hücrelerinin özel bir alt grubundan elde edilen ortaya çıkan hemogenic endotel (HE). In vitro Modelleme HE geliştirme endotel-hematopoetik geçiş ve hematopoetik şartname mekanik çalışmalar için gereklidir. Burada, transkripsiyon faktörlerinin farklı setleri aşırı ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için HE etkin indüksiyonu için bir yöntem tarif eder. GATA2 ve TAL1 transkripsiyon faktörlerinin bir arada eritroid ve megakaryositik potansiyeli olan HE üretimine olanak sağlar ise ETV2 ve gata1 ya GATA2 TFs kombinasyonu, pan-miyeloid potansiyeli olan HE indüklemek için kullanılır. GATA2 ve TAL1 kombinasyonu LMO2 ilavesinin farklılaşmasını hızlandırır ve eritroid ve megakaryositik hücre üretimini arttırır. Bu yöntem, hPSCs gelen HE endüksiyon etkili ve hızlı bir yol sağlar ve endotelial-hematopoieti gözlem sağlarbir kültür kabı c geçişi. Protokol hPSCs transdüksiyon usul ve HE sonrası transdüksiyon analizi ve kan atalarıdır içerir.

Bir GATA2, TAL1 +/- LMO2 kombinasyonu esas olarak eritro-megakaryositik hematopoez indükler HE ve transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi ile hPSCs kan indüksiyon şematik diyagramıdır, pan-miyeloid hematopoez indükler gata1 ya GATA2 kombinasyonu ile Şekil 1 ETV2 gösterilmiştir. Hem TF kombinasyonları doğrudan sonradan hematopoetik farklılaşma farklı bir spektrumu ile kan atalarıdır dönüştürülmüştür HE hücrelerini kaynaklı. Kana pluripotent devletten hPSCs Farklılaşma HE ortalama 4 gün alır üreten. Yu...

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin zorlanmış ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücrelerinden hemojenik endotel ve multipotansiyel hematopoietik progenitörlerin verimli indüksiyonunu açıklar.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Bu prosedürün genel amacı, transkripsiyon faktörlerinin zorlanmış ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücrelerinden eritroid ve miyeloid kan hücreleri üretmektir. Bu yöntem, endotelyal-hepo geçişi ile hepo gelişimi ve spesifikasyonunun transkripsiyonel düzenlemesi üzerine yapılan çalışmalar için kan hücrelerinde homojen endotelyum üretilmesinde uygulanabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yöntemin insan preport kök hücrelerinden homojen endotelyum indüksiyonu için etkili ve hızlı bir yol sunması ve endotelyal hemmie geçişinin bir hücre kültür kabında gözlemlenmesine olanak tanımasıdır.Dr. Lin'in laboratuvarında araştırma görevlisi olan Dr. Bruske, prosedürü uygulamalı olarak gösterecektir. İşleme başlamadan önce, üretici talimatlarına göre seyrelterek ve kuyucuklara dökerek mat gel gibi bir hücre dışı matris ile altı kuyucuklu plakaları kaplayın. Transdüksiyon ortamı için plakaları 37 °C'de 30 ila 60 dakika inkübe edin. İlk olarak, virüsün hücrelere tahmini enfeksiyon çokluğu veya MOI değeri hücre başına bir virüs olacak şekilde her bir transdüksiyon seti için lentiviral alikotları hazırlayın ve bunları 4 °C'de muhafaza edin.Ardından, her bir transduksiyon seti için toplam 1,3 mL hacimde; son konsantrasyonu 6 µg/mL olacak şekilde complete serum free medium for hbsc viruses poly brain ve son konsantrasyonu 10 µM olacak şekilde rock inhibitor Y 2 7 6 3 2'yi birleştirin ve hücreleri hazırlamak için karışımları buz üzerinde bekletin. Son pasajdan yaklaşık dört gün sonra, %70 konfluense ulaşmış sağlıklı bir pluripotent kök hücre grubu ile başlayın. Eğer insan pluripotent kök hücreleri mülteci hücreler (MAPs) ile sürdürülmüşse, transduksiyon deneylerinden iki ila üç pasaj önce besleyici hücre içermeyen (feeder-free) koşullara aktarılmalı ve sağlıklı pluripotent kök hücre kültürlerini temsil etmelidir.Spontan diferansiyasyondan arındırılmış. HPSC ortamını aspire edin ve altı kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa Accutane gibi iki mililitre tuz bazlı ayırma solüsyonu ekleyip plakayı 37 °C ve %5 karbondioksitte beş ila yedi dakika inkübe edin. Ardından, 10 µM rock inhibitörü içeren iki mililitre tam ortam ekleyin ve ayrılan hücreleri toplayın.Homojen bir hücre süspansiyonu hazırladıktan sonra, küçük bir alikot alın ve canlı hücreleri Trypan blue dışlama yöntemiyle sayın. Ardından, hücreleri 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve peleti, 10 µM rok inhibitörü içeren komple ortamda, mililitre başına 3,4 × 10⁶ canlı hücre olacak nihai konsantrasyonda yeniden süspande edin. Daha sonra, 0,68 × 10⁶ hücre içeren 200 µL hücre süspansiyonunu, daha önce hazırlanan 1,3 mL'lik transdüksiyon ortamlarının her birine ekleyin.Matriks kaplı altı kuyucuklu plakayı 37 °C'den çıkarın. Ardından, matriks solüsyonunu aspire edin ve transdüksiyon karışımlarının her birini bir kuyucuğa aktarıp, hücrelerin kuyucuk içinde eşit şekilde dağılması için plakayı dairesel hareketlerle sallayın. 24 saat.Transdüksiyon sonrası, hücrelerin en az %80'inin yapıştığından emin olmak için kuyucukları mikroskop altında inceleyin. Virüs solüsyonunu boşaltın ve yapışmış hücreleri büyüme faktörü içermeyen eksik besiyeri ile yıkayın. Ardından, hücrelere sitokinlerle desteklenmiş ve "üç F besiyeri" (three F.Medium) olarak adlandırılan besiyerinden üç mililitre ekleyin.Hücreleri ertesi güne kadar gece boyunca inkübe edin. Kalan transdüksiyon yapılmamış hücreleri ortadan kaldırmak için besiyerini, mililitre başına bir mikrogram purmycin içeren taze three F besiyeri ile değiştirin.Ölü hücreleri uzaklaştırmak için bu besiyerini her 24 saatte bir yenileyin. Tedavinin 48 saatinden sonra purmycin kullanımını kesin ve dördüncü günde sadece taze three F besiyeri kullanın. Transdüksiyon sonrası, hemoendotelyal hücrelerin oluşumunu belirlemek için hücreleri mikroskop altında inceleyerek endotelyal morfolojiye sahip kümeli hücrelerin ortaya çıkışını gözlemleyin.Öncelikle, kültür kabındaki üçüncü veya dördüncü günlerdeki hücreleri hücre ayırma solüsyonu ile ilişkilendirin. Ayrılan hücreleri komple medyuma toplayın ve santrifüjleyin; hücreleri oda sıcaklığında max buffer içinde yeniden süspande edin ve bir hemositometre ile hücreleri sayın, ardından v catrin, CD 2 26, CD 73 ve CD 43 hücre yüzey belirteçlerinin saptanması için uygun antikorlarla boyama reaksiyonu başına 1 × 10⁵ hücreyi inkübe edin.Akış sitometrisi işleminin nasıl gerçekleştirileceği, dördüncü günden itibaren metin protokolünde açıklanmıştır. Transdüksiyondan sonra, her 48 saatte bir her kuyucuktaki besiyerinin yarısını değiştirerek hücrelerin farklılaşmasına devam edin; beş ila yedi gün arasında kan hücreleri gevşek kümeler halinde görünecek ve endotel hücre tabakasının üzerinde toplanacaktır. Kültürleri 14 güne kadar sürdürün; bu süre zarfında yüzen hücreler belirgin şekilde çoğalmalıdır.ETV2, GATA1 ve ETV2'nin akış sitometrik analizi. GATA2 transduksiyonu yapılmış hücreler, diferansiyasyonun üçüncü ila dördüncü gününde CD26 ekspresyonu ve CD73 ekspresyonu eksikliği ile tanımlanabilen terin pozitifB hemoendotel oluşumu göstermektedir; ETV2, GATA1 ve ETV2'nin akış sitometrik analizi. GATA2 transduksiyonu yapılmış hücreler, yedinci günde CD43 eksprese eden kan hücrelerinin indüklemesini göstermektedir.Transdüksiyon sonrası, transdüksiyondan 14 gün sonra gata2 TAL1 LMO2 indüklenmiş hücrelerin akış sitometrisi analizi, CD 235 A ve CD 41 A eksprese eden kan hücrelerinin oluşumunu göstermektedir. Gata2 TAL1 LMO2 indüklenmiş hematopoetik hücrelerin sağ boyanmış sitozin preparatları, koloni oluşturma hücre assaylerinde eritroid, makrofaj ve megakaryositik hücre morfolojileri sergilemiştir. İnsan pluripotent kök hücrelerinin transdüksiyonu, transdüksiyon prosedürü uygulanırken bir saatten kısa sürede gerçekleştirilebilir. Kök hücre canlılığını göz önünde bulundurmak için reaksiyon karışımına her zaman ROCK inhibitörü eklemek ve ilk üç günü takiben hücre başına optimal miktarda virüs kullanmak önemlidir.Transdüksiyon sonrası; farklılaşma verimliliği ve hangi hematopoetik soyun indüklendiği ile ilgili soruları yanıtlamak amacıyla immün boyama, koloni oluşturma analizi ve akış sitometrisi gibi yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, insan pluripotent kök hücrelerinin nasıl optimize edileceği ve enfekte edileceği ile farklılaşan kültürlerde ilk yedi ila 10 gün içinde nelerin beklendiği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Transkripsiyon faktörleri insan pluripotent kök hücrelerine başarıyla aktarıldıktan sonra, hücreler pluripotent özelliklerini kaybeder ve kademeli olarak hematopoetik bir kadere yönelirler.Böylece araştırmacılar, endotelyalden hematopoetik geçişin moleküler mekanizmalarını incelemek için kullanışlı bir in vitro modele sahip olacaklardır. Lentivirüs içeren bölgelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedür gerçekleştirilirken kişisel koruyucu ekipman kullanımı ve virüs içeren bölgelerin uygun şekilde imhası gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Bir yöntem de periferik kan hücrelerinden zenginleştirilen hematopoietik projenitör hücrelerinden insan nöral kök hücrelerini elde etmek için geliştirilmiştir.

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması için bir protokol öneriyoruz. Transdüksiyon kan hücrelerini santrifüjleme ile matris kaplı plakalara kaplayarak, iPSC'ler yüzen hücrelerden başarılı bir şekilde indüklenir. Bu teknik, PBMC'ler ve CBMC'ler gibi hücreler için basit ve etkili bir yeniden programlama protokolü önerir.

Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Burada, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür hPSCs CD34 ayırt etmek için kullanılan iletişim kuralları, mevcut+ hematopoetik ataları. Bu yöntem kurallı WNT ya kesin veya ilkel hematopoetik program sadece hücrelere belirtmek sinyal manipülasyon sahne özgü kullanır.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

Burada, bir besleyici ve Xeno-ücretsiz durumda insan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum tam olarak oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem hastalık modelleme ve terapötik bileşikler için tarama geniş uygulamalara sahip olacaktır.

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Bu protokol, insan dermal fibroblastlarında hemojenik bir programın hematopoetik kök ve döl hücreleri üretmek için gata2, GFI1B ve FOS transkripsiyon faktörlerinin zorunlu ekspresyonu ile indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir.

Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

Burada hemojenik endotel hücrelerinin insan pluripotent kök hücrelerinden yaklaşık 1 hafta içinde yönlendirilmiş farklılaşması için basit bir protokol sunulmaktadır.

Hemojenik Endotel Hücrelerinin İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Farklılaşması

Bu protokol, insan pluripotent ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden kendi kendini organize eden kan damarlarının oluşumunu tanımlar. Bu kan damarı ağları, perisitler, düz kas aktini ve sürekli bir bazal membran ile çevrili geniş ve bağlı bir endotel ağı sergiler.

Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Kan Damarı Organoidlerinin Üretimi

Burada açıklanan, endotel hücrelerini insan pluripotent kök hücrelerinden ayırt etmek için basit bir iş akışı ve ardından mekanik stimülasyonları için ayrıntılı bir protokoldür. Bu, endotel hücrelerinin gelişimsel mekanobiyolojisinin incelenmesine izin verir. Bu yaklaşım, mekanik stimülasyondan sonra kültür çipinden toplanan canlı hücrelerin aşağı akış testleriyle uyumludur.

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

Öğrenin, insan pluripotent kök hücrelerinde transkripsiyon faktörleri aşırı ifadesiyle hemogenik endotel ve çok potansiyelli hematopoietik öncü hücrelerin etkili indüksiyonu. Bu yöntem, endotelyal-hematopoietik geçişi in vitro çalışmak için hızlı ve güvenilir bir model sunar.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

Daha fazla video keşfet