İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin zorlanmış ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücrelerinden hemojenik endotel ve multipotansiyel hematopoietik progenitörlerin verimli indüksiyonunu açıklar.

Bu prosedürün genel amacı, transkripsiyon faktörlerinin zorla ekspresyonu ile insan pluripotent kök hücrelerinden eritroid ve miyeloid kan hücreleri üretmektir. Bu yöntem, endotelden hepoya geçiş çalışmaları ve hepo gelişimi ve spesifikasyonunun transkripsiyonel regülasyonu için kan hücrelerinde homojenojenik endotel üretimi için geçerlidir. Bu tekniğin ana avantajı, yöntemin insan raporu kök hücrelerinden verimsiz ve hızlı homojen endotel indüksiyonu araçları sağlaması ve bir hücre kültürü kabında endotelyal hemmie geçişinin gözlemlenmesine izin vermesidir.

Dr.Lin'in laboratuvarında araştırma görevlisi olan Dr.Bruske, mat, jel gibi hücre dışı bir matris ile preco altı duvar plakasını üreticinin talimatlarına göre seyrelterek ve kuyulara dökerek başlamadan önce prosedürü gösterecektir. Transdüksiyon ortamı için plakaları 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika inkübe edin. İlk olarak, her bir transdüksiyon seti için lentiviral alikotlar hazırlayın, böylece virüsün hücrelere tahmini çokluğu veya virüsün MOI'si hücre başına bir virüs olacak şekilde ayarlayın ve bunları dört santigrat derecede tutun.

Daha sonra, hbsc virüsleri poli beyin için tam serum içermeyen ortamı mililitre başına altı mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ve kaya inhibitörü Y 2 7 6 3 2'ye, her bir transdüksiyon seti için toplam 1.3 mililitre hacimde 10 mikromolar nihai konsantrasyona birleştirin ve hücreleri hazırlamak için karışımları buz üzerine ayarlayın. Son geçişten yaklaşık dört gün sonra% 70 birleşmede sağlıklı bir pluripotent kök hücre partisi ile başlayın. İnsan pluripotent kök hücreleri haritalarda tutulursa, transdüksiyon deneylerinden iki ila üç pasaj önce besleyici serbest koşullara aktarılmalı ve sağlıklı pluripotent kök hücre kültürlerini temsil etmelidir.

Spontan farklılaşmadan arındırılmış. HPSC ortamını aspire edin ve altı Kuyulu bir plakanın oyuğu başına Accutane gibi iki mililitre tuz ayırma solüsyonu ekleyin, plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte beş ila yedi dakika inkübe edin. Daha sonra 10 mikromolar kaya inhibitörü ile iki mililitre tam ortam ekleyin ve ayrılan hücreleri toplayın.

Homojen bir hücre süspansiyonu hazırladıktan sonra, küçük bir alikot alın ve canlı hücreleri Trian mavisi dışlama yöntemi ile sayın. Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin ve peleti, mililitre başına altı canlı hücreye 3.4 kez 10'luk bir nihai konsantrasyonda 10 mikromolar kaya inhibitörü ile tam ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra, daha önce hazırlanan 1.3 mililitrelik transdüksiyon ortamının her birine altı hücreye 0.68 kez 10 içeren 200 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Matris kaplı altı duvar plakasını 37 santigrat dereceden çıkarın. Daha sonra, matris çözeltisini aspire edin ve transdüksiyon karışımlarının her birini bir kuyuya aktarın ve hücreleri kuyu içinde eşit olarak dağıtmak için plakayı döndürün. 24 saat.

Transdüksiyondan sonra, hücrelerin en az% 80'inin yapıştığından emin olmak için kuyuları mikroskop altında görselleştirin. Virüs çözeltisini atın ve bağlı hücreleri herhangi bir büyüme faktörü olmadan eksik ortamla yıkayın. Daha sonra, hücrelere üç F.Medium olarak adlandırılan sitokinlerle desteklenmiş ortamın üç mililitresini ekleyin.

Hücreleri ertesi gün gece boyunca inkübe edin. Ortamı, mililitre saf misin başına bir mikrogram içeren taze üç F ortamı ile değiştirin. Artık nont transdüksiyonlu hücreleri ortadan kaldırmak için.

Ölü hücreleri çıkarmak için bu ortamı her 24 saatte bir değiştirin. Tedaviden 48 saat sonra, saf misin'i kesin ve dördüncü günde sadece taze üç F ortamı kullanın. Transdüksiyondan sonra, hemo endotel hücrelerinin oluşumunu belirlemek için endotel morfolojisine sahip kümelenmiş hücrelerin görünümü için mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin.

İlk olarak, hücreleri kültür kabından üç veya dört gün arasında hücre ayırma çözeltisi ile ilişkilendirin. Ayrılan hücreleri tam ortamda toplayın ve santrifüjleyin, hücreleri oda sıcaklığında maksimum tamponda yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemo sitometrede sayın, daha sonra v catrin, CD 2 26, CD 73 ve CD 43'ün tespiti için uygun antikorlarla boyama reaksiyonu başına 10 ila beşinci hücreyi bir kez inkübe edin. Hücre yüzeyi belirteçleri.

Akış sitometrisi gerçekleştirin, dördüncü günden itibaren metin protokolünde açıklanmıştır. Transdüksiyondan sonra, her bir oyuktan ortamın yarısını değiştirerek hücrelerin farklılaşmasına devam edin, her beş ila yedi gün arasında her 48 saatte bir, yuvarlak kan hücreleri gevşek bir şekilde toplanmış görünecek ve endotel hücre tabakasının üzerinde yeniden törpülenecektir. Kültürleri 14 güne kadar koruyun, bu süre zarfında yüzen hücrelerin önemli ölçüde genişlemesi gerekir.

ETV iki, gata bir ve ETV iki'nin akış sitometrik analizi. Gata iki transdüksiyonlu hücreler, ETV iki, gata bir ve ETV iki'nin diferansiyel akış sitometrik analizinin üçüncü ila dördüncü gününde CD 2 26 ekspresyonu ve CD 73 ekspresyonunun eksikliği ile tanımlanabilen terin pozitif hemo endotel oluşumunu gösterir. Gata iki transdüksiyonlu hücre, yedinci günde CD 43 eksprese eden kan hücrelerinin indüksiyonunu gösterir.

Transdüksiyondan sonra, transdüksiyondan sonraki 14. günde gata iki TAL bir LMO ile indüklenen iki hücrenin transdüksiyon akışı sitometrik analizi, CD 2, 35 A ve CD 41 A eksprese eden kan hücrelerinin oluşumunu gösterir gata iki TAL bir lmo ile indüklenen hematopoietik hücrelerin sağ boyalı sitozin preparatları, koloni oluşturan hücre deneylerinde eritroid, makrofaj ve mega kario asidik hücre morfolojileri gösterdi. İnsan pluripotent kök hücrelerinin transdüksiyonu, transdüksiyon prosedürü gerçekleştirilirken bir saatten daha kısa sürede yapılabilir. Kök hücre canlılığını her zaman göz önünde bulundurmak, reaksiyon karışımına kaya inhibitörü eklemek ve ilk üç günü takiben hücre başına optimal miktarda virüs kullanmak önemlidir.

Transdüksiyon sonrası, farklılaşmanın etkinliği ve hemato dease'in indüklendiği tip ile ilgili soruları yanıtlamak için immün boyama, kolon oluşturma testi ve akım sitometrisi gibi yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, insan pluripotent kök hücrelerini nasıl ize edeceğinizi ve enfekte edeceğinizi ve ilk yedi ila 10 gün içinde kültürleri farklılaştırırken neler bekleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Transkripsiyon faktörleri insan kök hücrelerine başarılı bir şekilde verildikten sonra, hücre kendi başına gücünü kaybeder ve yavaş yavaş hematopoietik bir kadere bağlanır.

Bu nedenle, araştırmacılar endotelyalden hematopoietik geçişe moleküler mekanizmaları incelemek için uygun bir in vitro modele sahip olacaklardır. Lentivirüs içeren bölgelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman giymek ve virüs içeren bölgelerin uygun şekilde imha edilmesi gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.