Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi

Bu prosedürün genel amacı, insan embriyonik böbrek 2 93 T hücrelerinde yüksek miktarda folik glikosile edilmiş ve enzimatik olarak aktif granzimler üretmektir. Bu, önce HEC 2 93 T hücrelerinin uygun doku kültürü kaplarında genişletilmesiyle gerçekleştirilir. Genişlemeden sonraki normal hazırlama boyutu 20 ila 25 kültür kabından oluşur.

İkinci adım, verimli kalsiyum fosfat yöntemi kullanılarak genişlemiş hücreleri bir granzim ekspresyon plazmidi ile geçici olarak transfekte etmektir. Daha sonra, hücre süpernatları hasat edilir ve salgılanan büyük enzimler, hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisi ile saflaştırılır. Son adımlar, kinaz tedavisine girerek büyük enzimleri aktive etmek ve proteazları katyon değişim kromatografisi ile daha da saflaştırmaktır.

Sonuç olarak, enzimatik aktivite, hızlı ve güvenilir bir chole metrik testi kullanılarak test edilir, çünkü yeterli miktarlarda aktif proteazın mevcudiyeti granzim araştırmalarında sınırlayıcı bir faktördür. Bu yöntem, farklı organizmalarda yeni hücre ölüm yollarının karakterizasyonu veya büyük enzimleri ifade etmek için tüm proteom yaklaşımlarında yeni proteaz substratlarının tanımlanması gibi alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İlk olarak, 150 x 25 milimetre doku kültürü kapları kullanarak, 20 mililitre kültür ortamında HEC 2 93 T hücrelerini büyütün, hücreleri %80 oranında ayırın Co akıcılığı hücreleri gevşek bir şekilde bağlanır, ancak plakayı yukarı ve aşağı titizlikle pipetleyerek tripsin olmadan mekanik olarak ayrılabilir.

Hücreler, transfeksiyon gününde% 60 ila% 70 oranında ko-akıcılık sağlamak için transfeksiyondan önceki gece. Normal bir hazırlama boyutu 20 ila 25 kültür kabından oluşur. Transfeksiyondan bir saat önce, standart kültür ortamını bir saatlik inkübasyon adımının sonuna yakın 20 mililitre transfeksiyon ortamına değiştirdi, 400 mikrogram plazma DNA'sını 10.95 mililitre çift damıtılmış su ve 1.55 mililitre iki molar kalsiyum klorür ile karıştırdı, transfeksiyondan bir ila iki dakika önce 50 mililitrelik tüplerde.

12.5 mililitre iki x yığınında, 30 saniye inkübe edilmeden önce tüplerin ters çevrilmesiyle karıştırılan 12.5 mililitre DNA kalsiyum çözeltisine salin tamponlayın. Oda sıcaklığında, bu karışımı, tabak başına beş mililitre olarak doğrudan hücrelere damla damla ekleyin, tüm alana eşit şekilde serpin ve ortamı hafif turuncu bir renge çevirin. Kültür kaplarını bir doku kültürü inkübatöründe yedi ila 11 saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra ince bir çökelti görülebilir. Transfeksiyon ortamını çıkarın. Ön ısıtma PBS ile dikkatlice durulayın ve bir doku kültürü inkübatöründe 72 saat inkübe etmeden önce 20 mililitre serum serbest kültür ortamı ekleyin, SDS sayfasında hücre süpernatantının bir örneğini çalıştırarak ve kumasi ile boyayarak transfeksiyon ve ekspresyon verimliliğini analiz edin.

Parlak mavi. Bir granzim bandını görselleştirmek için. İnkübasyondan sonra, hücre kültürü süpernatantlarını 250 mililitrelik tüplere boşaltın ve santrifüjleme ile temizleyin.

Ortamı ayrılmış hücrelerden temizleyecek bir ilk sıkma gerçekleştirin. Süpernatanı taze 250 mililitrelik tüplere aktarın ve kalan hücre kalıntılarını gidermek için dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 4.000 G'de döndürün. Daha sonra, beş mililitre sodyum klorür, 6.25 mililitre tris bazı ve bir mililitre nikel sülfat artı 250 mililitre temizlenmiş süpernatan ekleyin.

500 mililitrelik bir vakum filtre ünitesi kullanarak süpernatanı filtreleyin. Nikel ile hareketsizleştirilmiş bir metal iyon afinite kromatografi kolonunu bağlama tamponu ile dengeleyin. A uygun bir FPLC sistemi kullanarak.

Daha sonra temizlenmiş süpernatanı, dört santigrat derecede dakikada 0,5 mililitrelik bir akış hızında dengelenmiş kolona uygulayın. Süpernatan uygulandıktan sonra, ultraviyole veya UV emici taban çizgisine ulaşılana kadar sütunu bağlayıcı tamponu ile yıkayın. Granzimleri, iki mililitrelik fraksiyonları toplarken dakikada 0,5 mililitrelik bir akış hızında doğrusal 20 mililitre ILE gradyanı ile elute edin.

Elucian fraksiyonlarını SDS sayfası ve kumasi boyama ile analiz edin. Göz korkutucu bir tüpte fraksiyonlar içeren büyük zyme'yi çekin. Pre entero kinaz kontrolü olarak eksi 20 santigrat derecede küçük bir numune saklayın.

50 mililitre başlangıç süpernatantı başına 0.02 birimde entero kinazı doğrudan diyaliz tüpündeki havuzlanmış fraksiyona ekleyin ve entero kinaz tamponunda oda sıcaklığında gece boyunca diyalize edin. Ertesi gün, SDS sayfası ve kumasi mavisi boyama ile pre enterer kinaz kontrolüne kıyasla büyük tedavi edilen kinazı analiz edin. Uç terminal işlemi tamamlandığında.

Diyaliz tamponunu S tamponu A olarak değiştirin ve DIALATE eight'i filtrelemeden önce oda sıcaklığında dört saat daha diyalize girin. Ardından, bir S sütununu S tamponu ile dengeleyin. A. Numune yüklemeden sonra numuneyi dört santigrat derecede dakikada 0,5 mililitre akış hızında sütuna yükleyin.

UV emici taban çizgisine ulaşılana kadar sütunu S tamponu A ile yıkayın. Granzimleri 30 mililitrelik doğrusal sodyum klorür gradyanı ile güçlendirin, granzim A yaklaşık 650 milimolar sodyum klorürde, granzim B'de yaklaşık 700 milimolar sodyum klorürde ve granzim M yaklaşık 750 milimolar sodyum klorürde elutes. Granzim içeren fraksiyonları bir araya getirin ve sıkma filtrelerinde yaklaşık 100 mikromolar kadar konsantre edin, konsantre granzim preparatlarını ayırın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Daha sonra, elucian fraksiyonlarını SDS sayfasına göre analiz edin ve chole metrik tahlillerini gerçekleştirmek için chole metrik tahlillerini gerçekleştirin, ellucian fraksiyonlarından veya konsantre stoklardan küçük granzim örneklerini 96'da dağıtın. Düz tabanlı plakalar, pozitif bir kontrol ve negatif bir kontrol içerir. Her birine 100 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin.

Plakayı 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Son olarak, bir mikroplaka okuyucuda optik yoğunluğu 405 nanometrede ölçün. Bu protokol, S sütunundan granzim BE'yi gösteren bu temsili kumasi lekeli SDS sayfa jelinde gösterildiği gibi yüksek saf granül verimi üretecektir.

Rekombinant granzimler, rekombinant ve doğal granzim B aktivitesini karşılaştıran bu renk metrik testinde gösterildiği gibi, doğal proteaz preparatları ile benzer aktivite gösterir. Daha da önemlisi, endo H tedavisi, HEC 2 93 T hücrelerinde üretilen granülimlerin tamamen glikosile olduğunu gösterir. Rekombinant büyük enzimler, bu temsili granzimde gösterildiği gibi, makromoleküler protein substratlarını parçalayabilir, bakteriyel protein substratı ve UOCD kullanan bir bölünme testi.

Burada, parçalanmış N-O-U-C-D'yi temsil eden bant, artan granzim konsantrasyonu ile yavaş yavaş kaybolur. Bu videoyu izledikten sonra, HK 2 93 T hücrelerinde yüksek verimlerde tamamen glikosile edilmiş ve proaktif büyük enzimlerin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.