Name: Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Öğrenin, HEK293T hücrelerinde yüksek verimli ve maliyet-etkin granzim ifade sistemi ile tam glikozillenmiş, enzimatik olarak aktif proteazların üretimini. Bu yöntem immün yanıt araştırmalarını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Novartis Tıbbi-Biyolojik Araştırma Vakfı ve Fribourg Üniversitesi Araştırma Havuzu'ndan (MW'ye) alınan hibelerle desteklenmiştir. Teknik destek için Li Zhao, Zhan Xu ve Solange Kharoubi Hess'e, pHLsec plazmidini sağladıkları için Radu Aricescu ve Yvonne Jones'a (Oxford Üniversitesi, İngiltere) ve yararlı tartışmalar için Thomas Schürpf'e (Harvard Tıp Okulu) teşekkür ederiz.

Sentezleme plasmidi pHLsec-Gzm 1. Üretim <ol><li> Insan NK hücrelerinden manufacturer` izlenerek uygun bir RNA izolasyon yöntemi ile ve bir birinci tür cDNA sentez kiti kullanılarak ters transkribe (26 ya da beş, insan Gzms ifade NK hücre hattı NK-92 gibi hazırlanmıştır birincil hücreler) ve toplam RNA&#39;nın hazırlanması s önerileri. 23 (Radu Aricescu Yvonne Jones, Oxford Üniversitesi, İngiltere tür bir hediye) &#39;de tarif edildiği gibi Gzm cDNA Agel ve Kpnl sitesi (Şekil 1) kullanılarak pHLsec PCR ve klon kullanılarak yükseltin. Not: Tablo 1 &#39;de gösterilen aşağıdaki primerler kullanın. </li><li> Dizileme ile doğru ekler onaylayın. DH5α hücrelerinde ifade plasmidlerini genişletin ve bir endotoksin içermeyen plazmid izolasyon kiti kullanılarak arındırmak ve üreticinin talimatlarına uyun. </li><li> Unti -20 ° C &#39;de 2 mg / ml ve saklamak bir konsantrasyonda endotoksin içermeyen, steril su içinde yeniden süspanse edilen saflaştırılmış plasmidler,l kullanımı. </li></ol> HEK293T hücrelerinde Gzms 2. İfade <ol><li> Reaktiflerin hazırlanması <ol><li> Standart kültür ortamı hazırlayın. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içeren, yüksek glikoz (25 mM), Glutamax (4 mM), sodyum piruvat (1 mM) (standart fetal buzağı serumu (FCS), penisilin (100 birim / ml), streptomisin ve% 10 ilave 100 ug / ml). </li><li> Transfeksiyon ortamı hazırlayın. Penisilin-Streptomisin olmayan kültür ortamına 25 ug / ml miktarında klorokuin katılımının (-20 ° C&#39;de saklanan PBS 1,000x hisse senetleri, gelen transfeksiyon gününde taze olarak ilave) ekleyin. </li><li> Serumsuz kültür ortamı hazırlayın: serumsuz ortam için HEK293 hücreleri glutamin (4 mM), penisilin (100 birim / ml), streptomisin (100 ug / ml) ve 2,5 mg / L amfoterisin B add </li><li> Kullanmadan önce, bir 0.45 um filtre ile Tablo 2 ve filtre açıklanan çözümler hazırlayın: </li></ol></li><li> HEK293T hücreleri genişletme <ol><li> 20 ml kült HEK293T hücreleri büyütün150 x 25 mm doku kültürü yemekleri kullanarak ure orta. </li><li> % 80 confluency Split hücreleri (1 split oranı: 4, genellikle her 3. gün). Hücreler gevşek mekanik olarak titizlikle yukarı ve aşağı pipetleme tripsinleme olmadan ayrılabilir, ekleyin. </li><li> Levha hücreleri, transfeksiyondan önceki gece transfeksiyonu (tohum ekme yoğunluğu ~ 2 x 10 5 hücre / ml) günde% 60-70 konfluense elde edildi. Bir zamanki hazırlık boyutu 20-25 kültür kaplarına oluşmaktadır. </li></ol></li><li> Kalsiyum-fosfat transfeksiyonu <ol><li> Transfeksiyondan önce 1 saat, 20 ml transfeksiyon ortamı, standart kültür ortamı değiştirin. Bu 1 saat inkübasyon aşamasının sonuna doğru, 10.95 mi GKD 2 0 ve 50 ml tüpler içinde 2M CaCl2 1.55 ml (1 tüp / 5 yemekler) ile plazmid DNA, 400 ug karıştırın. </li><li> 1 transfeksiyondan önce, en az 2, DNA-kalsiyum çözeltisinin 12.5 ml 12.5 mi 2x HBS ekleyin tüpler ters çevirme ile karıştırın ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca inkübe edilir. </li><li> Th ekleE karışımı doğrudan hücreleri (tabak başına 5 mi), damla damla ortama 2.3.2 hazırlandı. Biraz turuncu renk orta dönüm tüm alana eşit serpin. </li><li> Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 7-11 saat (37 ° C,% 5 nemlendirilmiş hava içinde CO2) için kültür kaplarına inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ince bir çökelti görülebilir. Önceden ısıtılmış PBS ile dikkatle yıkayın, transfeksiyon Ortamı çıkarın ve 2.1.3 hazırlanmış 20 mi serumsuz kültür ortamı ilave edin. Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 72 saat süreyle inkübe edilir. </li><li> SDS-PAGE üzerinde hücre yüzer bir numunesi (~ 20 ul) çalışan ve bir granzim bant görselleştirmek için Coomassie Brillant Blue ile soylara ile transfeksiyonu ve ekspresyonudur etkinliğini analiz edin. </li></ol></li><li> Nikel IMAC ile kültür süpernatanından Gzms saflaştırılması <ol><li> Kuluçkadan sonra, 250 ml tüpler içine hücre kültürü süpernatanları süzün ve santrifüj ile temiz. İlk bir spin yürütmek (400 xg, 10 dak, 4 °Müstakil hücrelerden orta silinir C). Kalan hücre debrisini uzaklaştırmak için 4 ° C sıcaklıkta 4000 x g&#39;de, 30 dakika taze 250 ml tüpler ve spin süpernatant aktarın. </li><li> 5 M NaCl 5 mi, temizlenmiş süpernatan, 250 ml başına 0.25 M N&#39;nin 4 6,25 2 M Tris-Base (pH 8) içinde çözdürülür ve 1 ml ilave edilir. 500 ml Vakum filtre ünitesi (0.45 mm) kullanılarak süpernatant süzün. </li><li> Uygun bir FPLC sistemi kullanılarak His-bağlama tamponu A (10 kolon hacim, CV) bir nikel-IMAC sütunu dengelenmesi. </li><li> 4 ° C de, 0.5 ml / dk&#39;lık bir akış oranında dengelenen kolona süpernatant uygulanır. </li><li> Süpernatan tatbik edilmesinden sonra UV emilimi temel (genellikle 10 CV) ulaşana kadar, His-bağlama tamponu ile kolondan yıkanır. </li><li> Elute Gzms 0.5 ml bir akış hızında doğrusal bir 20 ml&#39;lik gradyanı (0-250 mM imidazol) ile 2 ml / dakika-fraksiyonlar toplanırken. SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile elüsyon fraksiyonları analiz edin. </li></ol></li><li> Enterokinaz (EK)işleme ve katyon değişim kromatografisi ile son temizlik <ol><li> ≤10 MWCO bir dializ tüpü içinde kısımlar içeren havuz Gzm. Ön-EK kontrol olarak -20 ° C&#39;de küçük bir örnek saklayın. </li><li> Diyaliz tüpü içinde doğrudan toplanmış fraksiyonuna 0.02 birim / ilk süpernatan 50 ml EK ekleyin ve O / N EK-tampon maddesi içinde oda sıcaklığında (en az 16 saat) (4 L, bir kez değiştirme tamponu) diyaliz. </li><li> Ertesi gün, EK, SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile ön-EK kontrol ile karşılaştırıldığında Gzms tedavi analiz eder. </li><li> N-terminal işlem tamamlandığında, bir (4 L) tampon S diyaliz tamponu değiştirmek ve oda sıcaklığında bir 4 saat diyaliz. Filtre diyalizat (0.45 mikron). </li><li> 4 ° C de, 0.5 ml / dk&#39;lık bir akış oranında sütunun üzerinde örnek kuvveti S tampon maddesi A ile S-sütunu dengelenmesi. </li><li> UV absorbans taban (10 CV) ulaşılana kadar numunesi yüklemesinden sonra, S tampon A ile bir sütun yıkayın. 30 mi lineer gradyan (150 ila 1000 mM NaCI) ile Gzms yıkayın. GzmA E~ 750 mM NaCl&#39;de ~ 700 mM NaCI ve GzmM de ~ 650 mM NaCI, GzmB de dolgu maddeleri. </li><li> SDS-PAGE ve kolorimetrik analizler (aşağıya bakınız) ile elüsyon fraksiyonları analiz edin. Gzms ve konsantre içeren havuz kısımlar (yaklaşık 30 kat, 100 uM bir konsantrasyona kadar), eğirme filtresi (15 mi, 10 MWCO). -80 ° C &#39;de konsantre edilir Gzm preparatlar ve mağaza kısım. </li></ol></li></ol> 3. Test Gzm etkinliği <ol><li> Reaktiflerin hazırlanması <ol><li> 50 mM Tris-Base, pH 7: kolorimetrik deney tamponu hazırlayın. <ol><li> GzmA ölçülmesi için, 0.2 mM ve 5,5&#39;-ditiyo-bis (2-nitrobenzoik asit) &#39;in bir nihai konsantrasyona kadar deney tamponu Na-CBZ-L-lisin tiyobenzil ester (S-Bzl) (BLT) ekleyin 0.22 mM bir konsantrasyona kadar (DTNB). GzmB için, 0.2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) ve 0.22 mM DTNB bulunmaktadır. GzmM için, 0.2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilid (pNA) (AAPL) içerir. Sentetik peptidler DMSO içinde (uygun ana çözeltilerden ilave edilmiştir, stored taze tahlil önce tampon -20 ° C). </li></ol></li><li> Klivaj deneyi tamponu hazırlayın: 100 mM NaCI, 50 mM Tris-baz, pH 7.5 </li></ol></li><li> Kolorimetrik analizler <ol><li> 96-gözlü düz dipli plakalarda elüsyon fraksiyonları küçük Gzm örnekleri (&lt;5 ul) veya konsantre stok dağıtın. Bir pozitif kontrol (test edilen Gzm müstahzarlar ya da ham olarak NK hücre lizatları) ve bir negatif kontrol (sadece tampon) içerir. </li><li> (Bir çok kanallı pipet kullanarak) her bir oyuğa, deney tamponu içinde 100 ul ekle. 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin. Mikroplaka okuyucu içinde 405 nm&#39;de OD&#39;yi ölçün. </li></ol></li><li> Klivaj deneyi <ol><li> Seri seyreltme ile; - saflaştırılmış maddeleri kullanarak bölünme tahlilleri için, (verimli Gzm yüzeylerde birkaç örnek bu bölümün sonundaki sonuç bölümünde ve notta sunulmuştur 400 nM doğal veya rekombinant, 100) bir protein substrat ko-inkübe Bir GZM çeşitli kez deney tamponu (400 nM&#39;de başlayarak).SDS-PAGE ve Coomassie ya da gümüş lekeleme ile analiz; ya da Batı spesifik antikorlar kullanılarak kurutma. </li><li> Hücre lizatları kullanılarak klivaj deneyleri için, 37 ° C olmak üzere üç kez, bir etanol / kuru buz banyosunda ve eritme dondurma ile deney tamponu ve parçalanmasıyla, 1 ml, 10 6 HeLa hücreleri (ya da herhangi bir uygun tümör hücre hattı) askıya. (4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 15,000 x g) santrifüj uygulanarak hücre kalıntıları uzaklaştırılmıştır. </li><li> Yukarıdaki gibi çeşitli konsantrasyonlarda ve zaman zaman Gzms ile temizlenir lizat Co-kuluçkaya yatmaktadır. Yarılma uygun antikorlar kullanılarak imünolekeleme ile tespit edilir. Not: iyi niyetli alt tabakalar bir kaç örnekleri ticari antikorlar mevcuttur: Teklif (BH3 etkileşen etki ölüm agonisti) ve GzmB 27,28 parçalanabilen kaspaz 3; GzmA 29 ile parçalanabilen çok heterojen bir çekirdek ribonükleoprotein (hnRNPA1, A2 ve U); GzmM 30 ile sitomegalovirüs phosphoprotein 71. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Chowdhury, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+by+a+thousand+cuts%3A+granzyme+pathways+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death.</a> Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).</li>
<li>Thiery, J., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin%3A+a+key+pore-forming+protein+for+immune+control+of+viruses+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer.</a> Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).</li>
<li>Krensky, A. M., Clayberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+clinical+relevance+of+granulysin%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Biology and clinical relevance of granulysin.</a> Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).</li>
<li>Bovenschen, N., Kummer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+granzymes+find+a+home%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Orphan granzymes find a home.</a> Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).</li>
<li>Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+A+activates+another+way+to+die%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Granzyme A activates another way to die.</a> Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).</li>
<li>Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quarter+century+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">A quarter century of granzymes.</a> Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).</li>
<li>Hiebert, P. R., Granville, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+in+injury%2C+inflammation%2C+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Granzyme B in injury, inflammation, and repair.</a> Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).</li>
<li>Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+and+non-cytotoxic+roles+of+the+CTL%2FNK+protease+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme.</a> B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).</li>
<li>Walch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cells+kill+intracellular+bacteria+through+granulysin-mediated+delivery+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes.</a> Cell. 157, 1309-1323 (2014).</li>
<li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells+act+as+an+extravascular+cytotoxic+barrier+for+joint-invading+Lyme+Borrelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).</li>
<li>Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimalarial+activity+of+granzyme+B+and+its+targeted+delivery+by+a+granzyme+B-scFv+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2014).</li>
<li>Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cytotoxic+T+cell+and+NK+granules+and+purification+of+their+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).</li>
<li>Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+use+of+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and use of granzyme B.</a> Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).</li>
<li>Masson, D., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+serine+esterases+in+lytic+granules+of+cytolytic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes.</a> Cell. 49, 679-685 (1987).</li>
<li>Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+refolding%2C+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B.</a> Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B+from+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris.</a> Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+enzymatically+active+recombinant+granzyme+B+in+a+baculovirus+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system.</a> Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).</li>
<li>Stahnke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-H22%28scFv%29%2C+a+human+immunotoxin+targeting+CD64+in+acute+myeloid+leukemia+of+monocytic+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes.</a> Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).</li>
<li>Gehrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+expression+and+purification+system+for+the+production+of+enzymatic+and+biologically+active+human+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme.</a> B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).</li>
<li>Metkar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cell+granule-mediated+apoptosis%3A+perforin+delivers+granzyme+B-serglycin+complexes+into+target+cells+without+plasma+membrane+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation.</a> Immunity. 16, 417-428 (2002).</li>
<li>Motyka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mannose+6-phosphate%2Finsulin-like+growth+factor+II+receptor+is+a+death+receptor+for+granzyme+B+during+cytotoxic+T+cell-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis.</a> Cell. 103, 491-500 (2000).</li>
<li>Pinkoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+and+trafficking+of+granzyme+B+in+target+cells+during+granzyme+B-perforin-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis.</a> Blood. 92, 1044-1054 (1998).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Fukuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+assays+of+nine+heterogeneous+promoters+in+neural+and+other+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).</li>
<li>Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptidyl+peptidase+I%3A+importance+of+progranzyme+activation+sequences%2C+other+dipeptide+sequences%2C+and+the+N-terminal+amino+group+of+synthetic+substrates+for+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity.</a> Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+purification%2C+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Barry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+short-circuits+the+need+for+caspase+8+activity+during+granule-mediated+cytotoxic+T-lymphocyte+killing+by+directly+cleaving+Bid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid.</a> Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).</li>
<li>Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+apoptotic+protease+CPP32+by+cytotoxic+T-cell-derived+granzyme+B.+%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. </a> Nature. 377, 446-448 (1995).</li>
<li>Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+RNA+processing+during+immune-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).</li>
<li>Domselaar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncytotoxic+inhibition+of+cytomegalovirus+replication+through+NK+cell+protease+granzyme+M-mediated+cleavage+of+viral+phosphoprotein+71%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71.</a> J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+activates+clathrin-+and+dynamin-dependent+endocytosis%2C+which+is+required+for+plasma+membrane+repair+and+delivery+of+granzyme+B+for+granzyme-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis.</a> Blood. 115, 1582-1593 (2010).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+pores+in+the+endosomal+membrane+trigger+the+release+of+endocytosed+granzyme+B+into+the+cytosol+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells.</a> Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).</li>
<li>Thomas, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+protease+binding+to+nucleic+acids+promotes+nuclear+localization+and+cleavage+of+nucleic+acid+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins.</a> J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).</li>
<li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-induced+mitochondrial+ROS+are+required+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis.</a> Cell death and differentiation. , (2014).</li>
<li>Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+recombinant+granzyme+A+zymogen+and+its+activation+by+the+cysteine+proteinase+cathepsin+C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).</li>
<li>Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+that+specifically+measures+Granzyme+B+proteolytic+activity%3A+hydrolysis+of+Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).</li>
<li>Huang, M. T., Gorman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervening+sequences+increase+efficiency+of+RNA+3%27+processing+and+accumulation+of+cytoplasmic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA.</a> Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).</li>
<li>Luthman, H., Magnusson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+polyoma+DNA+transfection+of+chloroquine+treated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).</li>
<li>Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+one-stage+method+for+assay+of+enterokinase+activity+by+release+of+radiolabelled+activation+peptides+from+alpha-N-%5B3H%5Dacetyl-trypsinogen+and+the+effect+of+calcium+ions+on+the+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity.</a> Biochem J. 197, 239-244 (1981).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

GzmA ve GzmB klasik ve yaygın olarak çalışılan bir rol gözenek oluşturucu protein PFN 1 kendi sitosolik doğumdan sonra memeli hücrelerinde apoptosisin olduğu. Son zamanlarda, Gzms sitotoksik spektrumu bakteri 9,10, ve de bazı parazitler 11 için memeli hücrelerinden önemli ölçüde genişletildi. Ayrıca, GzmA ve GzmB olmayan klasik, hücre dışı fonksiyonları yanı sıra çeşitli yetim Gzms biyolojik önemi hala karanlıktır. Bu protokol tarafından sağlanan nedenle, Gzms sağlam zaman ve maliyet-etk...

Gzms özel CTL lizozomlar ve NK hücrelerinin 1 lokalize yüksek ölçüde homolog serin proteaz ailesidir. Bu katil hücreler ve sitotoksik zerreler, aynı zamanda ortadan kaldırılması 2,3 için olan bir hedef hücrenin tanınması üzerine Gzms ile eşzamanlı olarak serbest bırakılır membran kesintiye proteinleri PFN ve GNLY içerir. (- G, K, M ve N GzmA), insanlarda (GzmA, B, H, K ve M,), beş Gzms ve farelerde 10 Gzms vardır. GzmA ve GzmB en bol ve yaygın insan ve farelerde 1 çalışılmıştır bulunmaktadır. Ancak, daha yeni çalışmalar hücre ölümü yollar yanı sıra sağlık ve hastalık 4 diğer, sözde yetim Gzms aracılık ettiği ek biyolojik etkilerini araştırmak başladı. PFN 5,6 hedef hücrelere verilebilir olduğunda Gzms en iyi bilinen işlevi, GzmA ve GzmB, özellikle de memeli hücrelerinde programlanmış hücre ölümü meydana gelmesidir. AncakDaha yeni çalışmalar da PFN 7,8 bağımsız Sitozolik teslimat, bağışıklık düzenleme ve inflamasyon üzerinde derin etkisi olan Gzms dışı etkilerini göstermiştir. Gzms sitozolik girmesinden sonra verimli öldürüldüğü hücrelerin spektrumu yakın zamanda bakterilerin 9,10 ve hatta bazı parazitler 11 memeli hücrelerinden genişletilmiştir. Bu yeni keşifler Gzm araştırmacılar için yepyeni bir alan açtı. Bu nedenle, maliyet-etkin, yüksek verim memeli sentezleme sistemi önemli ölçüde o gelecek çalışmalar için yol kolaylaştıracaktır. Ana insan, fare ve sıçan Gzms başarılı bir CTL ve NK hücre hatları 12-14 granül fraksiyonundan saflaştırılmıştır. Bununla birlikte, elimizdeki tür saflaştırma tekniklerinin verimi daha az, 0.1 mg / L hücre kültürü (yayınlanmamış gözlem ve 12) aralığındadır. Bundan başka, tasarımlarıyla ile kirlenme olmadan, tek bir GZM kromatografik çözünürlüğür Gzms ve / veya granül halinde de mevcut proteinler (yayınlanmamış veriler ve 12,14) meydan okuyor. Rekombinant Gzms hatta HEK 293 18,19 gibi memeli hücrelerinde bakteriler 15, maya 16, böcek hücreleri 17 ve üretildi. Sadece, memeli ekspresyon sistemleri nativ sitotoksik protein aynı translasyon sonrası modifikasyonlar ile, rekombinan enzimler meydana potansiyeli taşımaktadır. Posttranslasyonel değişiklikler endositoz belirli alımı ve hedef hücrelerin 20-22 içinde proteaz hücre içi lokalizasyonu ile suçlanmıştır. Bu nedenle, pHLsec 23 kullanılarak Gzm ifade plazmid omurgası olarak (Radu Aricescu ve Yvonne Jones, Oxford, UK Üniversitesi bir tür hediye), biz yüksek verim protein üretimi için basit, zaman ve maliyet-etkin bir sistem kurdu HEK293T hücreleri. pHLsec tavuk Β-aktin promoteri ile bir CMV artırıcı birleştirir; Birlikte, bu elemanlar gösterilerted çeşitli hücre hatlarında 24 güçlü promotör aktivitesi. Buna ek olarak, plazmid, bir tavşan Β-globin intronu, optimize edilmiş bir Kozak ve sekresyon sinyalleri, bir Lys-6xHis-tag ve bir poli-A sinyali içerir. Uçlar sekresyon sinyali ve uygun N-terminal etki alanları yoksun proteinler için uygun bir ifade ve sekresyon etkinliğin sağlanması Lys-6xHis etiketi (Şekil 1) arasında uygun bir klonlanabilir. Gzms ekspresyonu sağlamak için, böylece EK tedavisi salgılanan Gzms (aktif Gzms N-terminali ile başlayan aktive bir enterokinaz (EK) Alanı (DDDDK) ve ardından vektör tarafından sağlanan salgılama sinyal ile endojen salgılama sinyal dizisi yerine amino asit sekansı IIGG 25). Buna ek olarak, bu yöntem için lehine HEK293T hücreleri, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) gibi düşük fiyatlı bir ortam içinde hızlı bir şekilde büyümesi ve maliyet-etkin bir kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi için de uygundur.

<table><tbody><tr><td>TRIzol Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Toplam RNA izolasyon kiti</td></tr><tr><td>SuperScript II Ters Transkriptaz</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plazmid Maxi Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 293 HEK 293 Hücreleri için Serumsuz Ortam</td><td>Sigma</td><td>14571C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX Takviyesi, piruvat</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Diyaliz Tüpü, 10K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>sığır bağırsağından enterokinaz</td><td>Sigma</td><td>E4906</td><td>rekombinant, & 20&nbşk; birim/mg protein</td></tr><tr><td>HisTrap Excel 5 ml sütun</td><td>GE Healthcare</td><td>17-3712-06&nbsp;</td><td>Nikel IMAC</td></tr><tr><td>HiTrap SP HP 5 ml kolon</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1152-01&nbsp;</td><td>S sütunu</td></tr><tr><td>N-&alfa;-Cbz-L-lizin tiyobenzilester (BLT)</td><td>Sigma</td><td>C3647</td><td>GzmA substratı</td></tr><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)</td><td>MP Biyomedikal</td><td>2193608 _10mg</td><td>GzmB substratı</td></tr><tr><td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilid (AAPL)</td><td>Bachem</td><td></td><td>GzmM substratı</td></tr><tr><td>5,5&prime;-dithio-bis(2-nitrobenzoik asit) (DTNB)</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td>Ellman'ın reaktifi</td></tr></tbody></table>

memeli hücrelerinde İnsan granzymes bir yüksek verimli ve maliyet-etkin İfade sistemi

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

Sitotoksik T lenfositler (CTL) veya doğal öldürücü (NK) hücreler, tümör hücrelerini veya hücre içi patojenlerle enfekte olmuş hücreleri tanıdığında, hedef hücreleri ve hücre içi patojeni ortadan kaldırmak için sitotoksik granül içeriğini serbest bırakırlar. Konak hücrelerin ve hücre içi patojenlerin ölümü, gözenek oluşturan protein perforin (PFN) tarafından konak hücre sitozolüne ve prokaryotik membranı bozan protein granülizin (GNLY) tarafından bakteriyel patojenlere verilen granül serin proteazlar, granzimler (Gzm'ler) tarafından tetiklenir. Deneysel in-vitro ortamlarda Gzms'nin aracılık ettiği hedef hücre ölümünün moleküler mekanizmalarını araştırmak için, yüksek miktarda aktif enzim üreten protein ekspresyonu ve saflaştırma sistemleri gereklidir. Memelilerin salgıladığı protein ekspresyon sistemleri, glikosilasyon gibi posttranslasyonel modifikasyon taşıyan, doğru şekilde katlanmış, tamamen işlevsel protein üretme potansiyelini ima eder. Bu nedenle, plazmid pHLsec ekspresyonuna klonlanmış insan Gzms ile HEK293T hücrelerinin geçici transfeksiyonu için uygun maliyetli bir kalsiyum çökeltme yöntemi kullandık. Kültür süpernatantından Gzm saflaştırması, vektör tarafından sağlanan C-terminal polihistidin etiketi kullanılarak hareketsizleştirilmiş nikel afinite kromatografisi ile elde edildi. Proteinin N-terminaline bir enterokinaz bölgesinin yerleştirilmesi, sonunda katyon değişim kromatografisi ile saflaştırılan aktif proteaz üretimine izin verdi. Sistem, yüksek düzeyde sitotoksik insan Gzm A, B ve M üreterek test edildi ve insan vücudundaki hemen hemen her enzimi yüksek verimde üretebilmelidir.

Aşağıdaki bölümde yöntemi aydınlatmak için bir GzmA hazırlık tam bir dokümantasyon sunacak. Ayrıca başarılı saflaştırma etkinliği ve aktivitesi ile ilgili olarak benzer sonuçlar üreten GzmB ve GzmM saflaştırılmıştır. Ancak, bu daha sonraki hazırlıkları sadece verilerin birkaç seçilmiş parçaları gösterecektir. Mevcut protokolü takip eden 293T hücrelerinden elde GzmB preparatları çeşitli biyolojik deney sistemlerinde 9,29,31-34 etkinliklerini vurgulayarak Yayınlanmış bir kaç çalışma kullanılmıştır. <p class...

Burada, yüksek verimde saf, tamamen glikosile edilmiş ve enzimatik olarak aktif proteaz üreten HEK293T hücreleri kullanan uygun maliyetli bir granzim ekspresyon sistemini açıklıyoruz.

Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

Bu prosedürün genel amacı, insan embriyonik böbrek 2 93 T hücrelerinde yüksek verimli folik glikozillenmiş ve enzimatik olarak aktif granzimler üretmektir. Bu, öncelikle HEC 2 93 T hücrelerinin uygun doku kültürü kaplarında çoğaltılmasıyla gerçekleştirilir. Genleşme sonrası standart hazırlık boyutu 20 ila 25 kültür kabından oluşur.İkinci adım, genişletilmiş hücrelerin etkili kalsiyum fosfat yöntemi kullanılarak bir granzim ekspresyon plazmidi ile geçici olarak transfekte edilmesidir. Ardından, hücre süpernatantları toplanır ve salgılanan granzimler immobilize metal afinite kromatografisi ile saflaştırılır. Son adımlar ise granzimlerin enter kinaz işlemi ile aktive edilmesi ve proteazların katyon değişim kromatografisi yoluyla daha fazla saflaştırılmasıdır.Sonuç olarak, aktif proteazın yeterli miktarda bulunabilirliği granzim araştırmalarında kısıtlayıcı bir faktör olduğundan, enzimatik aktivite hızlı ve güvenilir bir kolorimetrik analiz kullanılarak test edilir. Bu yöntem; farklı organizmalarda yeni hücre ölümü yollarının karakterizasyonu veya tüm proteom yaklaşımlarında yeni proteaz substratlarının tanımlanması gibi alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Granzimleri eksprese etmek için, önce HEC 293 T hücrelerini 150 x 25 mm doku kültürü kapları kullanarak 20 mL kültür ortamında büyütün; hücreleri %80 konfluensta bölün. Hücreler gevşek şekilde tutunur, ancak plakadaki hücreler tripsin olmadan, pipetle kuvvetlice aşağı yukarı çekilerek mekanik olarak ayrılabilir.Transfeksiyon gününde %60 ila %70 konfluens sağlamak için hücreler transfeksiyondan bir gece önce ekilmelidir. Standart bir hazırlık boyutu 20 ila 25 kültür kabından oluşur. Transfeksiyondan bir saat önce, standart kültür ortamı 20 mililitre transfeksiyon ortamı ile değiştirilir; bir saatlik inkübasyon adımının sonuna doğru, transfeksiyondan bir ila iki dakika önce 50 mililitrelik tüplerde 400 mikrogram plazmid DNA, 10,95 mililitre çift distile su ve 1,55 mililitre 2 molar kalsiyum klorür ile karıştırılır.Tüpler tersyüz edilerek karıştırıldıktan sonra, 12,5 ml iki katlı HEPES tamponlu salin, 12,5 ml DNA kalsiyum çözeltisine eklenir ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca inkübe edilir. Bu karışım, her bir kap için 5 ml olacak şekilde hücrelerin üzerine damla damla ve tüm alana eşit şekilde yayılacak şekilde eklenir; bu işlem besiyerinin rengini hafif turuncuya çevirir. Kültür kapları, bir doku kültürü inkübatöründe 7 ila 11 saat boyunca inkübe edilir.İnkübasyonun ardından ince bir çökelek görülür. Transfeksiyon ortamını uzaklaştırın. Önceden ısıtılmış PBS ile dikkatlice durulayın ve 20 mililitre serumsuz kültür ortamı ekleyip bir doku kültürü inkübatöründe 72 saat boyunca inkübe edin; ardından hücre süpernatantından bir örneği SDS page üzerinde çalıştırıp kumasi ile boyayarak transfeksiyon ve ekspresyon verimliliğini analiz edin.Brilliant blue. Bir granzim bandını görselleştirmek için kullanılır. İnkübasyonun ardından hücre kültürü süpernatanlarını 250 mililitrelik tüplere aktarın ve santrifügasyon ile temizleyin.Ayrılmış hücrelerden ortamı temizlemek için ilk santrifüj işlemini gerçekleştirin. Süpernatantı taze 250 mililitrelik tüplere aktarın ve kalan hücre artıklarını uzaklaştırmak için 4 °C'de 30 dakika boyunca 4,000 G'de santrifüjleyin. Ardından, beş mililitre sodyum klorür, 6,25 mililitre tris baz ve bir mililitre nikel sülfatı 250 mililitre temizlenmiş süpernatanta ekleyin.Süpernatantı 500 mililitrelik bir vakumlu filtre ünitesi kullanarak filtreleyin. Uygun bir FPLC sistemi kullanarak, nikel immobilize metal iyon afinite kromatografisi kolonunu his bağlama tamponu ile dengeleyin.Ardından, temizlenmiş süpernatantı 4 °C'de 0,5 mililitre/dakika akış hızında dengelenmiş kolona uygulayın. Süpernatant uygulandıktan sonra, ultraviyole veya UV absorban baz hattına ulaşılana kadar kolonu his bağlama tamponu ile yıkayın. 2 mililitrelik fraksiyonlar toplarken, granzimleri 0,5 mililitre/dakika akış hızında doğrusal 20 mililitrelik ILE gradyanı ile elüe edin.Elüsyon fraksiyonlarını SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile analiz edin. Grand zyme içeren fraksiyonları bir santrifüj tüpüne aktarın. Enterokinaz öncesi kontrol olarak küçük bir örneği -20 °C'de saklayın.Diyaliz tüpündeki havuzlanmış fraksiyona, başlangıç süpernatantının her 50 mililitresi için 0,02 ünite olacak şekilde doğrudan entero kinaz ekleyin ve oda sıcaklığında entero kinaz tamponu içerisinde gece boyunca diyalize edin. Ertesi gün, kinaz ile işlem görmüş örneği, entero kinaz öncesi kontrol ile karşılaştırarak SDS-PAGE ve Coomassie Blue boyama ile analiz edin. Uç terminal işlemesi tamamlandığında.Diyalizat sekizini filtrelemeden önce diyaliz tamponunu S tamponu A ile değiştirin ve oda sıcaklığında dört saat daha diyaliz yapın. Ardından, bir S kolonunu S tamponu A ile dengeleyin. Örnek yüklemesinden sonra, örneği 4 °C sıcaklıkta, dakikada 0,5 ml akış hızında kolona yükleyin.UV absorbsiyon baz çizgisine ulaşana kadar kolonu S tampon A ile yıkayın. Granzimleri 30 mililitrelik lineer sodyum klorür gradyanı ile elüe edin; granzyme A yaklaşık 650 milimolar sodyum klorürde, granzyme B yaklaşık 700 milimolar sodyum klorürde ve granzyme M yaklaşık 750 milimolar sodyum klorürde elüe olur. Granzim içeren fraksiyonları birleştirin ve santrifüj filtrelerinde yaklaşık 100 mikromolar olacak şekilde konsantre edin, konsantre granzim preparatlarını alikotlayın ve -80 °C'de saklayın.Ardından, elüsyon fraksiyonlarını SDS-PAGE ve kolorimetrik analizlerle analiz edin; kolorimetrik analizleri gerçekleştirmek için elüsyon fraksiyonlarından veya konsantre stoklardan alınan küçük granzim örneklerini 96 kuyucuklu düz tabanlı plakalara dağıtın; bir pozitif kontrol ve bir negatif kontrol ekleyin. Her birine 100 µL analiz tamponu ekleyin.Plakayı 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, bir mikroplak okuyucuda 405 nanometrede optik yoğunluğu ölçün. Bu protokol, S sütunundaki granzyme BE'yi gösteren bu temsili kumasi boyalı SDS-PAGE jelinde kanıtlandığı üzere, yüksek verimli saf granzimler sağlayacaktır.Rekombinant granzimler, rekombinant ve doğal granzim B aktivitesini karşılaştıran bu kolorimetrik analizde gösterildiği üzere, doğal proteaz preparatlarıyla benzer aktivite sergiler. Önemli bir nokta olarak, endo H işlemi, HEC 2 93 T hücrelerinde üretilen granzimlerin tam olarak glikozile olduğunu göstermektedir. Rekombinant granzimler, bakteriyel protein substratı ve UOCD kullanılan bu temsili granzim a kesim analizinde kanıtlandığı üzere, makromoleküler protein substratlarını kesme kapasitesine sahiptir.Burada, parçalanmış N-O-U-C-D'yi temsil eden bant, artan granzim konsantrasyonu ile yavaşça kaybolmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, HK 2 93 T hücrelerinde yüksek verimli, tam glikozillenmiş ve proaktif granzimlerin nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-high-yield-cost-efficient-expression-system-human-granzymes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

İnsan, fare veya sıçan Granzyme B'nin (GzmB) proteolitik aktivitesini spesifik olarak ölçen basit, kantitatif bir kolorimetrik testi tanımlıyoruz. Bu protokol, uygun bir tanıma dizisi ile diğer sentetik peptit substratlarının hidrolizi yoluyla diğer granül serin proteazların proteaz aktivitesini belirlemek için kolayca uyarlanabilir.

Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hidrolizi, A Kolorimetrik Özellikle Granzim B proteolitik aktivitesini ölçer Deneyi

Bu çalışmada, hedef insan rekombinant proteininin farklı üretim platformlarındaki ekspresyonu karşılaştırıldı. Geleneksel fermentör bazlı kültürlere ve bitkilere odaklandık, her bir sistemin kurulumunu açıkladık ve rapor edilen sonuçlara dayanarak her platform için doğal sınırları ve avantajları vurguladık.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Hücre temelli sistemlerde sıtma proteinlerin sentezlenmesi zor kalır. Biz HeLa hücrelerinden sıtma rekombinant proteinleri ifade rhoptry için iki adım ve (in vitro çeviri) bir adım IVT hücresi serbest ifade sistemlerini göstermektedir. Biz rhoptry proteinleri saflaştırmak için bir Ni-afinite reçinesi bazlı saflaştırma sistemini kullanır.

İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteinler

Bu, salgılanan, glikosile edilmiş memeli proteinlerinin üretimi ve ardından X-ışını kristalografisi ve diğer biyofiziksel çalışmalar için yeterli homojen protein verimi ile tek aşamalı saflaştırma için hızlı, uygun maliyetli bir protokoldür.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

İyon kanalları arıtma kez, zorlu ama bir kez elde, potansiyel olarak vitro araştırmalar fonksiyonları ve yapıları kanallarının izin verebilirsiniz. Burada, biz ifade ve arıtma memeli bestrophin protein, bir ailenin Ca2 +için kademeli yordamlar açıklar-Cl- kanalları aktif.

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

HEK293 hücrelerinde yapı tasarımı, geçici transfeksiyon ve tam uzunlukta insan huntingtin protein varyantlarının ekspresyonu ve saflaştırılmasını kapsayan ölçeklenebilir protokoller sunuyoruz.

Geçici İfade Sistemi Kullanarak Memeli Hücrelerinde Tam Boy İnsan Huntingtin Varyantlarının Verimli ve Ölçeklenebilir Üretimi

Onun etiketi saflaştırma, diyaliz ve aktivasyon, bakterilerde çözünür, aktif matriks metalloproteinaz-3 katalitik alan protein ekspresyonunun verimini arttırmak için kullanılır. Protein fraksiyonları SDS-PAGE jelleri ile analiz edilir.

Afinite Kromatografisi Kullanılarak İnsan Matriksi Metalloproteinaz-3'ün Bakteriyel İfadesi ve Saflaştırılması

İnsan zarı taşıyıcılarının yapısal ve biyokimyasal çalışmaları, miligram miktarlarda kararlı, sağlam ve homojen protein gerektirir. Burada, kodon için optimize edilmiş genleri kullanarak insan çözünen taşıyıcı taşıyıcıları taramak, eksprese etmek ve saflaştırmak için ölçeklenebilir yöntemleri açıklıyoruz.

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Öğrenin, HEK293T hücrelerinde yüksek verimli ve maliyet-etkin granzim ifade sistemi ile tam glikozillenmiş, enzimatik olarak aktif proteazların üretimini. Bu yöntem immün yanıt araştırmalarını destekler.

Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi

Daha fazla video keşfet