RAFT kontrollü Polimerizasyon yoluyla Tri-bileşenli Floresan Glycopolymers uyduruk ve Etkin Hazırlık

Bu prosedürün genel amacı, tersinir toplama parçalanma zincir transferi veya RAFT polimerizasyonu kullanarak floresan istatistiksel lineer glikopolimerlerin iyi kontrollü sentezini gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle gliko monomer olan 2-laktobio etil metakrilamid veya L-A-E-M-A sentezlenerek gerçekleştirilir. İkinci adım, karşılık gelen düşük dispersiteli glikopolimeri sentezlemek için L-A-E-M-A, 2-amino etil metakrilamid veya AEMA ve N-2-hidroksietil akrilamid veya HEAA'nın RAFT polimerizasyonunu kullanmaktır.

Ardından, floreseinli bir gliko polimer üretmek için, gliko polimerin primer aminlerinden biri karboksifloresein xito middle ester ile reaksiyona sokularak modifiye edilir. Son adım, floreseinli gliko polimerin, bilinen karbonhidrat bağlama spesifikliğine sahip lektin kaplı agarose boncuklara bağlanmasıdır. Son olarak, gliko polimerlerin agarose boncuklara bağlanmasını analiz etmek için floresan mikroskobu kullanılır; böylece gliko polimerin hedeflenen karbonhidrata sahip olduğu ve floresan bir etiketle işaretlendiği doğrulanır.

RAF polimerizasyonunun, geleneksel serbest radikal polimerizasyonlarını kullanan mevcut yöntemlere göre avantajı, bu sürecin başlatıcı kaynaklı zincir sayısını minimize eden kontrollü bir polimerizasyon tekniği olmasıdır. Bu durum, önceden belirlenmiş moleküler ağırlıklara ve çok dar polidispersite indeksine sahip polimerlerle sonuçlanır. Belirli floresan glikopolimerlerin hazırlanması için polimerizasyonlar, tanımlanmış monomer karışımlarına uygulanabilir.

Bu glikopolimerler, lektin kaplı boncuklar kullanılarak doğrulanabilen tanımlanmış bağlanma yeteneklerine sahiptir. Floresan glikopolimerlerin verimli bir şekilde hazırlanmasının, gelecekte glikobiyoloji araştırmaları için büyük değer taşıyacağı kanıtlanmalıdır. Başlamak için, iki gram laktobiyonik asidi üç mililitre susuz metanolden içinde çözün.

Ardından, çözelti bulanıklaşana kadar yavaşça damla damla absolut etanol ekleyin. Tüm çözücüleri uzaklaştırmak için döner evaporatör kullanın. %98 verimle 1,94 gram lacto bioo one five lactone elde etmek için bu işlemi üç kez tekrarlayın.

Bir gram lakto biyolaktonun üç mililitre metanoldeki çözeltisini, A EMA ve MEHQ'nun iki mililitre metanoldeki çözeltisine ekleyin. Ardından, bir mililitre trietilamin ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında karıştırın. 48 saat sonra, karışıma 20 mililitre deiyonize su ekleyin ve karışımı bir döner evaporatöre aktarın.

Tamamen kuruyana kadar buharlaştırın. Kalıntıyı 20 mililitre deiyonize su içinde çözün ve çözeltiyi 10 x 20 milimetrelik bir anyon değişim kolonunun üst kısmına uygulayın. Çıkışın altına bir miligram MEHQ içeren bir beher yerleştirin ve kolonu behere elüye edin.

Çözelti döner evaporatörde uçurulduktan sonra, kalıntıyı 20 mililitre deiyonize su içinde çözün ve bir miligramlık iyon değişim reçinesi porsiyonları ekleyin. İnce tabaka kromatografisi plakasına çözeltiden bir mikrolitre alınıp uygulanarak gerçekleştirilen bir hidran testi negatif sonuç verene kadar bu işleme devam edin. Plakayı, etanolde %2'lik bir anhy çözeltisi ile püskürtün ve bir sıcak plaka üzerinde 90 °C'de bir dakika boyunca ısıtın.

Mavi renk oluşmadığında bitiş noktasına ulaşılmış demektir. Ardından, çözeltiyi sinterli cam huni aracılığıyla bir deney tüpüne filtreleyin. Çözeltiyi -80 °C'de dondurun ve ardından liyofilize etmek üzere bir liyofilizatöre aktarın.

Kalıntıyı minimum miktarda metanol içinde çözün ve -20 °C'ye soğutulmuş susuz aseton ekleyerek ürünü çöktürün. Çökelen L-A-E-M-A'yı fritli cam huni aracılığıyla filtrasyonla toplayın. Huniyi ve çökeleği kurutmak üzere vakumlu bir desikatöre aktarın; ardından iki mililitrelik bir test tüpü içerisinde bir mililitre ticari grade HEAA'ya yaklaşık 150 mesh alüminyum oksit nanoparçacıklarının 0,5 g'ını ekleyin.

Tüpü 300 ×g hızda 30 saniye boyunca santrifüjleyin ve üst katmanı inhibitör içermeyen HEAA olarak dikkatle kullanın; 32,8 mg L-A-E-M-A, 1,7 mg α-EMA, 27,5 µL inhibitör içermeyen HEAA ve 0,4 mL deiyonize suyu dikkatlice çözün ve çözeltiyi iyice temizlenmiş 1 mL'lik bir flask tüpe aktarın. Ardından, tüpe 50 µL RAFT reaktifi ve 50 µL başlatıcı reaktifi ekleyin ve valf kapalıyken tüpün yanına hafifçe vurarak karıştırın. Tüpü bir vakum hattına bağlayın ve içeriği kuru buz etanol banyosu kullanarak dondurun.

Ardından, bir pompa yardımıyla tüp basıncını 50 millitorr seviyesine düşürün ve vanayı kapatın. Kuru buz banyosunu kaldırın ve içeriğin çözülmesine izin verin. Dondurma, vakumlama ve çözdürme döngüsünü dikkatli bir şekilde iki kez daha tekrarlayın.

İçeriğin tamamen çözündüğünden emin olmak için tüpü kontrol edin ve gerekirse hafifçe vorteksleyin. Yerleştirmeden önce, kapalı tüpü vakum hattından çıkarın ve şeffaf plastik bir vakum torbasına yerleştirin. Plastik bir el pompasıyla torbadaki havayı boşaltın.

Ardından torbayı 70 °C'ye ayarlanmış kapalı bir su banyosuna yerleştirip 24 saat bekletin. Daha sonra tüpü torbadan çıkarın ve içeriğini 3.500 Dalton moleküler ağırlık kesim değerine sahip bir diyaliz torbasına aktarın. Diyaliz torbasını bir behere yerleştirin ve iki litre deiyonize su ile 24 saat boyunca diyalize edin.

Diyaliz torbası içeriğini bir test tüpüne aktarın ve -80 °C'deki bir dondurucuya yerleştirin. Donduktan sonra bir liyofilizatöre aktarın ve dondurarak kurutun. Pamuksu beyaz gliko polimer PMA LA EMA elde etmek için, önce 0,9 mL PBS içinde beş mg PMA LA EMA çözeltisi hazırlayın.

Ardından, 100 µL dimetilformamid içerisinde çözünmüş 0,6 mg karboksiflorescein cin, middle eter'i hızla karıştırılan çözeltiye yavaşça ekleyin; mikrotüpü folyo ile sarın ve oda sıcaklığında 16 saat boyunca yavaşça karıştırın, ardından çözeltiyi 3.500 Dalton moleküler ağırlık kesim değerine sahip bir diyaliz torbasına aktarın. Torbayı bir behere yerleştirin ve ışıktan koruyarak iki litre deiyonize suya karşı 16 saat boyunca diyaliz edin. Diyaliz torbasının içeriğini bir test tüpüne aktarın.

Çözeltiyi -80 °C'de dondurduktan sonra liyofilize edin. Süngerimsi sarı floresan etiketli P-M-A-L-A-E-M-A glikopolimerini elde etmek için, glikopolimerlerin sayı ortalama molekül ağırlığını, ağırlık ortalama molekül ağırlığını ve dispersitesini bir HPLC sistemi ile belirleyin. İlk olarak, santrifüj tüpündeki 50 µL erythrina cristagallii lectin kaplı aro bead süspansiyonuna 1,5 mL PBS ekleyin.

Ardından tüpü 1 dakika boyunca 300 ×g'de santrifüj edin. Daha sonra süpernatantı uzaklaştırın ve son olarak 0,5 mL PBS eklemeden önce yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Lektin kaplı boncukları içeren tüpe, 6 µL PBS içinde 3 µg floresein işaretli PMA LA EMA çözeltisi ekleyin.

Negatif kontrol olarak floresein işaretli P-M-A-G-A-E-M-A kullanın. Ardından, tüpleri folyoya sarın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Tüpü bir dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın.

Ardından, boncukları 1,5 milliliters taze PBS içinde yeniden süspande edin ve yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Son olarak, boncukları 0,2 milliliters PBS içinde yeniden süspande edin. Süspande edilen boncuklardan dört mikrolitreyi bir immunofloresan mikroskop lamındaki kuyuya aktarın. Lamı kapatın ve bir cam kapatma lamı ile örtün; ardından kayıt yapın.

10 x objektifli FITC filtresi ve kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanılarak lamın görüntüleri alınmıştır. Gliko polimerler, jel geçirgenlik kromatografisi ile analiz edilmiştir. RAFT kullanmadan sentezlenen polimerler, RAFT kullanılarak yapılanlara göre çok daha yüksek bir dağılıma sahiptir.

Floresein ile işaretlendiğinde, gliko polimerin fiziksel görünümü beyazdan, UV ışığı altında görülen güçlü bir sarı renge dönüşür. İşaretlenmemiş polimer çözeltisi koyu kalırken, floresein ile işaretlenmiş polimer parlak yeşil renkte parlayarak işaretin varlığını doğrular; lektin kaplı boncuklara özgül bağlanma yalnızca sarkan şeker kalıntıları taşıyan polimerlerle gerçekleşir. Sarkan şeker kalıntıları taşımayan polimerlerle işlem gördüklerinde boncuklar koyu kalırken, bağlandıklarında yeşil renkte parlarlar. RAFT tabanlı bu polimerizasyon tekniği, sentezlenebilecek gliko polimer türleri açısından büyük esneklik sağlar.

Glikopolimerlerin sonraki etiketlemesi, sulu bir ortamda primer aminlerle reaksiyona girebilen çok çeşitli floresan reaktiflerle de gerçekleştirilebilir. Glikobiyoloji alanındaki araştırmacılar, oldukça çok yönlü ve tanımlı glikopolimerleri kolayca elde etmek için bu tekniği kullanabilirler. Bu glikopolimerler; kistik fibrozis hastalarının solunum yollarında gözlenenler veya birçok insan kanseri türünde yer alanlar gibi, karbonhidrat bağlanma spesifisitelerini araştırmak için araçlar olarak kullanılabilir.