Name: RAFT kontrollü Polimerizasyon yoluyla Tri-bileşenli Floresan Glycopolymers uyduruk ve Etkin Hazırlık (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Keşfedin RAFT polimerizasyonu ile floresan glikopolimer sentezini. Bu yöntem, düşük dispersiteli polimerler üreterek glikobiyoloji araştırmalarında karbonhidrat etkileşimlerini incelemek için değerli araçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Missouri Üniversitesi Deney İstasyonu Kimya Laboratuvarları ve Missouri Kistik Fibrozis Derneği tarafından desteklenmiştir.

Glycomonomer 1. sentezi 2-Lactobionamidoethyl metakrilamid <ol><li> Çözelti, sadece bulanık olana kadar damla damla bir tarzda mutlak etanol ilave yavaş susuz metanol içinde 3.0 ml laktobiyonik asit 2 g çözülür ve ardından dönüşlü buharlaştırma yoluyla çözücülerin ayrılması. </li><li> 3.0 ml susuz metanol içinde ve bir kere daha, sonra yavaş yavaş hemen bulutlanana kadar mutlak etanol ilave dönüşlü buharlaştırma yoluyla çözücü buharlaştırılması, Aşama 1.1, tortu çözülür. Lactobiono-1,5-lakton (1.94 g,% 98 verim) elde etmek için bu adım 3 kez tekrarlayın. Bu ürün, aşağıdaki reaksiyonlarda kullanım için yeterli saflıkta olan. </li><li> N, metanol içinde 3.0 ml lactobionolactone 1.0 g ekleyin - (2-aminoetil) metakrilamid (AEMA, 0.58 g) ve hidrokinon monometil eter (MEHQ, 1.0 mg), kendi kendine polimerizasyon inhibitörü, 2.0 ml metanol, ardından 1.0 ml trietilamin ile. 48 st için oda sıcaklığında karıştırın. </li><li> Deiyonize H2O içinde 20 ml (DH 2 ekleme </alt tepkime şişesine&gt; O), sonra dönüşlü buharlaştırma ile kuruyana kadar buharlaştırma ile metanol ve serbest trietilamin çıkarın. </li><li> MeHQ 1.0 mg ihtiva eden bir alıcı kabın içine - (şekilde, 10 mm x 20 mm, OH) dH 2 O 20 ml, daha sonra bir anyon değiştirici kolon içinden sulu bir çözeltisinin, ilave herhangi bir geri kalan laktobiyonik asit kaldırın. </li><li> Dönüşlü buharlaştırma yoluyla kuruyana kadar buharlaştınlması suretiyle de, Aşama 1.5 üretilen trietilamin, kaldırın. </li><li> DH 2 O 20 ml ilave edilir ve yavaşça reaktif maddeler saptanabilen herhangi bir ninhidrin kadar katyon değişim reçinesi (H + form) 1 mg alikotları eklenerek reaksiyona girmeyen AEMA çıkarın. Daha sonra etanol çözeltisi içinde% 2 ninhidrin ile plaka, püskürtme, ince-tabaka kromatografisi plakaya uygulanması, her bir reçine ilave edildikten sonra çözelti, 1 ul örnekler alınarak kaldırma izleyin. Bir koyu mavi renk plaka, 1 dakika boyunca 90 ° C&#39;ye kadar ısıtıldığında geliştirmek için bakıldığında, uç nokta ulaşıldı. </li><li&gt; liyofilize edilir, daha sonra, bir test tüpüne filtrat transferi, bir fritli cam huni içinden solüsyonu filtre -80 ° C&#39;de örnek dondurma ve. </li><li> Daha sonra soğuk anhidre aseton ekleyin, metanol (~ 0.5 mi) içindeki bir minimum miktarda dondurularak kurutulmuş malzeme çözülmesiyle numuneden MeHQ çıkarın (-20 ° C, 15 mi °) ürünü çökeltmek için. Daha sonra grimsi beyaz bir toz (0.94 g,% 68 verim) olarak 2-lactobionamidoethyl metakrilamiddir (LAEMA) elde edilmesi için vakum altında bir desikatör içinde çökelti kuru bir sırlı cam huni kullanılarak filtre ile çökelti toplanır. Bu ürün, aşağıdaki reaksiyonlarda kullanım için yeterli saflıkta olan. </li></ol> Monomer 2. sentezi 2-Gluconamidoethyl metakrilamid Not: bir asılı şeker sahip değildir 2-gluconamidoethyl metakrilamid hazırlanması (gaema), yayınlanmış bir metoda 15 uyarlanmıştır. <ol><li> Çözeltisine 10 ml metanol içinde çözüldü AEMA 2.0 g eklemekarıştırılarak 30 ml metanol içinde D-glukonolakton (1.6 g) ve bir yavaş yavaş 1.6 ml trietilamin ilave edin. </li><li> 24 saat boyunca oda sıcaklığında reaksiyona karıştırın. </li><li> Daha sonra kuru aseton, 10 ml ile yıkanır, bir sırlı cam huni kullanılarak çökelmiş ürün filtre edin ve çökelti, 10 ml izopropanol ile üç kez yıkayın. Vakum altında bir desikatör içinde çökeltilmiş ürün kurutulur. </li></ol> 3. RAFT Glycopolymer Sentezi <ol><li> Ticari N Mevcut önleyicisi MeHQ kaldırmak için - (2-hidroksietil) akrilamid (heaa), alüminyum oksit nano-tanecikleri, 0.5 g eklenmesi, ardından 2 ml&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpü için heaa 1 ml ekleyin. 30 saniye boyunca 300 xg&#39;de santrifüj tüpü ve aşağıdaki reaksiyonda üst tabaka heaa kullanın. </li><li> Dikkatle LAEMA 32.8 mg (70.0 umol), AEMA 1.7 mg (10.5 umol) ve heaa (270 umol) ve 27.5 ul, tüm bu şekilde, iyi temizlenmiş 1 ml&#39;lik bir Schlenk tüpüne, dH 2 O 0.4 ml içinde çözüldü Bir Monom sahip3: 77, 20 er molar oranı. </li><li> Paralel bir reaksiyonda, aşama 3.2&#39;de LAEMA kullanılarak yerine herhangi bir askılı şeker sahip olmayan kontrol polimerleri üretmek reaksiyonda gaema 21.4 mg (70.0 umol) yerine amacıyla. </li><li> Ilgili Schlenk tüpüne (örneğin, 3.2 veya 3.3) için, ardışık olarak DMF, 250 ug ihtiva eden (4-siyano-pentanoik asit) -4-dithiobenzoate (1.9 umol, RAFT maddesi) 0.53 mg, ve DMF ve 50 ul ihtiva eden 50 ul 4,4&#39;-azobis- (4-siyanovalerik asit) (0.9 umol, başlatıcı). Yavaşça parmak vurma karıştırın. </li><li> Schlenk tüpü içinde yer alan içerikleri bir kuru buz kullanılarak dondurma: etanol banyosu (100 mi etanol içinde 75 g kuru buz), 10-50 mTorr içinde bir vakum uygulanır, daha sonra savurma valfin kapatılması yavaş yavaş oda sıcaklığına kadar eritilir çözeltisi izin . Iki kez daha bu donma-çözülme döngüsü boşaltın-tekrarlayın. Tüm reaktifler son çözülme sonra çözülür emin olun. </li><li> Bir yapışmalı plastik ba içine savurma tüp yerleştiring, torba havayı tahliye ve sonra kapatın. 70 ° C&#39;de önceden ısıtılmış bir su banyosuna Schlenk tüpü ihtiva eden bir çanta aktarın ve 24 saat daha inkübe edilir. </li><li> Dikkatli bir şekilde hazırlanmış, diyaliz torbası (= 3,500 MWCO) için Schlenk tüpüne çözelti transferi ve ilk 8 saat dH 2 O saatte değişen 24 saat dH 2 O (10 x 2 L) karşı diyaliz. Diyalizden sonra, bir test tüpüne Diyaliz tüpünden alınan örnek aktarmak -80 ° C&#39;de örnek dondurma, ve daha sonra liyofilize edilir. </li></ol> Not: Elde edilen istatistiki poli-metakrilamid / akrilamid (PMA) pandantif veya (Kademe 3,3), D-glukanamid (Kademe 3.2) 4 O -β-D-galaktopiranosil-D-glukanamid (laktobiyonamid) içeren kopolimerler, sırasıyla, elde edilmiştir. Tartışmanın kolaylık sağlamak için, bu iki glycopolymers sırasıyla PMA-LAEMA ve PMA-gaema olarak kısaltılmıştır. Fluorophores Glycopolymers 4. sonrası modifikasyonu </p&gt; <ol><li> Sırasıyla fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, 0.1 M sodyum fosfat, 0.15 M NaCl, pH 7.5) içinde 0.9 ml birincil amin fonksiyonel grupların ~ 0.9 μmole içeren glycopolymer PMA-LAEMA veya PMA-gaema 5.0 mg çözülür. </li><li> Yavaş yavaş hızlı karıştırma ile çözümlere DMF 100 ul carboxyfluorescein süksinimidil ester, 0.6 mg ekleyin. Yavaşça oda sıcaklığında karanlıkta 16 saat tepkileri karıştırın. </li><li> Işıktan koruyarak da, hazırlanmış bir diyaliz tübü (MWCO = 3.500) olarak örnek yüklemek ve ilk 8 saat boyunca diyaliz solüsyonu her saat değişen 16 saat dH 2 O (2 L) karşı diyaliz. Diyalizden sonra, bir test tüpüne Diyaliz tüpünden alınan örnek aktarmak -80 ° C&#39;de örnek dondurma, ve daha sonra liyofilize edilir. </li></ol> Not: liyofilizasyonundan sonra, floresan glycopolymers PMA-LAEMA-Floresein ve PMA-gaema-floresan, sırası ile, elde edilir. Giy 5. Karakterizasyonukopolimerler <ol><li> Ortalama moleküler ağırlık (Mn), ağırlık ortalamalı molekül ağırlığı (Mw) ve jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) yazılımı, GPC ile donatılmış bir ticari bir HPLC sistemi üzerinde glycopolymers dağıtma özelliği (Mw / Mn) belirlemek 0.6 ml / dak 14 bir akış oranında, elüan olarak 0.1 M Tris / 0.1 M sodyum klorür tamponu (pH 7) ile ilgilenilen moleküler ağırlığı ve bir kırılma endeksi detektörü için müsait kolonu. (: 200-1,200,000 g / mol Mw) moleküler ağırlık standartları gibi polietilen glikol standartları kullanarak. </li><li> Glycopolymers 16 içinde primer amin fonksiyonel grupların, gerçek konsantrasyonunu ölçmek. Yayınlanmış bir metoda göre sentezlenen 17 glycopolymers toplam karbonhidrat içeriği analiz edin. </li><li> , Gaema ve glycopolymers PMA-LAEMA PMA-gaema NMR spektroskopisi 14 ile D 2 O yapısal kompozisyon ve glycomonomers LAEMA saflık testleri. </li></ol> Sentetik Glycopolymers 6. Bağlama Testleri agaroz taneleri lektin kaplanmış <ol><li> 1 dakika boyunca 300 xg&#39;de Erythrina krista-galli lektin (ECL) kaplı agaroz boncuklarının süspansiyondan, santrifüj 50 ul PBS içinde 1.5 ml ilave edilir, ve dikkatli bir şekilde çıkarın ve süpernatant atın. Iki kez bu adımı yineleyin ve sonra PBS 0.5 ml boncuk tekrar süspansiyon. </li><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında, karanlıkta, ekleme 3 PMA-LAEMA-floresein veya boncuk süspansiyonu PBS 6 ul PMA-gaema-Floresein (negatif kontrol) ug, ve bunların karışımları inkübe edin. </li><li> PBS içinde 0.2 ml PBS üç kez, ve tekrar süspansiyon boncuk 1.5 ml karışımları yıkayın. (Eksitasyon dalga boyu (Teflon-kaplı) bir imüno-mikroskop lamı üzerine bir kuyuya bir kısım (4 ul), yük kapak kayma ile kapatın ve bir FITC filtresi kullanılarak flüoresan mikroskopi ile dikkat edilmelidir: 467-498 nm, emisyon dalga boyu: 513- 566 nm) ve 10X objektif t bağlanmasını incelemekO boncuk 14 glycopolymers flüoresan. </li></ol>

<ol><li>Scharfman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+binds+to+neoglycoconjugates+bearing+mucin+carbohydrate+determinants+and+predominantly+to+sialyl-Lewis+x+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates.</a> Glycobiology. 9 (8), 757-764 (1999).</li>
<li>Song, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeting+of+alveolar+macrophages+via+RAFT-based+glycopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers.</a> Biomaterials. 33 (28), 6889-6897 (2012).</li>
<li>Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolfenden%2C+ML+%22Carbohydrate+Recognition%3A+Biological+Problems%2C+Methods%2C+and+Applications%22">Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications</a>. Wang, B., Boons, G. .-J. , John Wiley, & Sons, Inc., Chapter. 349-370 (2011).</li>
<li>Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radical+addition-fragmentation+chemistry+in+polymer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis.</a> Polymer. 49 (5), 1079-1131 (2007).</li>
<li>Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+synthesis+of+well-defined+glycopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polym.+Sci.%2C+Part+A%3A+Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers.</a> J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45 (11), 2059-2072 (2007).</li>
<li>Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+various+glycopolymer+architectures+via+RAFT+polymerization%3A+From+block+copolymers+to+stars%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars.</a> Biomacromolecules. 7 (1), 232-238 (2006).</li>
<li>Bulmus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAFT+polymerization+mediated+bioconjugation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies.</a> Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).</li>
<li>Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+glycopolymers+and+their+multivalent+recognitions+with+lectins%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins.</a> Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).</li>
<li>Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+glycopolymers+by+controlled+radical+polymerization+techniques+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications.</a> Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).</li>
<li>Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+glyco-functionalized+quantum+dots%3A+Synthesis%2C+characterization%2C+and+cytotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies.</a> Bioconjugate Chem. 20 (5), 994-1001 (2009).</li>
<li>Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-defined+galactose-containing+multi-functional+copolymers+and+glyconanoparticles+for+biomolecular+recognition+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes.</a> Macromolecules. 42 (17), 6393-6405 (2009).</li>
<li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+N-2-hydroxypropyl+methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl+methacrylamide+block+copolymers+as+hepatocyte-targeting+gene+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers.</a> Bioconjugate Chem. 22 (8), 1503-1512 (2011).</li>
<li>Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+RAFT+polymerization+of+N-acryloylmorpholine%2C+synthesis+of+an+ABA+triblock+glycopolymer+and+study+of+its+self-association+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior.</a> Macromol. Chem. Phys. 213 (17), 1768-1782 (2012).</li>
<li>Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAFT-based+tri-component+fluorescent+glycopolymers%3A+synthesis%2C+characterization+and+application+in+lectin-mediated+bacterial+binding+study%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study.</a> Glycoconj. J. 31 (2), 133-143 (2014).</li>
<li>Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+well-defined+glycopolymers+synthesized+via+the+reversible+addition+fragmentation+chain+transfer+process+in+aqueous+media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polymer+Sci.+Part+A%3A+Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media.</a> J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47 (2), 614-627 (2009).</li>
<li>Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+primary+amine+groups+available+for+subsequent+biofunctionalization+of+polymer+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces.</a> Bioconjugate Chem. 22 (8), 1690-1699 (2011).</li>
<li>Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFox%2C+A+%22Analysis+of+Carbohydrates+by+GLC+and+MS%22">Analysis of Carbohydrates by GLC and MS</a>. , CRC Press. 87-170 (1989).</li>
<li>Thomas, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+molecular+weight+control+of+the+polymerization+of+acrylamide+via+RAFT%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT.</a> Macromolecules. 37 (24), 8941-8950 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bir basit ve etkili olan ve bir kolye karbonhidrat olmadan RAFT tabanlı tri-bileşenli floresan glycopolymers için protokol ve lektin bağlayıcı testinde kullanımı, bu raporda gösterilmiştir. Protokol glycomonomers LAEMA ve gaema hazırlanması ile başlar. Tek-aşamalı bir RAFT kontrollü kopolimerizasyonu yoluyla yeniden üretilebilir bir verimle, öngörülebilir bir monomer bileşimine ve düşük bir dağılma ile glycopolymers elde edilir. Carboxyfluorescein süksinimidil ester ile glycopolymers sonrası modifikasyon sonrasında, elde edilen ilgili floresan-etiketli glycopolymer bağlanması, lektin bağlama özgüllüğü açısından kolaylıkla test edilebilir. Daha sonra glycopolymer sentezlerde kullanılan edilecek glycomonomers ilk hazırlayıcı adımda, kolaylıkla temin laktobiyonik asit ve glukonolakton kullanılmıştır. Teorik olarak, kompleks, oligosakaritler monosakkaridden ilgi herhangi bir karbonhidrat, Converte olabilirglikoz C6 birincil hidroksil grubu üzerine hedef şeker konjuge tarafından glycomonomers d. Indirgeme glucose kalıntısının oksidasyonu ve bir lakton olan ek olarak dehidrasyon sonra, ürün daha sonra kolaylıkla olabilir karşılık gelen glycomonomer oluşturulması için AEMA birincil amin ile reaksiyona sokulur. Bu yol daha başka örnekleri arasında, bir son raporunda 14 görülebilir. Bu, herhangi bir polimerizasyon adımı başlamadan önce, MEHQ, güçlü bir polimerizasyon inhibitörü, kullanımdan hemen önce, bu tüm monomerin ve glycomonomer preparasyonlar çıkarılmalıdır not edilmelidir. Bu hali hazırda MEHQ sonra hemen yüksek verimde inhibitör içermeyen ürünün çökelmesi için -20 ° C&#39;da aseton ile tedavi sahip glycomonomer çözünmesi için minimum miktarda metanol kullanılarak gerçekleştirilir. Herhangi bir radikal polimerizasyon düzeni Essential, detay ve monomer saflık dikkat vurgulanmıştır. Bir sal polimerizasyon sistemi tipik olarak, bu oluşmaktadırradikal bir kaynak, bir RAFT reaktif, bir monomer ve çözücü. Bu görsel sunum, tek aşamalı bir RAFT polimerizasyonu sistemi, bir sulu çözelti içinde üç farklı monomerler sahip bir reaksiyon karışımından elde edilen istatistiki kopolimerlerin üretimine odaklanmıştır tarif edilmektedir. Iki ayrı RAFT aracılı tepkiler bir kolye sahip olan bir glycomonomer kullanan içinde sunulmuştur, herhangi bir ilişkili karbonhidrat artığı ile bir poliol sahip, karbohidrat terminus (örneğin, β-D-galaktoz), ve diğer non-azaltır. Her iki RAFT aracılı reaksiyonlar için ortak bir ara molekülü olarak hizmet veren tekil bir hidroksil grubuna sahip monomerler, ve başka bir amino reaktif florofor ile sonrası modifikasyonu için bir serbest amin, sahiptirler. Reaksiyon karışımı, çevre oksijen varlığında yana RAFT aracılı polimerizasyon için zararlı olan, seviyelerini takip etmek durumunda bunun çıkarılması hali hazırda birkaç dondurularak eva ile gerçekleştirilirCuate-çözülme döngüleri yüksek vakum altında savurma tüp reaksiyon kabı korurken. Bu gerektiği gibi reaksiyonda farklı monomerin molar oranı ayarlanabilir olduğu not edilmelidir. Ayrıca, kullanılan RAFT madde miktarının değiştirilmesiyle, elde edilen polimerlerin uzunluğu 18 kontrol edilebilir. Ancak, başlatıcı RAFT ajanının buna olan molar oranı, her ürünün düşük dağıtma özelliği temin etmek için iki daha büyük olmalıdır. Bu koşullar altında, kopolimerizasyon evrimi kararlı olduğunu ve reaksiyonun tekrarlanabilirliği çok yüksektir. Yani biri nedeniyle farklı polimerizasyon hızlarına, bir istatistik kopolimer içindeki tüm katılımcı monomerlerin tamamen tekdüze dağılım elde etmesi olası değildir, söyleniyor. Polimerin içinde farklı monomerlerin dağılımı karakterize hala çok zordur. post-modifikasyon yöntemi, burada sunulan, hem daha basit ve amenabl olduğunuEtiket glycopolymers 2,11 uygulanan diğer protokollere göre floresan etiketler daha geniş bir seçim kullanımına e. Bunlar, suda çözünebilir amin-reaktif fluorophores birçok kuantum noktalar, biotins ve diğerleri içerir. Sentezlenen etiketli glycopolymers bağlayıcı özgüllükleri kolaylıkla kanıtlanabilir bilinen bağlanma ilgisi ile lektinleri kullanıyor. Hiçbir kolye şeker sahip PMA-gaema uygun bir negatif kontrolüdür. Bu yolla hazırlanan farklı floresan etiketler ile Glycopolymers başarılı bir lektin aracılı bakteriyel 14 bağlanma incelemelerinde kullanılmıştır. Görüldüğü gibi, istatistiksel olarak flüoresan glycopolymers bu basit ve etkin hazırlanması glycobiological araştırma çeşitli büyük potansiyel sağlamalıdır.

Son yirmi yılda, sentetik glycopolymers ile araştırmalar tanıma lektin 1-3 süreçleri üzerinde duruluyor araştırma dahil bulaşıcı mekanizmalar incelenmesinde önemli bir potansiyel gösteren, yavaş ama sürekli gelişmeyi uğramıştır. Multivalent şeker kısımlarını sahip sentetik glycopolymers çok daha yüksek lektin bağlayıcı etkinliklerinin sergileyen beri tek değerlikli karbonhidrat kıyasla, onlar Glikobiyoloji alanda 3 büyük talep vardır. Klinik araştırmalarda özellikle ilgi insan solunum hücre yüzeylerinde ve mukoza glikoprotein üzerinde mevcut karbonhidrat bağlanma lektin aracılığıyla bakterilerin karakterize etmek için flüoresan glycopolymers kullanılmasıdır. Erken in vitro çalışmalar bakteriyel bağlama testlerinde ticari olarak temin edilebilen poliakrilamid-bazlı glycopolymers kullanılabilir. Bu prob çeşitli sonuçlar umut verici gösterdi, ancak her ikisi de pol, obtainability ve çok-to-lot sapmaların ilgili endişelerini dileYmer molekül ağırlığı ve glycoepitope içeriği. Ekonomik bir in-laboratuar protokolü yapısı içeriğine, boyut, ve bakteriyel lektinleri hedefleme sentetik glycopolymers saflık tatmin edici bir kontrol sağlayacak geliştirildi. Glycopolymers uygun bir sentetik yaklaşıma arayışında, nispeten yeni bir polimerizasyon tekniği, tersine çevrilebilir bir ek parçalanma zincir transfer (RAFT) maddeler 4 çalışan kontrollü radikal polimerizasyon tipi kullanılarak test edilmiştir. Bu RAFT reaktifler son birkaç glycopolymer preparasyonlar 5-7 kullanılmıştır. Diğer glycopolymer hazırlanması protokolleri ile karşılaştırıldığında, RAFT aracılı polimerizasyonları, monomer yapı ve reaksiyon koşulları, sulu çözeltiler, potansiyel bir uyumluluk ve arzu edilen polimer ürünleri 8,9 küçük boyut dispersiteleri çeşitli toleransı da dahil olmak üzere birçok avantaj gösterirler. Önemli ilgi RAFT-ba hazırlanması için protokollerfarklı işlevleri 10-13 sahip olabilir, her biri farklı monomerlerin bileşimlerinin kontrol etmesine izin veren sed tri-bileşenli glycopolymers. Bununla birlikte, daha önceki araştırma çabaları iki en anomerik askılı karbonhidrat 10 yoksun ya da kullanılan çoğu kopolimerleridir istatistiki polimerlerin farklı amaçlara hizmet şekilde bağlanmış olan homopolimerler, oluşan tri-blok kopolimerleri elde polimerizasyonlar, adım olan monomer sırası kalıntıları istatistiksel kural 9-13 izleyin. Son zamanlarda, thiocarbonylthio RAFT bileşiği kullanılarak (4-siyano-pentanoik asit) sulu bir ortamda -4-dithiobenzoate, bir grubunun hazırlanması, belirli askılı şekerler ve bunların uygulama içeren, doğrusal üç-bileşenli istatistik glycopolymers RAFT tabanlı lektin-aracılı bağlanma, bakteriyel Testler 14 rapor edildi. görsel bir şekilde sunulmaktadır, bu yöntem, genel amacı, tri-bileşenini hazırlamakRAFT kontrollü kopolimerizasyonu yoluyla istatistiki flüoresan glycopolymers. Çünkü tek aşamalı bir polimerizasyon protokolünün kolaylığı nedeniyle, polimer uzunluğu ve bileşimlerinde ve reaksiyonun, yüksek tekrarlanabilirliği üzerinde tam kontrol, bu protokol hali hazırda arzu edilen yapılara sahip glycopolymers diğer RAFT tabanlı sentezlere uygulanabilir.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Reagent</strong</td></tr><tr><td>>Laktobiyonik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukonolakton&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2164</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-hidroksietil) akrilamid (HEAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>697931</td><td></td></tr><tr><td>Orange II sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O8126</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokinon monometil eter (MEHQ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54050</td><td>Polimerizasyon inhibitörü</td></tr><tr><td>N-(2-aminoetil) metakrilamit hidroklorür (AEMA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24833-5</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-616</td><td></td></tr><tr><td>Anyon değiştirici reçine IRN-78 hidroksit formu, 80 ağ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10343-U</td><td></td></tr><tr><td>Katyon değişim reçinesi 50Wx8, 200 ağ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>217514</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum oksit, ~ 150 ağ ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1522</td><td>Tip WN-6, Nötr, Aktivite Sınıfı Süper</td></tr><tr><td>I Ninhidrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4876</td><td>Testte %0.2 ninhidrin içeren bir etanol çözeltisi kullanıldı</td></tr><tr><td>4-Siyano-4- (fenilkarbonotiyoylio) pentanoik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>722995</td><td>RAFT ajanı</td></tr><tr><td>4,4 ve asal; - Azobis (4-siyanovalerik asit)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>11588</td><td>Polimerizasyon başlatıcısı</td></tr><tr><td>Karboksifloresein süksinimidil ester & nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Erythrina Cristagalli lektin kaplı agaroz boncuk</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>AL-1143&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solvent</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>Barnstead su arıtma sistemi tarafından üretilmiştir, 18 megOhm-cm</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461-4</td><td>ACS sınıfı veya daha iyisi</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>ACS sınıfı veya daha iyisi</td></tr><tr><td>Mutlak etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td>ACS sınıf veya daha iyi</td></tr><tr><td>Dimetilformamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705</td><td>ACS sınıfı veya daha iyisi</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>ACS sınıfı veya daha iyisi</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Diyaliz membranı (MWCO: 3,500)</td><td>Spectrum Labs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol analitik standart standardı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O2393</td><td></td></tr><tr><td>Schlenk tüp, 1 ml</td><td>Quark Cam</td><td></td><td>Özelleştirilmiş</td></tr><tr><td>TSK-GEL G4000 PWxl&nbsp;</td><td>Tosoh Biyobilim&nbsp;</td><td>8022</td> GPC/SEC paketi ile Empower 3 <td>glikopolimerlerinin GPC analizi için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Alliance HPLC sistemi&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td>Kırılma indisi dedektörü (Waters 2414) ve floresan dedektörü (Waters 2475) ile donatılmıştırAvance</td></tr> <tr><td>III 800 MHz NMR Spektrometresi</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX43 floresan mikroskobu</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Glikopolimer bağlanma testinde FITC filtresi ile kullanılır</td></tr><tr><td>Rotavap / Rotoevaporatör</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fritted disk hunisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-109</td><td></td></tr><tr><td>Liyofilizatör</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İmmünofloresan mikroskop slayt</td><td>Polysciences</td><td>18357-1</td><td></td></tr><tr><td>Revco Ultima Plus -80&nbsp; &#176; C Dondurucu</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik Vakum Torbası ve El Pompası</td><td>Ziploc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakum Pompası, Doğrudan Tahrik, Maxima C Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakum Ölçer</td><td>Sargent-Welch</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

raft kontrollü polimerizasyon yoluyla tri-bileşenli floresan glycopolymers uyduruk ve etkin hazırlık

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

Sentetik glycopolymers çeşitli biyokimyasal ve biyomedikal araştırma alanlarında kullanılan enstrümantal ve çok yönlü araçlardır. Döner ilaveli parçalanma zincir transfer kullanılarak, iyi kontrol edilen floresan istatistik glycopolymers bir basit ve etkin sentezinin bir örneği (RAFT) tabanlı polimerizasyon gösterilmiştir. (2-aminoetil) metakrilamit (AEMA) - sentez lactobionolactone ve N reaksiyonu ile elde edilen β-galaktoz içeren glycomonomer 2-lactobionamidoethyl metakrilamid hazırlanması ile başlar. 2-Gluconamidoethyl metakrilamid (gaema) bir terminal β-galaktoz içermeyen bir yapısal analogu olarak kullanılır. (2-hidroksietil) ara parçası olarak akrilamid, AEMA fazla flüoresan etiketleme için bir hedef olarak ve glycomonomers - N: Aşağıdaki RAFT aracılı kopolimerizasyon reaksiyonu, üç farklı monomer içerir. Sulu sistemlerin Toleranslı, reaksiyonda kullanılan RAFT madde (4-siyano-pentanoik asit) -4-dithiobenzoate olup.Düşük dispersities (≤1.32), tahmin edilebilir bir kopolimer bileşimleri ve polimerizasyon yüksek bir tekrarlanabilirliği ürünleri arasında gözlenmiştir. Floresan polimerler AEMA birincil amin fonksiyonel grupları hedefleyen carboxyfluorescein süksinimidil ester ile glycopolymers değiştirerek elde edilir. Ortaya çıkan glycopolymers lektin bağlayıcı özgüllükler belirli glycoepitope tanıyan lektinlerin kaplanmış gelen agaroz boncuklarla test ederek doğrulanır. Arzu edildiği için sentez kolaylığı, ürün bileşimlerinin sıkı bir kontrol ve reaksiyonun iyi bir tekrarlanabilirlik, bu protokol, özel yapılar ve kompozisyonlar diğer RAFT bazlı glycopolymers hazırlanmasına yönelik tercüme edilebilir.

Glycomonomer sentezi Laktobionik asid glycomonomers hazırlanması için örnek olarak, burada kullanıldı. LAEMA 11 sentezi üzerine ilk raporunda yöntemleri kullanarak, yetersiz saflık ile hazırlık çeşitli verimler gözlendi. katyon ve anyon değişim reçineleri kullanılarak tadil edilmiş bir saflaştırma yöntemi, 1 H ve 13C NMR spektroskopisi (Şekil 1) ile teyit edilir stabil bir ürün verimi ve yüksek saflıkta sunulan reaksiyona girmemiş başlangıç ​​malzemesinin ayrılması için. RAFT glycopolymer sentezi ve fluorophores glycopolymers sonrası modifikasyonu Basamaklı RAFT polimerizasyonlar ile hazırlanan blok glycopolymers aksine, bu tek-aşamalı bir kopolimerizasyon protokolü polimer omurgası boyunca muntazam glycomonomer dağılımını sağlar. Burada gösterilen glycopolymers gl% 20 mol içerenycomonomer, bir ara parçası olarak heaa 77 mol% &#39;si, ve post-modifikasyon (bakınız Şekil 2). 1 H ve13C-NMR spektroskopisi için bir hedef olarak AEMA bölgesinin% 3 mol PMA-LAEMA ve PMA-gaema yapılarını teyit (Şekil 3 ve 4). Şekil 5&#39;te gösterildiği gibi, RAFT sentezlenmiştir glycopolymer GPC elüsyon profilleri karşı çizilen olduğunda PMA-LAEMA ve PMA-gaema hem RAFT yaklaşımın etkisini kanıtlayan düşük dispersities sahiptir. Beklendiği gibi, PMA-gaema nedeniyle kolye şeker PMA-gaema eksikliği PMA-LAEMA daha n küçük bir M vardır. Karbonhidrat ve RAFT glycopolymers içeriği primer amin fonksiyonel grupların analizi ürünün glycopolymers monomerlerin oranı RAFT aracılı polimerizasyon reaksiyonu (Tablo 1) &#39;de kullanılan monomerlerin başlangıç ​​stoikiometrik oranı ile tutarlı olduğunu göstermiştir. Bu monomer Compositio sıkı bir denetim anlamınans sentezlenen glycopolymers olarak, tasarlandığı şekilde. Aktive fluorophores birincil amin fonksiyonel grupların reaksiyonu proteini etiketlemede bir yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu teknik karboksifloresan ile saflaştırılmış glycopolymers etiketlemek için buraya istihdam edildi. Sonrası modifikasyon sonrasında, floresan polimerler (Şekil 6) elde edildi. Reaksiyonunda floresein-işaretli polimerlerin hiçbir bozulma GPC analizi ile tespit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). Lektin kaplı agaroz boncuklar ile sentetik glycopolymers bağlanma testi Deneylerde kullanılan sentez glycopolymers lektin bağlama spesifitesi değerlendirmek için, bilinen bir karbohidrat bağlanma spesifikliği olan lektin kaplı agaroz boncuklar kullanıldı. Erythrina krista-galli lektin (ECL), β-D-galaktosid doğru bağlama özgünlüğüne sahiptir. Şekil 7A, açıkça PMA-LAEMA-Fl gösterirBir kolye karbonhidrat olarak β-D-galaktoz içeren uorescein, ECL lektin ile bağlanma güçlü sergiledi. Bunun aksine, bir asılı şeker sahip değildir glycopolymer PMA-gaema-Floresein, bir ECL bağlanmasının negatif Şekil 7B &#39;de gösterilmiştir. Bu sonuç, sentezlenen flüoresan glycopolymer bağlanma etkinliği ve afinitesi örnek teşkil etmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig1.jpg" /> Atanan Şekil 1. 1H (a) ve LAEMA için 13C-NMR (b) spektrumları (D 2 O). (Bu rakam Wang modifiye edilmiş ve ark. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig1large.jpg" target="_blank">, bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız rakam.</a> &lt;keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt;: fo p class = &quot;jove_content&quot; <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52922/52922fig2.jpg" /> Şekil 2. kolye şeker gibi β-galaktoz içeren floresan glycopolymer PMA-LAEMA sentezinin şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52922/52922fig3.jpg" /> 1 H- (A) ve 13C-NMR PMA-LAEMA glycopolymer (B) spektrumları (D 2 O). (Bu şekil Wang modifiye edilmiş ve ark., 14) atanan Şekil 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig3large.jpg" target="_blank">Ricası</a>se, bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52922/52922fig4.jpg" /> Atanan Şekil 4. 1H (A) ve 13C-NMR PMA-gaema için (B) spektrumları (D 2 O). (Bu rakam Wang modifiye edilmiş ve ark. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">büyük halini görmek için tıklayınız Bu rakamın.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52922/52922fig5.jpg" /> RAFT merkezli PMA-gaema ve PMA-LAEMA Şekil 5. Jel geçirgenlik kromatografisi izleri ve RAFT ajanı kullanmadan hazırladı. RAFT ajanı (mavi) olmadan hazırlanan PMA-LAEMA, RAFT- aksine<html> göre PMA-LAEMA (yeşil) (M M n / a) çok daha düşük bir dağıtma özelliği vardır. RAFT merkezli PMA-gaema (kırmızı) ve PMA-LAEMA benzer GPC profilleri var, ama eski nedeniyle herhangi bir kolye şekerlerin yokluğu küçük Mn sahiptir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52922/52922fig6.jpg" /> Önce ve fluorofor ile sonrası modifikasyon sonrasında Şekil 6. PMA-LAEMA. (A), beyaz bir etiketli olmayan glycopolymer (sol boru) ile karşılaştırıldığında, fluoresein etiketli PMA-LAEMA güçlü san bir renk (sağdaki tup) görülmektedir. UV, etiketli olmayan PMA-LAEMA (PBS içinde sol boru, 1 mg / ml) altında (B), fluoresan etiketli PMA-LAEMA ise (PBS içinde doğru tüp, 1 mg / ml), gösterir karanlık ve bir floresan ile sunulur güçlü yeşil floresan.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52922/52922fig7.jpg" /> Şekil 7. Erythrina krista-galli lektin (ECL) kaplı agaroz boncuklar glycopolymers içeren β-D-galaktoz bağlanan, ve bir asılı şeker sahip olmadığını göstermiştir. (A) PMA-LAEMA-Floresein (3 ug) ECL ciltleme güçlü olduğunu gösterdi herhangi bir askılı β-D-galaktozid artığı sahip (B) PMA-gaema-Floresein, oysa, bir lektin kaplanmış boncuklarla bağlanma gösterdi. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Tablo 1. Hedefleme sentetik parametreleri ve glycopolymers gerçek kompozisyonlar bir değerler. A) değerleri Hedefleme değerleri buürünleri arzu edilir; b) DP, Polimerizasyon derecesi; c) NA, mevcut değildir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody style="vertical-align:middle;text-align:center"><tr><td style="width:120px"></td><td style="width:40px"> DP b </td><td style="width:70px"> Dispersitesi </td><td style="width:120px"> Glycomonomers gerçek içeriği % mol </td><td> Primer amin gerçek içeriği % mol </td></tr><tr><td> Değerleri Hedefleme </td><td> 100 </td><td> &lt;1.3 </td><td> 20 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> PMA-LAEMA </td><td> 99 </td><td> 1.26 </td><td> 19 </td><td> 3.2 </td></tr><tr><td> PMA-GAEMA </td><td> 89 </td><td> 1.32 </td><td> NA c </td><td> 2.7 </td></tr></tbody></table>

Glikomonomer hazırlama, kopolimerizasyon ve modifikasyon sonrasından oluşan RAFT bazlı floresan glikopolimerlerin verimli, üç aşamalı bir sentezi gösterilmiştir. Bu protokol, istenen yapılara sahip RAFT bazlı istatistiksel glikopolimerleri hazırlamak için kullanılabilir.

RAFT kontrollü Polimerizasyon yoluyla Tri-bileşenli Floresan Glycopolymers uyduruk ve Etkin Hazırlık

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

Bu prosedürün genel amacı, tersinir toplama parçalanma zincir transferi veya RAFT polimerizasyonu kullanarak floresan istatistiksel lineer glikopolimerlerin iyi kontrollü sentezini gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle gliko monomer olan 2-laktobio etil metakrilamid veya L-A-E-M-A sentezlenerek gerçekleştirilir. İkinci adım, karşılık gelen düşük dispersiteli glikopolimeri sentezlemek için L-A-E-M-A, 2-amino etil metakrilamid veya AEMA ve N-2-hidroksietil akrilamid veya HEAA'nın RAFT polimerizasyonunu kullanmaktır.Ardından, floreseinli bir gliko polimer üretmek için, gliko polimerin primer aminlerinden biri karboksifloresein xito middle ester ile reaksiyona sokularak modifiye edilir. Son adım, floreseinli gliko polimerin, bilinen karbonhidrat bağlama spesifikliğine sahip lektin kaplı agarose boncuklara bağlanmasıdır. Son olarak, gliko polimerlerin agarose boncuklara bağlanmasını analiz etmek için floresan mikroskobu kullanılır; böylece gliko polimerin hedeflenen karbonhidrata sahip olduğu ve floresan bir etiketle işaretlendiği doğrulanır.RAF polimerizasyonunun, geleneksel serbest radikal polimerizasyonlarını kullanan mevcut yöntemlere göre avantajı, bu sürecin başlatıcı kaynaklı zincir sayısını minimize eden kontrollü bir polimerizasyon tekniği olmasıdır. Bu durum, önceden belirlenmiş moleküler ağırlıklara ve çok dar polidispersite indeksine sahip polimerlerle sonuçlanır. Belirli floresan glikopolimerlerin hazırlanması için polimerizasyonlar, tanımlanmış monomer karışımlarına uygulanabilir.Bu glikopolimerler, lektin kaplı boncuklar kullanılarak doğrulanabilen tanımlanmış bağlanma yeteneklerine sahiptir. Floresan glikopolimerlerin verimli bir şekilde hazırlanmasının, gelecekte glikobiyoloji araştırmaları için büyük değer taşıyacağı kanıtlanmalıdır. Başlamak için, iki gram laktobiyonik asidi üç mililitre susuz metanolden içinde çözün.Ardından, çözelti bulanıklaşana kadar yavaşça damla damla absolut etanol ekleyin. Tüm çözücüleri uzaklaştırmak için döner evaporatör kullanın. %98 verimle 1,94 gram lacto bioo one five lactone elde etmek için bu işlemi üç kez tekrarlayın.Bir gram lakto biyolaktonun üç mililitre metanoldeki çözeltisini, A EMA ve MEHQ'nun iki mililitre metanoldeki çözeltisine ekleyin. Ardından, bir mililitre trietilamin ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında karıştırın. 48 saat sonra, karışıma 20 mililitre deiyonize su ekleyin ve karışımı bir döner evaporatöre aktarın.Tamamen kuruyana kadar buharlaştırın. Kalıntıyı 20 mililitre deiyonize su içinde çözün ve çözeltiyi 10 x 20 milimetrelik bir anyon değişim kolonunun üst kısmına uygulayın. Çıkışın altına bir miligram MEHQ içeren bir beher yerleştirin ve kolonu behere elüye edin.Çözelti döner evaporatörde uçurulduktan sonra, kalıntıyı 20 mililitre deiyonize su içinde çözün ve bir miligramlık iyon değişim reçinesi porsiyonları ekleyin. İnce tabaka kromatografisi plakasına çözeltiden bir mikrolitre alınıp uygulanarak gerçekleştirilen bir hidran testi negatif sonuç verene kadar bu işleme devam edin. Plakayı, etanolde %2'lik bir anhy çözeltisi ile püskürtün ve bir sıcak plaka üzerinde 90 °C'de bir dakika boyunca ısıtın.Mavi renk oluşmadığında bitiş noktasına ulaşılmış demektir. Ardından, çözeltiyi sinterli cam huni aracılığıyla bir deney tüpüne filtreleyin. Çözeltiyi -80 °C'de dondurun ve ardından liyofilize etmek üzere bir liyofilizatöre aktarın.Kalıntıyı minimum miktarda metanol içinde çözün ve -20 °C'ye soğutulmuş susuz aseton ekleyerek ürünü çöktürün. Çökelen L-A-E-M-A'yı fritli cam huni aracılığıyla filtrasyonla toplayın. Huniyi ve çökeleği kurutmak üzere vakumlu bir desikatöre aktarın; ardından iki mililitrelik bir test tüpü içerisinde bir mililitre ticari grade HEAA'ya yaklaşık 150 mesh alüminyum oksit nanoparçacıklarının 0,5 g'ını ekleyin.Tüpü 300 ×g hızda 30 saniye boyunca santrifüjleyin ve üst katmanı inhibitör içermeyen HEAA olarak dikkatle kullanın; 32,8 mg L-A-E-M-A, 1,7 mg α-EMA, 27,5 µL inhibitör içermeyen HEAA ve 0,4 mL deiyonize suyu dikkatlice çözün ve çözeltiyi iyice temizlenmiş 1 mL'lik bir flask tüpe aktarın. Ardından, tüpe 50 µL RAFT reaktifi ve 50 µL başlatıcı reaktifi ekleyin ve valf kapalıyken tüpün yanına hafifçe vurarak karıştırın. Tüpü bir vakum hattına bağlayın ve içeriği kuru buz etanol banyosu kullanarak dondurun.Ardından, bir pompa yardımıyla tüp basıncını 50 millitorr seviyesine düşürün ve vanayı kapatın. Kuru buz banyosunu kaldırın ve içeriğin çözülmesine izin verin. Dondurma, vakumlama ve çözdürme döngüsünü dikkatli bir şekilde iki kez daha tekrarlayın.İçeriğin tamamen çözündüğünden emin olmak için tüpü kontrol edin ve gerekirse hafifçe vorteksleyin. Yerleştirmeden önce, kapalı tüpü vakum hattından çıkarın ve şeffaf plastik bir vakum torbasına yerleştirin. Plastik bir el pompasıyla torbadaki havayı boşaltın.Ardından torbayı 70 °C'ye ayarlanmış kapalı bir su banyosuna yerleştirip 24 saat bekletin. Daha sonra tüpü torbadan çıkarın ve içeriğini 3.500 Dalton moleküler ağırlık kesim değerine sahip bir diyaliz torbasına aktarın. Diyaliz torbasını bir behere yerleştirin ve iki litre deiyonize su ile 24 saat boyunca diyalize edin.Diyaliz torbası içeriğini bir test tüpüne aktarın ve -80 °C'deki bir dondurucuya yerleştirin. Donduktan sonra bir liyofilizatöre aktarın ve dondurarak kurutun. Pamuksu beyaz gliko polimer PMA LA EMA elde etmek için, önce 0,9 mL PBS içinde beş mg PMA LA EMA çözeltisi hazırlayın.Ardından, 100 µL dimetilformamid içerisinde çözünmüş 0,6 mg karboksiflorescein cin, middle eter'i hızla karıştırılan çözeltiye yavaşça ekleyin; mikrotüpü folyo ile sarın ve oda sıcaklığında 16 saat boyunca yavaşça karıştırın, ardından çözeltiyi 3.500 Dalton moleküler ağırlık kesim değerine sahip bir diyaliz torbasına aktarın. Torbayı bir behere yerleştirin ve ışıktan koruyarak iki litre deiyonize suya karşı 16 saat boyunca diyaliz edin. Diyaliz torbasının içeriğini bir test tüpüne aktarın.Çözeltiyi -80 °C'de dondurduktan sonra liyofilize edin. Süngerimsi sarı floresan etiketli P-M-A-L-A-E-M-A glikopolimerini elde etmek için, glikopolimerlerin sayı ortalama molekül ağırlığını, ağırlık ortalama molekül ağırlığını ve dispersitesini bir HPLC sistemi ile belirleyin. İlk olarak, santrifüj tüpündeki 50 µL erythrina cristagallii lectin kaplı aro bead süspansiyonuna 1,5 mL PBS ekleyin.Ardından tüpü 1 dakika boyunca 300 ×g'de santrifüj edin. Daha sonra süpernatantı uzaklaştırın ve son olarak 0,5 mL PBS eklemeden önce yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Lektin kaplı boncukları içeren tüpe, 6 µL PBS içinde 3 µg floresein işaretli PMA LA EMA çözeltisi ekleyin.Negatif kontrol olarak floresein işaretli P-M-A-G-A-E-M-A kullanın. Ardından, tüpleri folyoya sarın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Tüpü bir dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın.Ardından, boncukları 1,5 milliliters taze PBS içinde yeniden süspande edin ve yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Son olarak, boncukları 0,2 milliliters PBS içinde yeniden süspande edin. Süspande edilen boncuklardan dört mikrolitreyi bir immunofloresan mikroskop lamındaki kuyuya aktarın. Lamı kapatın ve bir cam kapatma lamı ile örtün; ardından kayıt yapın.10 x objektifli FITC filtresi ve kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanılarak lamın görüntüleri alınmıştır. Gliko polimerler, jel geçirgenlik kromatografisi ile analiz edilmiştir. RAFT kullanmadan sentezlenen polimerler, RAFT kullanılarak yapılanlara göre çok daha yüksek bir dağılıma sahiptir.Floresein ile işaretlendiğinde, gliko polimerin fiziksel görünümü beyazdan, UV ışığı altında görülen güçlü bir sarı renge dönüşür. İşaretlenmemiş polimer çözeltisi koyu kalırken, floresein ile işaretlenmiş polimer parlak yeşil renkte parlayarak işaretin varlığını doğrular; lektin kaplı boncuklara özgül bağlanma yalnızca sarkan şeker kalıntıları taşıyan polimerlerle gerçekleşir. Sarkan şeker kalıntıları taşımayan polimerlerle işlem gördüklerinde boncuklar koyu kalırken, bağlandıklarında yeşil renkte parlarlar. RAFT tabanlı bu polimerizasyon tekniği, sentezlenebilecek gliko polimer türleri açısından büyük esneklik sağlar.Glikopolimerlerin sonraki etiketlemesi, sulu bir ortamda primer aminlerle reaksiyona girebilen çok çeşitli floresan reaktiflerle de gerçekleştirilebilir. Glikobiyoloji alanındaki araştırmacılar, oldukça çok yönlü ve tanımlı glikopolimerleri kolayca elde etmek için bu tekniği kullanabilirler. Bu glikopolimerler; kistik fibrozis hastalarının solunum yollarında gözlenenler veya birçok insan kanseri türünde yer alanlar gibi, karbonhidrat bağlanma spesifisitelerini araştırmak için araçlar olarak kullanılabilir.

facile-efficient-preparation-tri-component-fluorescent-glycopolymers

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Burada doku mühendisliği için farklı katmanları arasında sürekli arabirimleri ile biyouyumlu, katmanlı matrisler oluşturmak için benzersiz bir strateji belirlemelidir. Böyle bir iskele çeşitli biyolojik, kimyasal ya da mekanik yardımlar yaparak hücre davranışı modüle ideal özelleştirilebilir ortamı...

Yoğunluk Gradient Katmanlı Polimerizasyonu (DGMP): Multi-bölmesi oluşturma için A Novel Tekniği, Doku Mühendisliği için Özelleştirilebilir İskelesi

Laboratuvarımız iyi hücre fonksiyonu üzerinde doku sertliği modüle etkilerini anlamak için DNA çapraz bağlı poliakrilamid hidrojeller, dinamik bir hidrojel sistemi geliştirdi. İşte, bu hidrojeller hazırlamak için şemaları, açıklamaları ve protokolleri sağlamak.

DNA çapraz bağlı poliakrilamid hidrojellerinin hazırlanışı

Hızla dev polimer vezikülleri (pGV'ler) oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Kısaca polimer çözeltileri, lamellere yapıştırılan kurutulmuş agaroz filmler üzerinde dehidre edilir. Polimer filmlerin rehidrasyonu, hızlı pGV oluşumuna neden olur. Bu yöntem, biyomimetik çalışmalarda doğrudan uygulamalar için sentetik dev veziküllerin hazırlanmasını büyük ölçüde ilerletmektedir.

Jel destekli rehidrasyon kullanma Dev boyutlu Polymersomes Şekillendirme

Bu makale, görünür ışık aracılı dispersiyon polimerizasyonu kullanılarak polimerik kendi kendine monte nanopartiküller üretmek için bir süreci açıklamaktadır. Polimerizasyonu kontrol etmek için düşük enerjili görünür ışığın kullanılması, yüksek katı madde içeriğinde kendi kendine monte edilen solucan benzeri misellerin tekrarlanabilir oluşumuna izin verir.

Photoredox Katalizörü kullanarak görünür ışık aracılığı ile dispersiyon polimerleştirilmesi ile solucan gibi miseller Facile sentezi

Sigara karıştırıldı çökelti polimerizasyonu uyaranlara duyarlı poli (N -isopropylacrylamide) dar bir boyut dağılımı mikrojelleri sentezi için hızlı, kopyalanabilir bir prototip bir yaklaşım sağlar. Bu protokol sentezinde, ışık saçılması karakterizasyonu ve geniş alan mikroskopisi kurulumunda bu mikrojellerin tek parçacık floresan izleme gösterilmiştir.

Kontrollü Sentezi ve yüksek Düzgün Poli Floresan Takibi (<em&gt; K</em&gt; -isopropylacrylamide) Mikrojeller

Hücre ve ilaç iletimi için cihazlar olarak RGD ile işlevselleştirilmiş hidrojellerin sentezi için bir protokol sunuyoruz. Prosedür, alkin ile modifiye edilmiş poliakrilik asit (PAA) ile bir RGD-azid türevi arasında bakır katalizli alkin-azid siklo ilavesini (CuAAC) içerir. Hidrojeller, mikrodalga destekli polikondensasyon kullanılarak oluşturulur ve fizikokimyasal özellikleri araştırılır.

Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

İletişim kuralları hydrazone toplu ölçek, microscale ve Nano, ikincisi jel nano tanecikleri ve nanofibers hazırlanması için polimer reaksiyonlar, cross-linking göre parçalanabilir thermoresponsive hydrogels imalatı için açıklanmıştır.

Parçalanabilir Thermoresponsive Hydrogels birden fazla uzunluğu ölçeklerde yolu ile reaktif ekstrüzyon, havacilik, kendinden montajlı imalatı ve Electrospinning

sentez ve tek molekül düzeyinde halkalı polimerlerin uzadıya hareket karakterizasyonu için bir protokol sunulmuştur.

Tek Molekül Düzeyde Halkalı Polimerlerin Sentezi ve eritin Devlet Onların Pasif Hareket Karakterizasyonu

Burada, biz hazırlamak ve ikincil yapılar görselleştirmek için bir protokol mevcut (örneğin, lifler, toroid mimariler ve nano-küreler) sarmal polikarbodiimidler türetilmiş. Her iki atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile karakterize morfoloji moleküler yapı, konsantrasyon ve seçim çözücü bağlı olduğu gösterilmiştir.

Sarmal polikarbodiimidden Kopolimer ve Bunların Triazole Türevleri elde edilen kendinden montaj morfolojileri

Tamamlayıcı reaktif gruplara sahip mikrojel çubuklar, sulu çözeltide birbirine bağlanma kabiliyetine sahip mikroakışkanlar yoluyla üretilir. Anizometrik mikrojeller, küresel tabanlı sistemlere kıyasla daha büyük gözeneklere sahip kararlı yapılara sıkışır ve birbirine bağlanır. GRGDS-PC ile modifiye edilmiş mikrojeller, hücre kültürü için kullanılabilecek makrogözenekli 3D yapılar oluşturur.

Mikrojel Çubuklardan Birbirine Bağlı Makrogözenekli 3D İskeleler

Keşfedin RAFT polimerizasyonu ile floresan glikopolimer sentezini. Bu yöntem, düşük dispersiteli polimerler üreterek glikobiyoloji araştırmalarında karbonhidrat etkileşimlerini incelemek için değerli araçlar sunar.

RAFT kontrollü Polimerizasyon yoluyla Tri-bileşenli Floresan Glycopolymers uyduruk ve Etkin Hazırlık

Daha fazla video keşfet