RAFT kontrollü Polimerizasyon yoluyla Tri-bileşenli Floresan Glycopolymers uyduruk ve Etkin Hazırlık

Bu prosedürün genel amacı, tersinir ekleme parçalanması, zincir transferi veya sal polimerizasyonu kullanılarak floresan istatistiksel doğrusal gliko polimerlerinin iyi kontrollü sentezidir. Bu, önce gliko monomerinin iki lakto biyo etil meth akrilamid veya LAE, MMA'nın sentezlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, karşılık gelen düşük dağılımlı gliko polimeri sentezlemek için L-A-E-M-A-N iki amino etil meth akrilamid veya A EMA ve N iki hidroksietil akrilamidin veya bir GAA'nın sal polimerizasyonunu kullanmaktır.

Daha sonra, gliko polimeri, floreseinli bir gliko polimeri üretmek için karboksi floresein xito orta ester ile reaksiyona sokularak birincil aminlerinden biri üzerinde modifiye edilir. Son adım, floresein doğal gliko polimerini, bilinen karbonhidrat bağlama özgüllüğüne sahip lektin kaplı arose boncuklarına bağlamaktır. Sonuç olarak, floresan mikroskobu, gliko polimerlerinin ortaya çıkan boncuklara bağlanmasını analiz etmek için kullanılır, bu da gliko polimerinin ilgilenilen karbonhidrata sahip olduğunu ve bir floresan etiketi ile etiketlendiğini doğrular.

RAF polimerizasyonunun konvansiyonel serbest radikal polimerizasyonlarını kullanan mevcut yöntemlere göre avantajı, gazap işleminin, başlatıcıdan türetilen zincirlerin sayısını en aza indiren bir kontrol polimerizasyon tekniği olmasıdır. Bu, önceden belirlenmiş moleküler ağırlıklara sahip polimerler ve çok dar poli dispersite rafı ile sonuçlanır. Polimerizasyonlar, spesifik floresan gliko polimerlerinin hazırlanması için tanımlanmış bir monomer karışımına uygulanabilir.

Bu gliko polimerleri, lektin kaplı boncukların kullanılmasıyla doğrulanabilen tanımlanmış bağlanma yeteneklerine sahiptir. Floresan gliko polimerlerinin verimli bir şekilde hazırlanması, gelecekte gliko biyolojisi araştırmaları için büyük değer taşımalıdır. Başlamak için, iki gram lakto biyonik asidi üç mililitre susuz metanol içinde çözün.

Daha sonra, bulanıklaşana kadar çözeltiye yavaşça mutlak etanol ekleyin. Tüm çözücüleri çıkarmak için döner bir buharlaştırıcı kullanın. % 98 verimle 1.94 gram lakto bioo bir beş lakton üretmek için bu işlemi üç kez tekrarlayın.

İki mililitre metanol içinde bir A EMA ve MEHQ çözeltisine üç mililitre metanol içinde bir gram lakto biyo lakton çözeltisi ekleyin. Daha sonra, bir mililitre trietilamin ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında karıştırın. 48 saat sonra, karışıma 20 mililitre deiyonize su ekleyin ve döner bir buharlaştırıcıya aktarın.

Tamamen kuruyana kadar buharlaştırın. Kalıntıyı 20 mililitre deiyonize suda çözün ve çözeltiyi 10 x 20 milimetrelik bir anyon değişim kolonunun üstüne uygulayın. Çıkışın altına bir miligram MEHQ içeren bir beher yerleştirin ve sütunu behere boşaltın.

Çözeltiyi döner bir buharlaştırıcıda çektikten sonra, kalıntıyı 20 mililitre deiyonize su içinde çözün ve bir miligram iyon değişim reçinesi ekleyin. Bir hidrant testi negatif olana kadar, hidrant testlerinde çözeltinin bir mikrolitresi çıkarılarak ve ince bir tabaka kromatografi plakasına uygulanarak gerçekleştirilir. Plakaya etanol çözeltisinde% 2 ani püskürtün ve sıcak bir plaka üzerinde bir dakika boyunca 90 santigrat derecede ısıtın.

Mavi renk oluşmadığında son noktaya ulaşılmıştır. Daha sonra, çözeltiyi fritli bir cam huniden bir test tüpüne süzün. Çözeltiyi eksi 80 santigrat derecede dondurun ve ardından dondurularak kurutulmak üzere bir liyofilizatöre aktarın.

Kalıntıyı minimum miktarda metanol içinde çözün ve eksi 20 santigrat derece ve susuz aseton ekleyerek ürünü çökeltin. Çökelmiş L-A-E-M-A'yı fritli bir cam huniden süzülerek toplayın. Huniyi aktarın ve önce yaklaşık 150 gözenekli alüminyum oksit nanopartiküllerinin 0.5 gramında iki mililitrelik bir test tüpünde bir mililitre ticari sınıf HEAA'ya kurutmak için bir vakumlu kurumaya çökeltin.

Tüpü 30 saniye boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin ve üst tabakayı inhibitör içermeyen HEAA olarak kullanın, 32.8 miligram L-A-E-M-A, 1.7 miligram EMA ve 27.5 mikrolitre inhibitörsüz HEAA ve 0.4 mililitre deiyonize suyu dikkatlice çözün ve çözeltiyi iyi temizlenmiş bir mililitrelik yan tüpe aktarın. Daha sonra, tüpe 50 mikrolitre sal reaktifi ve 50 mikrolitre başlatıcı reaktif ekleyin ve valf kapalıyken tüpün yan tarafına hafifçe vurarak karıştırın. Tüpü bir vakum hattına bağlayın ve içeriği kuru bir buz etanol banyosu kullanarak dondurun.

Daha sonra tüp basıncını bir pompa ile 50 militorr'a kadar düşürün ve vanayı kapatın. Kuru buz banyosunu çıkarın ve içindekilerin çözülmesine izin verin. Dondurma, vakum ve çözülme döngüsünü iki kez daha dikkatli bir şekilde tekrarlayın.

İçeriğin tamamen çözüldüğünden emin olmak için tüpü inceleyin ve gerekirse hafifçe girdap yapın. Oturmadan önce kapalı tüpü vakum hattından çıkarın ve şeffaf plastik bir vakum torbasına koyun. Torbadaki havayı plastik bir el pompası ile boşaltın.

Ardından torbayı 24 saat boyunca 70 santigrat derecede kapalı bir su banyosuna koyun. Daha sonra, tüpü torbadan çıkarın ve içeriğini 3.500 Dalton'luk bir moleküler ağırlık kesimi olan bir diyaliz torbasına aktarın. Diyaliz torbasını bir behere koyun ve 24 saat boyunca iki litre deiyonize suya karşı diyalize edin.

Diyaliz torbası içeriğini bir test tüpüne aktarın ve eksi 80 santigrat derecede bir dondurucuya koyun. Dondurulduktan sonra bir liyofilizatöre aktarın ve dondurarak kurutun. Kabarık beyaz gliko polimeri PMA LA EMA'yı elde etmek için önce 0.9 mililitre PBS'de beş miligram PMA LA EMA'lık bir çözelti hazırlayın.

Daha sonra, hızla karıştırılan çözeltiye, mikro tüpe ve folyoya yavaşça 0.6 miligram karboksi floresein cin, 100'de orta eter, mikrolitre dimetilformamid ekleyin ve oda sıcaklığında 16 saat boyunca yavaşça karıştırın, çözeltiyi bir diyaliz torbasına aktarın. moleküler ağırlığı 3.500 Dalton'dur. Torbayı bir behere yerleştirin ve ışıktan koruyarak 16 saat boyunca iki litre deiyonize suya karşı diyalize edin. Diyaliz torbası içeriğini bir test tüpüne aktarın.

Çözeltiyi eksi 80 santigrat derecede dondurduktan sonra dondurarak kurutun. P-M-A-L-A-E-M-A, gliko polimeri etiketli kabarık sarı floresanı elde etmek için, bir HPLC sistemi ile gliko polimerlerinin ortalama moleküler ağırlığını, ağırlığını, ortalama moleküler ağırlığını ve dağılımını belirleyin. İlk olarak, 1.5 mililitre PBS'de, bir santrifüj tüpünde 50 mikrolitrelik bir ery Krista mutfak lektin kaplı aro boncuk süspansiyonuna.

Daha sonra tüpü bir dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı atın ve son olarak 0,5 mililitre PBS eklemeden önce yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Lektin kaplı boncukları içeren tüpe altı mikrolitre PBS içinde PMA LA EMA etiketli üç mikrogram floresein çözeltisi ekleyin.

Negatif kontrol olarak P-M-A-G-A-E-M-A etiketli floresein kullanın. Daha sonra, tüpleri folyoya sarın ve bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Tüpü bir dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Daha sonra tekrar edin, boncukları 1,5 mililitre taze PBS'ye süspanse edin ve yıkamayı üç kez tekrarlayın. Son olarak, reus boncukları 0.2 mililitre PBS içinde askıya alır Asılı boncukların dört mikrolitresini bir immünofloresan mikroskobunun kuyusuna aktarın. Kaydırın ve bir cam kapak kayma kaydı ile örtün.

10 x objektif FITC filtresi ve kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanılarak slaytın görüntüleri. Gliko polimerler jel geçirgenlik kromatografisi ile analiz edildi. Sal kullanılmadan sentezlenen polimerler, sal kullanılarak yapılanlardan çok daha yüksek bir dağılıma sahiptir.

Floresein ile etiketlendiğinde, gliko polimerinin fiziksel görünümü beyazdan UV ışığı altında gösterilen güçlü bir sarı renge dönüşür. Etiketlenmemiş bir polimer çözeltisi karanlık kalırken, floresein etiketli polimer parlak yeşil renkte yanar, lektin kaplı boncuklara etikete özel bağlanma yalnızca asılı şeker kalıntıları taşıyan polimerlerde meydana gelir, boncuklar bağlandığında yeşil renkte yanarken, kolye şeker kalıntıları olmayan polimerlerle işlendiğinde koyu kalırlar. Bu sal bazlı polimerizasyon tekniği, sentezlenebilen gliko polimerlerinin tipinde büyük esnekliğe izin verir.

Gliko polimerlerinin müteakip etiketlenmesi, sulu bir ortamda birincil araçlarla reaksiyona girebilen çok çeşitli floresan reaktiflerle de elde edilebilir. Gliko biyolojisi alanındaki araştırmacılar, çok yönlü ve tanımlanmış gliko polimerlerini kolayca elde etmek için bu tekniği kullanabilirler. Bu gliko polimerleri, kistik fibrozlu hastaların solunum yolunda gözlenenler veya birçok insan kanseri türünde yer alanlar gibi karbonhidrat bağlama özelliklerini araştırmak için araçlar olarak kullanılabilir.