Name: Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Keşfedin, endotelyal hücre yapışkanlığını in vitro olarak nicelendirmek için fibronektin kaplı kapak slipleri ve floresan etiketli monositler kullanan bu güvenilir yöntemi. Bu teknik, vasküler biyoloji araştırmalarında daha tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Tam desteği için Simon Bouffler'a ve altyapı desteği için Public Health England'a çok minnettarız. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (NIHR) hibesi aracılığıyla İngiltere Halk Sağlığı tarafından desteklenmiştir. Bu rapor, NIHR tarafından yaptırılan bir çalışmadır. Bu yayında ifade edilen görüşler yazarlara aittir ve NHS, NIHR veya Sağlık Bakanlığı'nın görüşleri olmayabilir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Cam lameller hazırlanması 1. <ol><li> Etanol tüm lamelleri toplam pozlama sağlamak için zaman zaman ajitasyon ile en az 10 dakika süreyle% 70 etanol onları iliklerine cam lamelleri yuvarlak 12 mm çapında sterilize edin. Steril hücre kültürü kabı içine cam lamelleri ve etanol dökün (ya da 6 cm ya da 10 cm çapında). </li><li> Steril ince 5B forseps bir çift ile, pick up ve 24 de küme plaka bir kuyuya her cam lamel yerleştirin. Lamelleri Kuyunun taraflarına dokunarak ve kuyunun ortasında yaklaşık olarak emin olmak için özen gösterin. </li><li> Akış kabinede kurumaya cam lamelleri ile un kaplı 24 kuyu küme plaka bırakın. Bu yaklaşık 10 dakika sürer </li><li> Bu süre içinde, 0.1 mg / ml Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde 10 mg / ml insan fibronektin seyreltilmesi ile kaplama karışımı hazırlayın. </li><li> Lamelleri kuruduğunda, her bir cam co üstüne kaplama çözeltisi pipetle 100 ulböylece verslip çözüm de dış çevresindeki havuzu olmayan tek cam kaplar. En azından bir saat için bir hücre kültürü inkübatöründe kaplı 24 çukurlu toplu plaka koyun. </li><li> Sadece Kullanmadan önce, kaplama çözümü çıkarın. aynı kaplama çözeltisi steril bir tüpe transfer edilmiş ve etkinlik görünür bir kayıp ile üç kez kullanılabilir. </li></ol> Endotel Hücre Monolayer 2. Hazırlık <ol><li> 37 ° C &#39;de orta ve% 5 karbon dioksit Kültür insan koroner arter endotel hücreleri (EC). </li><li> Kültür ortamı aspire ve 10 ml HBSS ile AK tek tabaka durulayın </li><li> HBSS kapalı aspire ve 2 ml% 0.5 tripsin,% 0.2 EDTA çözeltisi. Yaklaşık olarak 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> AT şişeye tarafına bir musluk tarafından yerinden edilebilir olduğunda, soya fasulyesi tripsin inhibitörü 5 ml ilave edilir ve pipet ile daha da hücreleri çıkarmak için şişenin yüzeyi fışkırtma. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp ve santrifüj tüpü içine aktarın hücreleri5 dakika boyunca 200 x g&#39;de. </li><li> Süpernatant kapalı aspire ve medya 5 ml AK pelletini. Bir haemocytometer ile hücre sayımı ve AT medya ml başına 50.000 EC hücre konsantrasyonunu ayarlamak. </li><li> Kaplanmış cam lamelleri içeren 24 çukurlu bir levhanın her bir çukuruna hücre süspansiyonu 1 ml koyun. 37 ° C artı% 5 karbon dioksit, hücre kültürü inkübatöründe hücreleri O / N inkübe edin. </li><li> konfluent tek tabaka 3 gün içinde, meydana getirildiği zaman hücreler, deneylerde kullanılmak üzere hazırdır. </li></ol> Monositler 3. hazırlanması <ol><li> RPMI içinde kültürlenir transfer HL-60 hücreleri bir 15 ml tüp içine, süspansiyon kültürü olarak% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiştir. 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. </li><li> 5 mi ortam içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın ve 2.000.000 hücre / ml ortam hücre konsantrasyonunu ayarlamak. HL-60 floresan etiketleme isteniyorsa, serum ve PR olmadan RPMI hücreleri tekrar süspansiyonbölüm 4&#39;te tarif edildiği gibi oceed. </li><li> 1 ile 3 arasında bir zaman seçilen sabit bir süre için AT tek tabaka ihtiva eden 24 çukurlu toplu plakanın her oyuğuna HL-60 hücre süspansiyonu, 0.5 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de ve% 5 karbon dioksit, bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe plaka hr. Küçük bir fark bağlama doygunluk elde edilir, 1 saat, 3 saat zaman noktası arasında görülmektedir. </li><li> Hücre Yıkama / toplama için hazırlayın: HBSS, 100 ml ile 120 ml tüp doldurun. Taze 24 yuvalı plakanın her oyuğuna formalin 1 ml koyun. </li><li> Dokunmamaya özen kuluçka döneminden sonra, keskin forseps bir çift kullanın ve kuyudan cam lamel pick up ve dikey lamel tutun ve 3 sn bankta doku parçasının üzerine lamel kenarına dab doku ile lamel hücre kaplı yüzeyi. </li><li> Forseps bir çift ile sıkıca lamel tutarak, ve HBSS beş kez dışarı lamel dunk. </li><li> Beşinci dunk sonraHBSS, 3 saniye boyunca doku üzerinde lamel kenarına hafifçe sürün. </li><li> Bir dab izledi 5 dunks üç set toplam yapım, 3.6 ve 3.7 &#39;de açıklandığı smaç vurma ve prosedürleri tekrarlayın. </li><li> RT&#39;de hücreleri gidermek için iyi içeren% 10 formalin içine lamel aktarın. Lamel, numaralandırma hazır uzun süreli depolama için ya da aşağıda tarif edilen diğer prosedürler tabi etmektir. </li></ol> Hücre Tracker ile HL-60 hücrelerinin 4. Etiketleme (isteğe bağlı) <ol><li> Sayım bir 15 ml santrifüj tüpüne HL-60 hücreleri (örneğin, 10000000) uygun miktarda aktarın. Santrifüj HL-60, 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de hücreleri. Süpernatantı. </li><li> 1.000.000 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda serumsuz RPMI ortamı içinde hücre Tracker tekrar süspansiyon hücre peleti. 1 saat süre ile hücre kültürü inkübatöründe inkübe hücreleri. </li><li> 200 x g&#39;de santrifüjleyin hücreler, 5 dakika süreyle tavlandı ve süpernatant atılır. 2.000.000 C&#39;lik bir konsantrasyona kadar ortam içinde tekrar süspansiyon hücre peletiarşın / ml olmuştur. </li><li> Cam lamel üzerinde büyümüş içeren her endotel hücrelerine hücre Takibi etiketli HL-60, 0.5 ml ilave edilir. 3.3 devam edin. </li></ol> Yapıştırıcı endotel hücrelerinin 5. numaralandırma <ol><li> Mikroskop bireysel hücreleri belirlemek için DAPI karşı boyası ile slaytlar Mount lamelleri. </li><li> Bir 4X veya 10X amacı ile ters bir mikroskop kullanılarak, çeşitli alanlarda (örneğin, 5 alanlar) görüntülerini almak ve un-ışınlanmış endotel hücreleri üzerinde agrega monositlerin en çok (Bu genellikle 3-5 olmalıdır) saymak. </li><li> Endotel hücre monositlerin eşik olarak iki kez bu sayısını ayarlayın bir küme olarak tanımlanabilir için. Eğer gerekirse, farklı bir kriter, deney doğasına bağlı olarak bir küme tanımlamak için kullanılabilir. </li><li> Kümelerinin sayısını ve alan endotel hücre sayısı. Yapışkan endotel hücrelerinin yüzdesini elde etmek rezistans tarafından önceki bölün. GolÇok sayıda alanları sayısı arasında bir ortalama ve standart sapma elde edilmiştir. </li></ol> Antikorlar 6. counterstaining <ol><li> Lamel yapışma deneyi ve hücreler oda sıcaklığında 15 dakika için% 10 formalin içinde sabitlenir sonra, standart bir prosedür 10 ve seçim antikorlar kullanılarak immünofloresans lamelleri maruz. </li><li> Ekle ve endotel hücrelerine bağlı monositler yerinden oynatmamaya önlemek için çok çeşitli çözümler yavaşça çıkarın. </li></ol> Yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz aktivitesi bakımından 7. counterstaining <ol><li> Lamel yapışma deneyi ve hücreler yaşlanmayla ilişkili beta-galaktosidaz faaliyeti için 15 dakika, leke için formalin sabit edildikten sonra boyama seti eşlik kılavuzunda açıklandığı gibi. Ekle ve endotel hücrelerine bağlı monositler yerinden oynatmamaya önlemek için çok çeşitli çözümler yavaşça çıkarın. </li></ol>

<ol><li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation%3A+an+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li>
<li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li>
<li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells%3A+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li>
<li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li>
<li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li>
<li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin%2C+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li>
<li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li>
<li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li>
<li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yukarıda tarif edilen monosit yapışma deneyi endotel mono tabakaları 10 iyonizan radyasyon biyolojik etkilerini incelemek amacıyla tasarlanan deneylerde başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bu endotel tek tabaka yapışkanlığını değerlendirmek için tek yöntem değildir, ancak, bu yapıştırıcı, bir tek tabaka içindeki oranı veya endotelyal hücrelerin yüzdesi ölçümü sağlayan tek bir yöntemdir. Bu monositler yapışmasının küresel bir niceliksel değişiklik olarak önemli bir fark, diğer yöntemlerle ölçülen endotel tek tabaka ya da endotel hücrelerinin bir alt-nüfusa artışı yapışkanlık tüm hücre yapışma genel bir artışa ya da atfedilebilir tek tabaka içinde yukarıdaki örnekte gösterilmiştir. Bu bilgiye sahip değer ışınlama ines neden sonra yeteneği gelişmiş yapışkanlığı sergiledi endotel hücrelerinin yüzdesini ölçmek için gerçeği ile örneklenmiştirBu etki, yapışkan olan hücrelerin yüzdesi olarak belirli bir genin, genetik mutasyona bağlı değildir sahip sonuç, bu dozda X-radyasyon ile bir genin rastgele mutasyon beklenebilecek olanı (1000 kat daha fazla) büyük ölçüde yukarıda edildi . Sonuçların iyi tekrarlanabilirlik sağlayan faktörü yıkama rejimidir. Yıkama işlemi, bir doku üzerinde dabbing ardından yıkama tamponu içine cam lamel daldırma içerdiğinden, kaçınılmaz olarak kuyuya yıkama tamponu pipetleme gelen eski yöntem ortaya tamponu türbülansa değişkenliği önlenir. Aslında yıkama adımından değişkenlik elemanı kaldırılmış bir yıkama işlemi hazırlamak için bize mecbur pipet yöntemi kullanılarak elde edilen çoğaltır arasındaki aşırı değişkenlik gözlem oldu. Kuşkusuz, muhtaç bu testte yalan sınırlamalar n do monosit kümeleri manuel sayısı, yürütmek içinOT yüksek verimlilik analizleri için adapte edilmesini sağlar. İkincisi, birçok monositler bir küme oluşturan nasıl karar yarı keyfi belirlenmelidir ve düzeyi çok yüksek ayarlanmış ve bazı orijinal kümeler dışlanmasına neden olabilir. bu yöntemde, kesme kuvveti eksikliği, aynı zamanda, endotelyal hücrelerin ağır gelişmiş yapışkanlık neden olduğu deneylerde (örneğin, + TNFa) bir sınırlama olarak görülebilir. Bu yapışkanlık az abartılmış büyütme algılanmasını sağlar diğer durumlarda ancak, kesme kuvveti eksikliği bir avantajdır. Monosit yapışkanlık mütevazı bir artış özellikle önemlidir ve ilgili olabilir. İn vivo koşullarında, monositler (tipik bir deney zamanında) kırma gücüne karşı büyük ölçüde yapışkanlık mütevazı bir artış ile endotelial hücrelere büyük sayılarda takmak için beklenmez. Zaman içinde, ancak bazı monositler olasılıkla olur ve bu kronik iltihaplanma ortamı temsil etmek için daha olasıdır. Gibi,o yapışkanlık artışının makaslama stres altında uyulması gereken izin tipik olarak kısa ve muhtemelen çok kısacık deneysel zaman dilimlerinde ortaya endotel hücre yapışkanlık küçük artışlar için fırsat sağlar olarak kesme kuvveti bulunmaması bir avantaj olabilir. Yukarıda gösterildiği gibi, belirli hücresel proteinlerin ya da hücresel devletlere özgü endotel hücrelerinin yapışkanlık ilişkisini veriyor gibi yaşlanma tahlil ve immünofloresan boyama gibi diğer analizlere bu tahlilde sonra hücrelerin maruz yeteneği, bir özellik bu yöntemin yararını artırır Eski yapışma deneyleri ile mevcut değildir. Bu yöntem, EST2-ölümsüzleştirilmiş insan koroner endotel hücreleri ve benzer sonuçlar ile kullanılmıştır da sadece özel bir hücre hattına özgü olmadığını gösteren, primer insan koroner endotel hücreleri 10 ile elde edilmiştir. Ayrıca, adoendotel hücrelerinin yapışkanlığı tahlil bu yöntemin ption etiketli immünositlerin floresan ölçer standart yapışma deneyi aynı hücrelerin maruz engel değildir. Birlikte, bu rapor, bu yöntem, kapsayıcı, çok yönlü ve standart yapışma deneyinde çok daha fazla bilgi sağladığını göstermektedir.

Kan damarlarını kaplayan endotel hücre tabakası boyunca monositler gibi immün hücrelerin infiltrasyonu iltihabı 1 sürecinde önemli bir adımdır. Bu yaralanmanın bir siteye bağışıklık hücreleri (imünositler) homing sağlar. Örneğin, koroner ve karotis arter gibi durumlarda ve yerlerde, endotel tabaka boyunca monosit sızması potansiyel istilanın 2 oluşumuna yol, arter çeperinde bu hücrelerin istenmeyen uzun süreli ikamet yol açabilir. Immünosit infiltrasyonu Her durumda, ilk adım, kan damarının lokal bir bölgedeki endotel hücrelerinin aktivasyonunu içermektedir. Endotel hücreleri, endotel hücre yüzeyi 3- üzerine immünositlerin görevlendirilmesini ve bağlanmasını kolaylaştırmak örneğin, VCAM, ICAM ve E-selektin gibi hücre yüzeyi proteinlerinin ifadesini geliştirmek için, TNF-α ve IL-6 pro-enflamatuvar sitokinler tarafından aktive edilir 6. 7 endotel yapışık monositler sayımı sureti ile ifa edilmiştir. hassasiyet açısından bu yönteminin sınırlamaları lenfositler ve monositler yapışma 4 karşılık gelen radyoaktif madde miktarının, ardından radyo işaretli lenfosit veya monosit kullanımına yol açmıştır. Bu yöntem, sonuçta 8 ölçülür ilgi imünositler farkı yerine radyoaktivite bu floresans olduğu yukarıdaki ile aynı prosedüre floresans boya ile etiketlenir ve tabi tutuldu ve böylece bir floresans bazlı yöntem, değiştirildi. Halen bu yöntem en uygun olarak ortaya çıkmıştır ve çok sayıda ticari tedarikçiler tarafından kit halinde satılmaktadır. Bu deney, kontrol ve deney numuneleri arasındaki yapışkanlık göreli düzeylerini ölçmek mümkün olmakla birlikte, floresan bir değişiklik bütün e boyunca yapışkanlık üniform bir değişikliğe bağlı olup olmadığı ortaya koymamaktadırndothelial hücre topluluğu veya değişiklik, hücre alt-popülasyonu içinde yapışkanlık bir farka ise. Bu yıkama darlığı sonucu üzerinde derin etki gösterir ve daha da önemlisi, farklı endotel hücre mono tabakaları arasındaki ilişkisiz monositler kapalı durulama tekdüzelik numuneler arasında sonuçların çoğaltır sonuçlarının yakınlık ve tekrarlanabilirlik büyük ölçüde etkileyeceğini de açıktır . Daha yakın zamanda, bir endotelyal hücre tek tabaka boyunca ortam içinde monositleri pompa çeşitli sistemler, bu sorunu çözmek 9 için kullanılmıştır. Buna ek olarak, bu akış sistemleri de endotelyal hücreler üzerinde kesme kuvvetinin etkisi özetlemek. Bu sistemlerin avantajı net ve çok cazip olmakla birlikte, akut iltihap durumunda olduğu gibi, bu örneğin iyonize edici radyasyon gibi TNFa, başka bir aktivatörleri, gibi faktörler ile, endotelial hücre yapışkanlığı önemli ölçüde artar edilebilir ise gerçekleştirmek için de önemlidir 10 meydana çıkarmak t değiştirirşapka kolaylıkla bunlar çok sıkı sistemlerinin in vitro deneysel süreler dahilinde tespit edilmez. Endotel hücre yapışma gibi dakika değişiklikleri kolayca cevapsız veya in vitro ilişiği kesilen iken, kronik inflamasyon özelliği olan bir yaşam süresi içinde böyle küçük değişiklikler, çok önemli sonuçlar uygulamayın in vivo, mutlaka iyi huylu değildir. Dolayısıyla sağlam, ancak duyarlı ve spesifik bir yöntem tespit ve endotel hücre yapışkanlık gereklidir ölçmek için. Burada, doğrudan endotel hücrelerinin yapışkanlığını ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, endotelyal hücre yapışma dolaylı taşıyıcı göstergesi olarak floresans ölçümleri dayanmaz. Bu yapışkanlık değişiklikler tüm hücrelerin tektip değişiklik nedeniyle ya da bir alt nüfusa sınırlı olup olmadığını ortaya koymaktadır. Bundan başka, bu örneğin yaşlanmayla ilişkili beta-galaktosidaz, hücre canlılığı, mar olarak işaretleri ile endotel hücrelerinin ko-lekeleme sağlarker, Calcien AM ve bazı hücre durumlar veya spesifik protein ekspresyonuna bireysel yapışkan endotel hücrelerinin ilişki sağlayan hücre yüzeyi ve hücre içi proteinlere karşı antikorlar.

<table><tbody><tr><td>Hepes Tamponlu Tuzlu Su Çözeltisi (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller Yuvarlak 12 mm Çaplı</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu küme plakası</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo Hücre ortamı</td><td>Hücre Uygulamaları</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Soya Fasulyesi tripsin inhibitörü</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Hücre İzleyici Yeşil</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Beta glasktosidaz Test kiti&nbsp; &nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

endotel hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; in vitro</em

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Inflamasyon ana işlemlerden biri, çevredeki dokuya kan damarı lümeninden bağışıklık hücrelerinin sızıntıdır. Kan damarları kaplayan endotel hücreler, monositler gibi bağışıklık hücreleri, dolaşımdaki yapışkan olduğunda ortaya çıkar. Bu yapışkanlık in vitro ölçülmesi artık yeni bir doğrudan sayısı olarak ya bir endotel katmana yapışık monositler sayısı miktarının yapılır kadar veya yapışık monositler floresan dolaylı ölçümü ile saptanmıştır. Bu ölçümler endotel hücre popülasyonunun ortalama yapışma gösterir ise de, bu tür hücre sayısı gibi faktörler, bir dizi eleştirilmiştir edilir ve aslında yapışkandır endotel hücrelerinin oranını göstermez. Burada tarif ve endotel tek tabaka bir test nüfus içinde yapışkan hücrelerin numaralandırma sağlayan bir yöntem ortaya koymaktadır. Endotel hücreleri cam lamelleri üzerinde yetiştirilen ve istenen aşağıdakitedavisi (yani, floresanla işaretlenmiş olabilir) monositler ile tehdit edilir. Daldırma ve drenaj birden mermi içeren inkübasyon, bir durulama prosedürü, sonra hücreler sabittir. Monositler çevrili Yapıştırıcı endotel hücreleri, kolayca tespit ve yapışkan olan nüfus içindeki endotel hücrelerinin gerçek oranını ortaya bir yapışma indeksi vererek, numaralandırılan.

Bu yöntem, bir popülasyon içindeki bireysel yapışkan endotelyal hücrelerin saptanmasını sağlar. Örneğin, un ışınlanmış endotelyal hücre tek-tabakalı (önceki bağımsız endotel hücreleri çevresinde en kümelerdeki monositler bağlı edildi monositler ile kuluçkalamadan 7 gün sonrası 10Gy ışınlama ile inkübasyon ve yıkama, endotel tek tabakalı sonra birkaç sporadik HL-60 monositler muhafaza ederken Şekil 1). Bu fenomen faz kontrast mikroskobu altında kolaylıkla gözlemlenebilir olmasına rağmen, floresan mikroskopi monosit kümeleri daha da net bir görüntü ortaya koyuyor. Tarif edilen yapışma tahlili gerçekleştirdikten sonra, standart yöntemler ile immünofloresan uygun antikorlar kullanılarak membran, sitoplazmik ya da nükleer (Şekil 2) proteinlerin hücrelerin boyanması devam etmek mümkündür. Bundan başka, örneğin yaşlanmayla ilişkili beta-galaktosidaz (Şekil 3) gibi enzim-bazlı analiz aynı zamanda PE olabilirrformed. Her bir monosit, küme bağımsız bir endotelyal hücreye karşılık geldiğinden, kümelerin numaralandırma tek tabaka içinde yapışkan endotelyal hücrelerin sayısı ortaya çıkaracaktır (Şekil 4) ve popülasyon içindeki yapışkan endotel hücreleri bu nedenle oranı (Tablo 1, Şekil 6) . Bu endotel hücre yapışma gibi ölçümü sağlar bugüne kadar tek yöntemdir. Burada yapılan deneylerde kullanılan endotel hücreleri temas inhibe ve kaplayana kadar sayısındaki artış yoktur dikkat çekicidir. Bu daha sonraki zaman noktalarında artmış endotel hücre sayısına göre yarattığı potansiyel karmaşıklığı ortadan kaldırır. Eğer arzu edilirse, endotelyal monokatmanlarına bağlanmış monositler (3.9 yerine tespiti)% 0.5 tripsin% 0.2 EDTA çözeltisi ile yerinden alınabilir ve modern yöntemler durumda (Şekil 5) olduğu gibi floresans bir plaka okuyucusu kullanılarak ölçüldü. </p&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Endotel hücrelerinin tek tabaka üzerinde monositlerin Şekil 1. yapışması. Un-ışınlanmış endotel hücreleri üzerinde, monositler sporadik ve rastgele bir şekilde tek tek hücrelerin (paneller sol) olarak ve post-10 Gy ışınlanmış 7 gün bireysel endotel hücreleri üzerinde kümeler halinde yapıştırılır tek tabaka (sağ paneller). Alt paneller faz kontrast altında görülebilen, küçük ve parlak bir küresel hücrelerin gerçekten de hücre-Tracker Green ile ön-etiketli monositler olduğunu teyit üst panellerin floresans görüntüleri bulunmaktadır. Monosit kümeleri Bazı beyaz oklarla gösterilir. Görüntüler 10X objektif kullanılarak alınmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Proteinler sonrası yapışma deneyi için, endotel hücrelerinin Şekil 2. boyanması. Anlatılan yapışma deneyi gerçekleştirmek sonra, cam lameller üzerine hücreler (A), membran proteinin (CD44) için immünofloresan tabi tutuldu, b) Sitoplazmik protein (tubulin) veya c) nükleer protein (γ-H2AX). (A) ve gösteri monositler Hücre Tracker Green ve sağ panellerde benzer bir görüntü ile önceden etiketlenmiş (20X amacı ile görülen) (B) Sol panel CD44 ve mikrotübüller (kırmızı) ve DAPI lekeli çekirdekleri (mavi) ortaya koymaktadır. Γ-H2AX karşı antikorlar ile boyandı ışınlanmış endotel hücre çekirdekleri için (C) noktasında beyaz oklar. DAPI tarafından parlak bir mavi lekeli Monosit çekirdekleri kolayca endotel hücrelerinin oval biçimli çekirdekleri ayırt edilir. Görüntüler 20X amacı ile alınmıştır.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Endotel hücresindeki açıkça görüldüğü gibi endotel hücrelerinin Şekil 3. yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz boyama. Adezyon deneyinde sonra lamelleri hücreler, yaşlanmış hücrelerin lizozom mavi dönmesine neden olur yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz için boyama maruz kaldığı seçici nedeniyle küçük boyutu ve küresel şekle kolayca tespit sayısız monositler, ile bağlıdır. 20X objektif görünen görüntü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Bireysel endotelyal hücreler üzerinde monosit kümelerinin Şekil 4. numaralandırma. Adezyon deneyinde sonra hücrelerin görüntüleri alan birçok farklı pozisyonlarda ve monosit kümelerden alındı ​​ve (yeşil) çember. Bir küme, bir endotelyal hücre 10 veya daha fazla veya monositlerin bir aglomerasyon olarak tanımlandı. Görüntüdeki Monosit kümeleri ve 12 gün sonrası ışınlanmış endotel hücreleri sayısı sayısı (kırmızı noktalı) sayıldı ve hesaplanan yapışık endotel hücrelerin yüzdesi 10X objektif ile çekilen Tablo 1. Görüntü gösterildiği gibi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir sürümü.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Şekil yapışık monositler floresansının 5. miktarının belirlenmesi. Aşağıdaki Adhe<html> sion deneyi, cam lameller üzerine hücreler tripsinize edildi ve monositlerin endotelyal floresan tek tabaka yapışkanlık dolaylı bir göstergesi olarak, bir floresan plaka okuyucu kullanılarak ölçülmüştür CellTracker Green ile önceden etiketlenir. Belirtilen gün sonrası ışınlama tür ölçümlerden elde edilen sonuçlar ve yukarıdaki grafikte platted bulundu. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Şekil 4&#39;te tarif edilen sonuçlar, ışınlanmış de 12 gün sonra 10 Gy ışınlama, 8-10 oranında gösteren yukarıdaki tabloda verilen üç cam lameller üzerine beş farklı konumlarda 1. Yapışkan endotel hücreleri skorlandı Tablosundan yapışma deneyi skoru Şekil 6. Temsil Endotel hücreler, Yapışkan olmuştur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; yapıştırıcı yüzdesi endotel hücreleri </td></tr><tr><td></td><td> Disc 1 </td><td> Disc 2 </td><td> Disk 3 </td></tr><tr><td> Tarla 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> Alan 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> Alan 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> Alan 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Alan 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> Ortalama </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Yapışma deneyi puanları. F de tarif edildiği gibi, üç cam lameller üzerine beş farklı konumlarda Yapışkan endoteliyal hücreler skorlandıŞEKIL 4 ve sonuçlar, 12 gün, 10 Gy ışımadan sonra, ışınlanmış endotel hücrelerinin 8-10 oranında yapıştırıcı haline geldiğini gösteren yukarıdaki tablo.

Bir endotel hücre tek tabakası içindeki gerçek yapışkan hücre sayısının kantitasyonuna izin veren bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Bu prosedürün genel amacı, endotelyal hücrelerin yapışkanlığını in vitro ortamda nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle 24 kuyucuklu bir plakada fibronectin kaplı lameller hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, insan koroner arter endotelyal hücreleri cam lamellere uygulanır ve konfluen bir endotelyal hücre monokatmanı oluşana kadar inkübasyona bırakılır.Endotel hücrelere istenen tedavi uygulandıktan sonra, floresanla işaretlenmiş monositler cam lamellere eklenmiş ve endotel hücre monokatmanı ile birlikte inkübe edilmiştir. Son aşama, lamellerin titizlikle daldırılıp yıkanması prosedürü ile bağlanmamış monositlerin endotel monokatmanından uzaklaştırılmasıdır. Nihayetinde bu yöntem, belirli bir tedavi sonrası yapışkanlık gösteren endotel hücre popülasyonunun yüzdesinin belirlenmesine olanak tanır.Bu tekniğin temel avantajı, mevcut tüm yöntemlerle ölçülen bir endotel tek tabakasının genel yapışkanlığının aksine, yapışkan endotel hücrelerinin gerçek sayısını veya yüzdesini ölçmesidir. Bu yöntem fikri, mevcut yöntemleri kullanarak endotel hücre ADIs değerlerini ölçmeye çalıştığımızda ve bu yöntemlerin doğasındaki teknik zorluklar nedeniyle sonuçlarda kabul edilemeyecek kadar büyük varyasyonlarla karşılaştığımızda ortaya çıkmıştır. Tüm lamellerin etkileşime girmesini sağlamak amacıyla, ara ara çalkalayarak 70% ethanol içinde en az 10 dakika bekleterek 12 milimetre çapındaki yuvarlak cam lamelleri sterilize edin.Ardından, tüm cam lamelleri ve etanolü, steril ince uçlu 5B pensler kullanarak steril bir hücre kültürü kabına aktarın. Her bir cam lameli tek tek alarak 24 kuyucuklu bir küme plakadaki kuyucuklara yerleştirin. Lamellerin kuyucuk kenarlarına değmediğinden ve yaklaşık olarak kuyucuğun ortasında olduğundan emin olun; cam lamelli 24 kuyucuklu küme plağını kurumasını sağlamak için laminar akışlı kabinde bırakın.Bu işlem yaklaşık 10 dakika sürer. Lameller kuruduğunda, solüsyonun kuyucuk dışına taşmamasına dikkat ederek, her bir cam lamelin üzerine 100 µL kaplama solüsyonu damlatırım. Kaplanmış 24 kuyucuklu küme plakayı en az bir saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.İnsan koroner arter endotel hücrelerini 37 °C ve %5 karbondioksit içeren ortamda kültüre edin; kültür ortamını aspire edin ve endotel hücre monokatmanını 10 mL Hank's dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile durulayın, ardından HBSS'yi aspire edin. 2 mL %0,5 tripsin ve %0,2 EDTA çözeltisi ekleyin ve yaklaşık beş dakika oda sıcaklığında inkübe edin; bu aşamada endotel hücreleri, flakonun yan tarafına vurularak yerinden oynatılabilir. Flakonun yüzeyine 5 mL soya tripsin inhibitörü püskürtün. Hücreleri daha fazla serbest bırakmak için hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve tüpü 200 ×g'de beş dakika santrifüjleyin, süpernatantı aspire edin ve endotel peletini 5 mL ortamda yeniden süspande edin.Hücreleri bir hemositometre ile sayın ve hücre konsantrasyonunu mililitre başına 50,000 endotel hücre olacak şekilde ayarlayın. Kaplamalı cam lameller içeren 24 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna bir mililitre hücre süspansiyonu aktarın; hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin. Hücreler istenen işlem için hazırdır.Üç gün içinde konfluent bir monotabaka oluştuğunda, %10 fetal calf serum ile desteklenmiş RPMI içinde kültürlenen HL 60 hücrelerini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, HL 60 hücrelerinin floresan işaretlemesi için süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri serumsuz beş mililitre besiyerinde yeniden süspande edin. Hücreleri sayın ve uygun miktarda hücreyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Hücreleri 200 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, hücre peletini serumsuz PMI medyumundaki hücre takipçisi (cell tracker) içinde yeniden süspanse edin. Mililitrede 1 milyon hücre konsantrasyonunda, hücreleri hücre kültürü inkübatöründe bir saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından hücreleri 200 ×g'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatantı atın.Hücre pelletini, mililitrede 2 milyon hücre konsantrasyonuna ulaşacak şekilde medyada süspanse edin. Endotel hücre monotabakası içeren 24 kuyucuklu cluster plakasının her bir kuyucuğuna, bir mililitre hücre takipçisi (cell tracker) ile işaretlenmiş HL 60 hücre süspansiyonu ekleyin ve plakayı, belirlenmiş bir ile üç saat arasındaki sabit bir süre boyunca 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. İnkübasyon süresinin ardından, bir çift ince 5 B pens kullanarak cam lameli kuyucuktan çıkarın; lameli kaldırırken yalnızca dış kenarlarından tutun ve lamelin kenarını kurulayın.Sürgüyü tezgah üzerindeki bir parça doku kağıdının üzerine üç saniye boyunca yerleştirin. Lamelle örtülü hücre yüzeyine doku kağıdının temas etmemesine dikkat ederek, lameli bir penset ile sıkıca tutun. Lameli beş kez HBSS içine daldırıp çıkarın; beşinci daldırma işleminden sonra işlemi tamamlayın.HBSS ile örtünün kenarına hafifçe dokunun. Dokuyu üç saniye boyunca daldırın. Daldırma ve dokundurma işlemlerini, her biri beş daldırma ve ardından bir dokundurmadan oluşan toplam üç set halinde tekrarlayın.Ardından, hücreleri oda sıcaklığında sabitlemek için lamine camı Tencent formülü içeren bir kuyucuğa aktarın. Lamine cam; sayım, uzun süreli saklama veya metin protokolünde açıklandığı üzere antikorlar veya yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz aktivitesi için karşıt boyamaya tabi tutulmaya hazırdır. Yapışkan endotel hücrelerini saymak için, ters mikroskop ve 4x veya 10x objektif kullanarak bireysel hücreleri tanımlamak amacıyla lamine camları DPI karşıt boyası ile mikroskop lamlarına monte edin. Birkaç alanın görüntülerini alın ve ışınlanmamış endotel hücreleri üzerinde kümelenen en yüksek monosit sayısını belirleyin.Gerektiği takdirde, bir küme olarak tanımlanması için bir endotel hücre üzerindeki monositlerin eşik değerini bu sayının iki katı olarak belirleyin. Deneyin doğasına bağlı olarak, bir kümeyi tanımlamak için farklı bir kriter kullanılabilir. Alandaki kümelerin sayısını ve endotel hücrelerinin sayısını sayın.Yapışkan endotel hücrelerinin yüzdesini elde etmek için formu sonuncuya bölün. Sayımların ortalamasını ve standart sapmasını elde etmek için çok sayıda alanı skorlayın. Monositlerle inkübasyon öncesinde, gri radyasyon sonrası yedinci gündeki endotel tek tabakaları, tekil endotel hücrelerinin etrafındaki kümeler halinde monositler tarafından bağlanmıştır.Bu fenomen faz kontrast mikroskobunda kolaylıkla gözlemlenebilse de, floresan mikroskobi monosit kümelerinin daha net bir görüntüsünü sunar. Tanımlanan ADI testi gerçekleştirildikten sonra, uygun antikorlar kullanılarak hücrelerin membran, sitoplazmik veya nükleer proteinler için boyanmasına geçilebilir. Standart immünofloresan yöntemlerinde, aşırı kuvvet monositlerin yerinden ayrılmasına neden olabileceğinden yıkama basamaklarında dikkatli olunmalıdır.Ayrıca, senesans ile ilişkili beta-galaktosidaz gibi enzim tabanlı analizler gerçekleştirilebilir. Bu işlem, çok sayıda monosit tarafından seçici olarak bağlanan endotel hücrede belirgin olduğu üzere, senesans hücrelerin lizozomlarının maviye dönmesine neden olur; monositler küçük boyutları ve küresel şekilleri sayesinde tanımlanır. Her bir monosit kümesi tek bir endotel hücreye karşılık geldiğinden, kümelerin sayılması tek katman içindeki yapışkan endotel hücrelerin gerçek sayısını ve dolayısıyla popülasyon içindeki yapışkan endotel hücrelerin yüzdesini ortaya koyar.Bu, günümüzde istenildiği takdirde endotelyal hücre yapışkanlığının nicelendirilmesine olanak tanıyan tek yöntemdir. Endotelyal monokatmanlara tutunmuş monositler, güncel yöntemlerde olduğu gibi bir tripsin EDTA çözeltisi ile yerlerinden sökülebilir ve floresans bir plaka okuyucu kullanılarak ölçülebilir. Bu teknik uzmanlaşıldığında, dört saat içinde ve çok az uygulama süresiyle gerçekleştirilebilir. Şunu hatırlamak önemlidir; tüm yıkama ve daldırma adımları, bu prosedür takip edilirken tüm örnekler arasında aynı şekilde ve aynı sayıda tekrarlanarak gerçekleştirilmelidir.Yapışkan olan endotel hücrelerinin, yapışkan olmayanlara kıyasla özelliklerinin neler olduğu gibi temel soruları yanıtlamak için immünofloresan ve senesans ile ilişkili beta galaktosid assayleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

quantitation-of-endothelial-cell-adhesiveness-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, kültür hücreleri üzerine yapıştırılır birimler oluşturan bakteri kolonisi sayısının sayma oluşan basit bir bakteriyel yapışma testtir. Testin sağlam, adhesin bağımsız olarak okudu ve çeşitli varyasyonlar bakteriyel patogenezi üzerinde çalışan çoğu laboratuvarlarda kullanılır.

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

Hem molekülleri etkileşen hücrelerin yüzeylerinde demirlemiş olan reseptör-ligand etkileşimi kinetiği ölçmek için bir yapışma frekans tahlil açıklanmıştır. Bu mekanik tabanlı test mikropipet basınçlı bir insan adezyon sensörü olarak kırmızı kan hücresi ve integrin αLβ2 ve hücrelerarası adezyon molekülü-1 reseptörleri ve ligandlar etkileşim olarak kullanarak örneklenir.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

Bu videoda, kanser hücrelerinin nötrofil hücre dışı tuzaklara (NET'ler) yapışmasını tespit etmek için floresan mikroskobu kullanan bir testi gösteriyoruz. Test kuyucuklarında, NET'lere yapışan floresan işaretli kanser hücrelerinin sayısında kayda değer bir artış olurken, DNaz ile muamele edilen kuyucuklar, NET'lere kanser hücresi yapışmasında azalma sergilemektedir.

Kanser Hücrelerinin Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklara Yapışmasını Tespit Etmek için İn Vitro Yapışma Testi

Enfeksiyon bölgelerinde aktif endotele nötrofil bağlılık konağın inflamatuvar yanıt ayrılmaz bir bileşenidir. Için izin veren bir nötrofil bağlayıcı bir testtir Bu raporda...

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

Nötrofil yapışmasını ölçülmesi için bir yöntem rapor edilir. Bu yöntem, bir kan damarı karşılaşılan edilene benzer bir dinamik akış ortam oluşturur. Bu izin saflaştırılmış yapışma molekülleri (ligand) veya saf stres ile in vivo ortama benzer bir bağlamda endotel hücre alt-tabaka (HUVEC) ya da, nötrofil adhezyonunun araştırılması.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Burada, hücre-substrat empedansı ve canlı hücre görüntüleme analizleri ile hücre adezyonu ve adezyonu giderme süreçlerini invaziv olmayan bir şekilde yüksek zamansal çözünürlükle sürekli olarak ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımlar, matris modifikasyonu tarafından tetiklenen hücre adezyon/adezyonu kaldırma süreçlerinin dinamiklerini ve bunların adezyona bağlı sinyalleşme olaylarıyla zamansal ilişkisini ortaya koymaktadır.

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Bu akış yapışma deneyi T hücresi epitel hücre etkileşimleri basit, çok etkili bir model sağlar. Bir şırınga pompası kayma gerilimi oluşturmak için kullanılır ve konfokal mikroskopi ölçümü için görüntü yakalar. Bu çalışmaların amacı, etkili akış koşulları kullanılarak T hücre yapışmasını ölçümüdür.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Vasküler endotel sıkıca lökosit işe alım denetler. Yetersiz lökosit ekstravazasyonu insan inflamatuar hastalıklar için katkıda bulunur. Bu nedenle, roman yasal unsurları endotel harekete geçirmek için arama enflamatuar bozuklukları için geliştirilmiş terapiler tasarlamak gereklidir. Burada, lökosit enflamasyon sırasında kaçakçılığı değiştirebilirsiniz roman endotel düzenleyiciler ayırdetmek için kapsamlı bir metodoloji açıklayın.

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

Gemi duvara bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışma gut posta için bir önkoşuldur. Burada, insan hücreleri kılcal isteyebileğinizi kaplı kullanarak dinamik hücre yapışma anti-integrin antikorlar, kemokinler ya da başka etmenlerin etkisi analizi için fonksiyonel vitro tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Adım adım bu iletişim kuralı deneysel kurulum ve inflamatuar hiPSC ECs yanıt-e doğru değerlendirilmesi için veri analizi ve lökosit yapışma fizyolojik akış altında analiz ayrıntılı açıklamasını sağlar.

Mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hiPSC-ECs) insan indüklenen Pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için

Burada, pluripotent kök hücrelerin beyin mikrovasküler endotel hücresi (BMEC) benzeri hücrelere farklılaşmasını sağlayan genişletilmiş endotel hücre kültürü yöntemi (EECM) olan bir protokolü açıklıyoruz. Bu hücreler endotel hücre adezyon molekülü ekspresyonunu gösterir ve bu nedenle in vitro immün hücre etkileşimlerini incelemek için uygun bir insan kan-beyin bariyer modelidir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Olgun Bir İmmün Fenotipli Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Benzeri Hücrelere Farklılaşması

Keşfedin, endotelyal hücre yapışkanlığını in vitro olarak nicelendirmek için fibronektin kaplı kapak slipleri ve floresan etiketli monositler kullanan bu güvenilir yöntemi. Bu teknik, vasküler biyoloji araştırmalarında daha tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi

Daha fazla video keşfet