Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi In Vitro

Bu prosedürün genel amacı, endotel hücrelerinin yapışkanlığını in vitro olarak ölçmektir. Bu, ilk olarak 24 dünya küme plakasında fibronektin kaplı lamel fişlerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İnsan koroner arter endotel hücreleri daha sonra cam kapak kızaklarına uygulanır ve birleşik bir endotel hücre tek tabakası oluşana kadar inkübe edilmeye bırakılır.

İstenilen tedavinin endotel hücrelerine uygulanmasından sonra, floresan olarak işaretlenmiş monositler cam kapak kaymalarına eklenir ve endotel hücre tek tabakası ile inkübe edilir. Son adım, kapak fişlerinin titiz bir şekilde daldırılması ve yıkanması prosedürü ile bağlanmamış monositlerin endotelyal tek tabakadan çıkarılmasıdır. Sonuç olarak, bu yöntem, belirli bir tedaviden sonra yapışkan olan bir endotel hücre popülasyonunun yüzdesinin ölçülmesine izin verir.

Bu tekniğin ana avantajı, mevcut tüm yöntemlerle ölçülen bir endotelyal mono tabakanın genel yapışkanlığının aksine, adeziv endotel hücrelerinin gerçek sayısını veya yüzdesini ölçmesidir. Bu yöntem için ilk olarak, şu anda mevcut yöntemleri kullanarak endotel hücreli ADI'leri ölçmeye çalıştığımızda ve bu yöntemlerin doğasında bulunan teknik zorluklar nedeniyle sonuçlarda kabul edilemez derecede büyük farklılıklarla karşılaştığımızda sahip olduk. Sterilize edilmiş 12 milimetre çapında yuvarlak cam kapak kaymaları, tüm örtü fişlerinin etanole toplam maruz kalmasını sağlamak için ara sıra çalkalama ile en az 10 dakika boyunca %70 etanol içinde bekletilerek yapılır.

Daha sonra tüm cam kapak kayar ve etanol bir çift steril ince beş B forseps ile steril bir hücre kültürü kabına kayar. Her bir cam kapak kızağını alın ve 24 kuyulu bir küme plakasının kuyusuna yerleştirin. Kapak kızaklarının kuyu boyutuna değmemesine ve yaklaşık olarak kuyunun ortasında olmasına dikkat edin, cam kapaklı açıkta kalan 24 dünya küme plakasını akış kabininde kurumaya bırakın.

Bu yaklaşık 10 dakika sürer. Kapak kızakları kuruduğunda, her bir cam kapak fişinin üzerine 100 mikrolitre kaplama solüsyonu uygularım, böylece solüsyon kuyunun dışını çekmeden sadece camı kaplar. Kapalı 24 oyuklu küme plakasını en az bir saat boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Kültür, insan koroner arter endotel hücreleri 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit ortamında kültür ortamından aspire edilir ve endotel hücresi tek tabakasını 10 mililitre Hank'in denge tuzu çözeltisi veya HBSS ile durulayın, ardından HBSS'yi %0.2 EDTA çözeltisinde iki mililitre% 0.5'lik triplerde aspire edin ve endotel hücreleri yan tarafa bir dokunuşla yerinden çıkarılabildiğinde yaklaşık beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Şişe. Şişenin yüzeyine fışkırtan beş mililitre soya fasulyesi tripsin inhibitöründe. Hücreleri daha fazla yerinden çıkarmak için, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin, sırtı aspire edin ve endotel peletini beş mililitre ortamda yeniden süspanse edin.

Hücreleri bir hemo sitometre ile sayın ve hücre konsantrasyonunu mililitre ortam başına 50.000 endotel hücresine ayarlayın. Kaplanmış cam kapak fişleri içeren 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna bir mililitre hücre süspansiyonu dağıtın, hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece artı% 5 karbondioksitte bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Hücreler istenen tedavi için hazırdır.

Üç gün içinde birleşik bir tek tabaka oluştuğunda, RPMI'de kültürlenen HL 60 hücrelerinin transferi,% 10 fetal buzağı serumu ile 15 mililitrelik bir tüpe eklenir ve hücreleri beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra supinatı çıkarın ve HL 60 hücrelerinin floresan etiketlemesi için hücreleri serum olmadan beş mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Uygun miktarda hücreyi sayın ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Supinatı çıkardıktan sonra, PMI ortamımızdaki hücre izleyicideki hücre peletini serum olmadan yeniden askıya alın. Mililitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonunda, hücreleri inkübasyonu takiben bir saat boyunca hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin, hücreleri beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin ve supinat Reese'i atın.

Hücre dostunu ortamdaki mililitre başına 2 milyon hücre konsantrasyonuna kadar askıya alın. Endotel hücre tek tabakasını içeren 24 oyuklu küme plakasının her bir oyuğuna HL 60 hücre süspansiyonu etiketli bir mililitre hücre izleyici ekleyin ve plakayı, inkübasyon süresinden sonra bir ila üç saat arasında seçilen sabit bir süre boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitli bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Bir çift ince beş B forseps kullanın ve cam kapak kızağını kuyudan alın, kapağın sadece dış kenarını yırtın, hem kapak kızağını hem de kapağın kenarını sürün.

Üç saniye boyunca bankta bir parça mendil üzerinde kaydırın. Kapak kaymasının hücre kaplı yüzeyine, kapak kaymasını tutan doku ile bir çift forseps ile sıkıca temas etmemeye dikkat edin. Beşinci smaçtan sonra kapak kaymasını HBSS'ye beş kez girip çıkarın.

HBSS, kapağın kenarına hafifçe vurun. Doku üzerinde üç saniye kaydırın. Smaç ve smaç prosedürlerini beş smaçtan oluşan toplam üç set için tekrarlayın ve ardından bir smaç yapın.

Ardından, hücreleri oda sıcaklığında sabitlemek için kapak fişini Tencent formülü içeren bir kuyuya aktarın. Renk kayması, uzun süreli depolama için numaralandırmaya veya metin protokolünde açıklandığı gibi antikorlar veya yaşlanma ile ilişkili beta galakto saz aktivitesi için karşı boyamaya tabi tutulmaya hazırdır Yapışkan endotel hücrelerini numaralandırmak için, kapak fişlerini mikroskop slaytlarına monte edin Fourex veya 10 x objektifli ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak tek tek hücreleri tanımlamak için DPI karşı boyalı. Birkaç alanın görüntülerini elde edin ve eradiasyona uğramamış endotel hücrelerinde toplanan en yüksek sayıda monositi sayın.

Gerekirse bir küme olarak tanımlanacak bir endotel hücresindeki monositlerin eşiği olarak bu sayının iki katını ayarlayın. Deneyin doğasına bağlı olarak bir küme tanımlamak için farklı bir kriter kullanılabilir. Alandaki kümelerin sayısını ve endotel hücrelerinin sayısını sayın.

Yapışkan endotel hücrelerinin yüzdesini elde etmek için formu ikincisine bölün. Sayımların ortalama ve standart sapmasını elde etmek için çok sayıda alanı puanlayın. Monositlerle inkübasyondan önce gri radyasyondan yedi gün sonra endotelyal tek tabakalar, tek tek endotel hücrelerinin etrafındaki kümeler halinde monositler tarafından bağlandı.

Bu fenomen faz kontrastı altında kolayca gözlemlenebilmesine rağmen, mikroskopi floresan mikroskobu, monosit kümelerinin daha da net bir görüntüsünü ortaya koymaktadır. Tarif edilen ADI testini gerçekleştirdikten sonra, uygun antikorlar kullanarak hücreleri membran sitoplazmik veya nükleer proteinler için boyamaya devam etmek mümkündür. Standart immünofloresan yöntemleriyle, aşırı kuvvet monositleri yerinden çıkarabileceğinden yıkama adımlarına dikkat edin.

Ayrıca, yaşlanma ile ilişkili besiyaz gibi enzim bazlı testler de yapılabilir. Bu, yaşlanan hücrelerin lizozomlarının maviye dönmesine neden olur, çünkü küçük boyutları ve küresel şekilleri nedeniyle tanımlanan çok sayıda monosit tarafından seçici olarak bağlanan endotel hücresinde açıkça görüldüğü gibi. Her bir monosit kümesi ayrı bir endotel hücresine karşılık geldiğinden, kümelerin numaralandırılması, tek tabaka içindeki adeziv endotel hücrelerinin gerçek sayısını ve dolayısıyla popülasyon içindeki adeziv endotel hücrelerinin yüzdesini ortaya çıkarır.

Bu, istenirse endotel hücre yapışkanlığının miktarının belirlenmesine izin veren bugüne kadarki tek yöntemdir Endotel tek tabakalarına bağlı monositler bir tripsin EDTA çözeltisi ile yerinden çıkarılabilir ve floresan çağdaş yöntemlerde olduğu gibi bir plaka okuyucu kullanılarak ölçülebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik dört saat içinde ve çok az elle zamanında yapılabilir. Bu prosedürü takiben, tüm yıkama ve smaçlama adımlarının aynı şekilde ve tüm numuneler arasında aynı sayıda tekrarla gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.

İmmünofloresan ve yaşlanma ile ilişkili beta galakto tahlilleri gibi diğer yöntemler, adeziv olan endotel hücrelerinin özelliklerine göre olmayanlara kıyasla özellikleri nelerdir gibi sorularını yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.