Name: Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Öğrenin, dijital damlacık tahlillerinin toplu floresans ölçümünü standart qPCR cihazlarıyla basitleştirmeyi. Bu yöntem, nükleik asit kantifikasyonunu erişilebilir teknolojiyle sağlar ve floresan mikroskopi ile doğrulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, MDA reaktifleri ve protokolleri sağladığı için Liyi Xu'ya teşekkür eder. Bu çalışmayla ilgili tartışmalar için David Feldman ve Navpreet Ranu'ya da teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen PCB'nin Bilimsel Arayüzü'nde Burroughs Wellcome Kariyer Ödülü ile desteklendi.

Not: Bu protokol için damlacıkları mevcut ticari damlacık makinesi 23,29 oluşturulabilir gibi mikroakışkan cihaz imalatı, Bu deney için gerekli değildir. 1. Damlacık oluşturan mikroakışkan Aygıt olun <ol><li> SU-8 Master Fabrikasyon protokolü ile kanallar için ana kalıp hazırlayın önce 31 özetlenen, ama bir damlacık jeneratör maske deseni 32. </li><li> Yumuşak litografi 32,33 tekniklerini kullanarak PDMS cihazları imal. </li></ol> 2. Dökme Damlacık Göstergesi için reaksiyon Mix hazırlayın Not: protokol amplifikasyon reaksiyonlarında pek çok türleri kullanılarak nükleik asitleri ölçmek için kullanılabilir. Bir örnek olarak, çok sayıda Lambda DNA konsantrasyonları MDA için gerekli reaktif verilmiştir. Reaktif ayrıntıları Belirli Reaktifler Tablo listelenmiştir. Damlacıkları içinde şablon dağılımı sufficien bağlıdırNumunenin t karışımı. <ol><li> Elde veya Arındırmak Phi29 DNA polimeraz. <ol><li> Daha önce tedarikçiden 7 veya satın açıklandığı gibi Phi29 arındırın. Gösterilen deneyleri için kullanılan Phi29 saflaştırılmıştır. </li></ol></li><li> 65 mM KOH, 1.65 mM EDTA ve 14 mM DTT içeren denatürasyonu Tamponu 10 ml hazırlayın. </li><li> 65 mM HCI, 0.21 M Tris-Cl pH 7.0 ve 9 mM Tris-CI, pH 8,0 içeren Nötralizasyon Tamponu 10 ml hazırlayın. </li><li> Böyle nükleaz içermeyen su gibi iki standartları, kimse şablon kontrolü (NTC) ve bir yüksek şablon konsantrasyonu (4 pg / etrafında ul Lambda DNA) hazırlayın. Bir qPCR tüpünde Denatürasyon Tampon 3.3 ul her standardın 3.3 ul denatüre. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Nötralizasyon Tamponu 3,3 uL her söndürün. </li><li> Bir qPCR tüpünde Denatürasyon Tampon 3.3 ul ilgi şablonun 3.3 ul denatüre. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 3,3 ul söndürünNötralizasyon Buffer. </li><li> Buz üzerinde örnek başına usta karışımı 11 ul hazırlayın. 2x MDA Reaksiyon karışımı, ana 2x çift-şeritli DNA oluşur (dsDNA) bağlanma, boya, 2x qPCR referans boya, 50 uM randomize oligo, 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu, 4.8 mM dNTP, nükleaz içermeyen su ve 40 ug / ml Phi29 DNA polimerazı. Iyi 7.5.Mix daha pH seviyelerinin daha yüksek veya daha düşük karşılaşmak değil polimeraz sağlamak için son Phi29 DNA polimeraz ekleyin. </li><li> İsteğe bağlı: Daha az yanlış pozitif için önce damlacıklar 34 oluşturan UV ışığı ile ana karışımı maruz. <ol><li> Buz üzerinde 0,5 ml veya 1.5 ml saydam bir tüp içinde örnek başına ön karışımın 10 ul hazırlayın. Ön-karışım 55 uM randomize oligo, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x Phi29 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu, 5.3 mM dNTP ve nükleaz içermeyen su oluşur. </li><li> 34 tarif edildiği gibi buz su tüp yerleştirilir ve bir akü, UV ışığı (254 nm) maruz5.7 J formüle edilmiş dozu / cm 2. </li><li> Ön karışım içinde bulunan 40 ug / ml dsDNA bağlayıcı 1x boya, 1x referans boya ve Phi29 ekleyin. İyice karıştır. </li></ol></li><li> Denatüre şablon veya standart 10 ul ve master karışımı 10 ul birleştirin. İyice karıştır. </li></ol> 3. Damlacık Oluşumu Not: damlacıklar statik elektrik ve kayma gerilmesi çok hassas olabilir. Statik elektrik neden olabilecek giysiler çıkarın ve damlacıklar oluşturan önce kendinizi topraklayın. Mümkün olduğu kadar emülsiyondan, tüpün üstünden emülsiyon tüpleri tutun. Pipet emülsiyonlar çok yavaş, tercihen geniş delik pipet ucuyla. Bir pipet gelen dağıtım yaparken, pipet hızını belirlemek için uç tarafında emülsiyonu izleyebilirsiniz. <ol><li> Form damlacıkları. Deneyler göstermiştir için, mikroakışkan cihaz, bir yağ girişi ve damlacıklar üretmek için bir akış odaklama kavşağın iki sulu girişleri vardır. İki syri kullanınNGE 20.000 1 nl damlacıklar oluşturmak için mikroakışkan çip sayesinde yüzey aktif madde ile bir yağ 55 ul ve reaksiyon karışımı bir 20 ul akış hızlarını kontrol etmek pompalar. </li><li> Bu yüzey aktif madde ile birlikte bir yağ, çok çeşitli olan damlacıkları üretmek mümkündür, ama bileşim, büyük ölçüde, yüksek sıcaklıklarda ve zaman içinde damlacık stabilitesini etkiler: edin. Olası bir kombinasyonu anyonik bir yüzey aktif 19,35 florlu yağ HFE 7500. </li><li> Herhangi bir yöntem 13,36 ile herhangi bir boyutta damlacıklar üretmek ama damlacık popülasyonda boyut farklılaşabilirliği dökme floresan ve bu nedenle tahlilin hassasiyetini etkileyecektir. Gösterilen deneylerde, damlalar 1 nl bir hacimde tek dağılımlı idi. </li><li> PCR tüpleri içine ve sıvı yağ toplayın. Her bir örnek için, kısım 30, optik kapaklar taze PCR tüpleri içine petrol ul ve yağ üstünde damlacıklar 20 ul transfer. Tutarlı hacimleri tahlil ac olarak sağlamakmümkün papaz. </li><li> Yakın tüp gevşek kapakları petrol buharlaşmasına izin verecek şekilde, sıkıca kapakları. </li></ol> 4. İzotermal Büyütme <ol><li> PCR thermocycler, qPCR PCR, ya da sıcak plaka kullanılarak, 7 saat süre ile 30 ° C&#39;de inkübe örnekleri ve 75 ° C&#39;de 1 dakika süre ile etkisiz hale getirirler. Damlacıkların borular bu noktada bir kaç saat için folyo ile kaplı bir buzdolabı bırakılabilir. </li></ol> 5. Veri Toplama ve Analizi <ol><li> Hemen qPCR thermocycler kullanan tüm numuneler için boya flüoresan seviyelerini ölçmek reaksiyon inaktivasyonunu takip. Optimal filtre ayarlarını boya uyarma ve emisyon spektrumları bağlıdır. Bu örnek için, dsDNA bağlayıcı boya için ayarlanmış 492 nm-516 nm filtre ve referans boya için ayarlanmış 585 nm-610 nm filtre kullanın. Diğer floresan ölçüm teknikleri floresan ölçmek için kullanılabilir. </li><li> Her numune için, tarafından dsDNA bağlayıcı boya floresan yoğunluğu bölmekReferans boyanın flüoresan yoğunluğu. Tüm örneklerden arka plan floresan veya hiçbir şablon kontrolü normalize floresan, çıkarma. </li><li> Standartlardan düzeltilmiş floresan ölçümleri kullanarak doğrusal bir standart eğri oluşturun. NTC standart% 0 floresan damlacıklarıyla bir örnek için floresan (&quot;Tüm negatif&quot;) temsil eder ve yüksek şablon konsantrasyonu floresan ölçümü% 100 floresan damlacıklarıyla bir örnek için beklenen floresan (&quot;tüm pozitif&quot;) &#39;dir. Karşılık gelen standart eğri kullanılarak, bunların yığın floresan göre pozitif ve negatif damlacıkların ara oranları tahmin. </li></ol> 6. Üretim Damlacıklar Proof-of-İlke Ölçümleri için <ol><li> Floresan (pozitif) damlalar sağlayın: 0,1 ng Lambda DNA, 1 x dsDNA bağlayıcı boya, 1 x referans boya, 1.5 birim Taq DNA polimeraz, 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1,5 m aşağıdakilerden oluşan bir PCR reaksiyon karışımı hazırlamakM MgCI2, 0.2 mM dNTP ve 0.5 uM primer. Karışım yukanda açıklandığı gibi 30 kat (20 saniye, 20 saniye, 1 dakika için 72 ° C, 55 ° C, 95 ° C) Thermocycle, daha sonra damlacıklar oluşturur. </li><li> Floresan olmayan (negatif) damlalar sağlayın: 1x dsDNA bağlayıcı boyasından oluşan bir PCR reaksiyon karışımı hazırlandı, 1 x referans boya, 1.5 birim Taq DNA polimeraz, 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, 0.2 mM dNTP, ve 0.5 uM primer. Karışım 30 kez (20 saniye için 95 ° C, 20 saniye, 1 dakika süre ile 72 ° C&#39;de 55 ° C), daha sonra damlacıklar oluşturmak Thermocycle. </li><li> Ön karışımlı damlacık oranları Şekillendirme <ol><li> QPCR tüpler içine florlu yağı 20 ul dağıtın, buharlaşmayı önlemek için bir optik kapakla örtün. </li><li> Petrol üstündeki olumsuz oranları: yavaşça istenen olumlu iyi karıştırılmış damlacıkların 10 ul pipetle. Gösterilen sonuçlar, pozitif: negatif oranlarının 1 damla (tüm pozitif), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 ve 0 (bütün neg edildiative). </li></ol></li><li> QPCR thermocycler kullanan tüm numuneler için boya flüoresan seviyeleri ölçülür. Bu protokol için, dsDNA bağlayıcı boya için belirlenen 492 nm-516 nm filtresi ve referans boya için belirlenen 585 nm-610 nm filtresi kullanın. <ol><li> DsDNA referans boya floresan kullanarak boya floresan bağlayıcı Normale. Dahası &quot;tüm pozitif&quot; örnek floresan normalleştirmek. </li></ol></li><li> &quot;Tüm pozitif&quot; ve &quot;negatif&quot; örneklerinden normalize floresan ölçümleri kullanarak doğrusal bir standart eğri oluşturun. Karşılık gelen standart eğri kullanılarak, bunların yığın floresan göre pozitif ve negatif damlacıkların ara oranları tahmin. </li><li> Her oran (n = 3) bağımsız bir damlacık oluşumu ve her bir deney için karıştırılarak deneyi tekrarlayın. </li></ol> 7. Proof-of-Prensibi MDA Deneyi <ol><li> Bir spec ile Lambda DNA stok çözeltisi konsantrasyonunu ölçmektrophotometer. <ol><li> Damlacık ortalama 10 şablon molekülleri gerekli şablon konsantrasyonu hesaplayın. Bu protokol için damlacık hacimleri 1 nl ve Lambda DNA 1 ng yaklaşık 1.9 x 10 7 kopyasını içerir varsayıyorum. Bu nedenle, damlacık başına 10 şablonları nl başına 10 kopya ya da ul başına 526 fg Lambda DNA olacaktır. Damlacıklar oluşacak zaman şablonu, bu nedenle, ilk üst şablon konsantrasyonu / ml 3,2 pg olacak ~ 6x seyreltilmiş olacaktır. </li></ol></li><li> Seri olarak denatürasyon tampon ve eşit hacimde Nötralizasyon Tamponu ile 3,2 ug / ul DNA Lambda seyreltin. 0.1 bir seyreltme faktörü için, Denatürasyon Tamponu 45 ul 10 ul örnek birleştirmek ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Nötralizasyon Tampon 45 İL gidermek için ekleyin. </li><li> Deney için numune kalanını yapmak için adım 7.2 anlatıldığı gibi daha ileri örneği sulandırmak. Gösterilen reaksiyonlarda, ilk şablon konsantrasyonları, 3.2 pg, 320 fg edildi160 fg, 32 fg, 16 fg, 3.2 fg ve mikrolitre başına 1.6 fg. Not: master karışım ilave edildikten sonra son şablon konsantrasyonları 526 fg vardı, 52.6 fg, 26.3 fg, 5.26 fg, mikrolitre başına 2.63 fg, 526 ag ve 263 ag. Sırasıyla, damlacık başına 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 ve 0.005 beklenen Lambda kopyalar. </li><li> Oluşturmak ve adımları 2,5-5,3 tarif edildiği gibi, her örnekten damlacıklar analiz eder. </li><li> Bir dijital fotoğraf makinesi kullanan gösterilen floresan görüntüleri (Şekil 2,3) oda sıcaklığında bir 10x amacı ile bir epi-floresan mikroskop monte edinin. Her numune için görüş oniki alanları edinin. Bir floresan slayt ile elde edilen bir arka plan görüntüsü ile doğru floresan görüntüler. </li><li> Emülsiyon yağı çabuk buharlaşır gibi görüntüleme 37 için bir yer odasına kullanın. </li><li> Bir ImageJ makro (Ek kod dosyası) kullanarak bireysel damlacık yoğunluklarını analiz edin. <ol><li> En iyi N floresan olmayan damlacıkları ayıran bir eşik floresan yoğunluğu seçinYüksek şablon konsantrasyonu görüntülerde floresan damlacıklar gelen TC görüntüler. Bilinmeyen her numune için, bir sınır değerin üzerinde floresan ile damlacıklar kısmını hesaplar. </li></ol></li></ol> 8. PCR ve MDA toplu reaksiyonları <ol><li> PCR reaksiyonu hazırlayın. <ol><li> Seri 0,1 seyreltme faktörü ile şablon DNA sulandırmak. Her seyreltme için, Denatürasyon Tamponu 45 ul şablonun 10 ul birleştirmek ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Nötralizasyon Tampon 45 ul seyreltme birleştirin. </li><li> Örnek başına PCR master 20 ul hazırlayın. 1.1x PCR reaksiyon karışımı, ana Taq DNA polimeraz ul 60 birim /, 11 mM Tris-HCI, 55mm KCI, 1.65 mM MgCl2, 0.22 mM dNTP oluşur, 1.1x boya, 1.1x referans boya ve 550 nM dsDNA bağlayıcı Her astar. </li><li> Seyreltilen değişik şablon 2 ul ve 20 ul master birleştirin. Not: Nihai şablon konsantrasyonları tO gösterilen reaksiyonlar PCR 50 pg, 5 pg, 500 fg, mikrolitre başına 50 fg, 5 fg, 500 ag ve 0 g Lambda DNA idi ve üç kopya halinde yapıldı. </li><li> Aşağıdaki programı ile QPCR makinesinde Thermocycle PCR reaksiyonu. 2 dakika boyunca 72 ° C &#39;de 2 dakika önce 30 saniye, 30 saniye için 20 sn için 57 ° C, 72 ° C, 95 ° C 40 döngü çalıştırın ve 4 ° C&#39; de tutarak. </li><li> DsDNA referans boya floresan önce daha fazla analiz kullanarak boya floresan bağlayıcı Normale. </li></ol></li><li> MDA reaksiyonu hazırlayın. <ol><li> Aşama 8.1.1 açıklandığı gibi örnekleri sulandırmak. </li><li> Buz üzerinde örnek başına usta karışımı 11 ul hazırlayın. 2x MDA Reaksiyon karışımı, ana 2x dsDNA bağlayıcı boya, 2x referans boya, 50 uM randomize oligo oluşur 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu, 4.8 mM dNTP, nükleaz içermeyen su ve 40 ug / ml Phi29 DNA Polimeraz. </li><li> 40 ug Phi29 DNA polimeraz ekleyin / polimeraz d sağlamak için son mloes 7.5 den pH seviyelerinin daha yüksek veya daha düşük değil karşılaşmak. İyice karıştır. </li><li> Bir qPCR tüp içinde Denatürasyon Tamponu 3,3 ul seyreltilmiş numune, 3.3 uL denatüre. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Nötralizasyon Tampon 3.3 ul ekleyin. </li><li> Denatüre şablonun 10 uL ve master karışımı 10 ul birleştirin. İyice karıştır. </li><li> Aşağıdaki programı ile QPCR makinesi MDA reaksiyonu çalıştırın. </li><li> Floresans her 7,5 dakika, ölçüm 4 saat 30 ° C&#39;de tutun. </li><li> 1 dakika süre ile 75 ° C &#39;de inaktive. </li><li> DsDNA referans boya floresan kullanarak boya floresan bağlayıcı Normale. Bundan başka, her numune için maksimum flüoresan ile normalize. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li>
<li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A.%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+strategies+in+the+development+and+analysis+of+molecular+biomarkers+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine.</a> Methods. 59 (1), 101-107 (2013).</li>
<li>Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RefSeq+microbial+genomes+database%3A+new+representation+and+annotation+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).</li>
<li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+is+now%3A+single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).</li>
<li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+MDA+for+enumeration+of+total+nucleic+acid+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e19(2011).</li>
<li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+genomic+diversity%2C+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissecting genomic diversity, one cell at a time.</a> Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).</li>
<li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Something+from+%28almost%29+nothing%3A+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+the+Year+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11 (1), 1(2014).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+digital+PCR+enables+multigene+analysis+of+individual+environmental+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria.</a> Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).</li>
<li>OpenArray Technology Overview. , Life Technologies. <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html</a> (2014).</li>
<li>Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+on+a+SlipChip.%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Digital PCR on a SlipChip.</a> Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).</li>
<li>Heyries, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megapixel+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Megapixel digital PCR.</a> Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).</li>
<li>Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+single+DNA+molecules+into+fluorescent+magnetic+particles+for+detection+and+enumeration+of+genetic+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).</li>
<li>Kiss, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+polymerase+chain+reaction+in+picoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets.</a> Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+hits+its+stride%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital PCR hits its stride.</a> Nat. Methods. 9 (6), 3(2012).</li>
<li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+picoliter+rt-PCR+assays+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics.</a> Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+reinjection+and+coalescence+of+droplets+in+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics.</a> Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).</li>
<li>Rhee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+stabilizer+for+reproducible+picoinjection+in+droplet+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems.</a> Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).</li>
<li>Hatch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Million+droplet+array+with+wide-field+fluorescence+imaging+for+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR.</a> Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).</li>
<li>Illumina. , Technology. <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/technology.html">http://www.illumina.com/technology.html</a> (2014).</li>
<li>Droplet digital PCR applications guide. , Bio-Rad. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr">http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr</a> (2014).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics+for+high-throughput+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics for high-throughput biological assays.</a> Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).</li>
<li>Lage, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+analysis+of+genetic+alterations+in+small+DNA+samples+using+hyperbranched+strand+displacement+amplification+and+array-CGH%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH.</a> Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).</li>
<li>Dean, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).</li>
<li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+detection+of+single-nucleotide+and+copy-number+variations+of+a+single+human+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li>
<li>Mitos Dropix Systems. , Dolomite. <a target="_blank" href="http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system">http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system</a> (2014).</li>
<li>Abate, A. R., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe-vacuum+microfluidics%3A+A+portable+technique+to+create+monodisperse+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions.</a> Biomicrofluidics. 5, 14107(2011).</li>
<li>Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chip+for+the+versatile+chemical+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (80), e50618(2013).</li>
<li>Fainman, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFainman%2C+Y+%22Optofluidics+%3A+fundamentals%2C+devices%2C+and+applications%22">Optofluidics : fundamentals, devices, and applications</a>. , McGraw-Hill. (2010).</li>
<li>Xia, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G.M.+Softlithographie%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">G.M. Softlithographie.</a> Angew Chem. 110 (5), 26(1998).</li>
<li>Woyke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+MDA+reagents+for+single+cell+whole+genome+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification.</a> PLoS One. 6 (10), e26161(2011).</li>
<li>System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. , (2014).</li>
<li>Utada, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS One. 8 (4), e62961(2013).</li>
<li>Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+analysis+of+copy+number+variation+in+a+DNA+sample+using+digital+PCR+on+a+nanofluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.</a> PLoS One. 3 (8), e2876(2008).</li>
<li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+nucleic+acids+with+large+dynamic+range+using+multivolume+digital+RT-PCR+on+a+rotational+SlipChip+tested+with+HIV+and+hepatitis+C+viral+load%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load.</a> J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li>
<li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503(2004).</li>
<li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li>
<li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li>
</ol>

Broad Institute, bu çalışmanın bazı yönlerini içeren bir patent başvurusunda bulunmak için harekete geçebilir.

Dijital deneyler, nadir görülen hücrelerin tespit ve nükleik asit moleküllerinin bireyin sayımı sağlayan güçlü bir yöntem vardır. Bununla birlikte, dijital deneyler de rutin olarak ticari olarak temin edilebilen yöntemler ile ilişkili özel ekipman maliyeti, kısmen, analitik laboratuar uygulanan bağlı değildir. Burada bir standart gerçek zamanlı kantitatif PCR makine kullanarak basitleştirilmiş bir analog okuma ile nükleik asitlerin miktarının belirlenmesi için bir son nokta dijital tahlil açıklar. Bu yöntem set-up hızlı...

Nükleik asit ölçümü (dijital PCR) 1-4 ve taban sırası (sıralama) için dijital analizler şiddetle yaşam bilimleri ve tıp etkilemektedir. Dijital deneyleri, yüksek hassasiyet sağlayan deneyler üzerinde yüzeysel karşılaştırmalar sağlayarak ve en önemlisi, karşılaştırılabilir veriler 5 (Tablo 1) içeren büyük veritabanları yapımını sağlayan mutlak ölçek (bir kontrole göre değil) moleküler sayımı ölçümü sağlar. Son 15 yılda, tüm genom amplifikasyonu (WGA) nükleik asit amplifikasyonu için genel bir araç olarak PCR ile birlikte ortaya çıktı. PCR gibi, WGA kolayca tespit veya baz sıralama gibi daha sonraki analizler için kullanılabilecek bir seviyeye kadar dakikalık numune elemanlarını yükselterek analitik ve preparatif uygulamalar için kullanışlıdır. PCR aksine, WGA tercih bilinmiyor sekanslar dahil olmak üzere numunedeki tüm sekanslar, amplifikasyon sağlayan belirli bir DNA lokusu için özel değildir.PCR ve WGA arasındaki bu temel fark birbirine tamamlayıcı yöntemler yapar ve bunların uygulamada farklı zorluklar doğurur. WGA reaksiyonlar 6 yüksek verimi tek moleküllerin 7, tek hücreler 8 ve miktar tayini ya da daha fazla analiz için diğer düşük biyokütle örnekleri 9 genomik DNA rutin amplifikasyonunu sağlamaktadır. WGA kimya ile ilgili önemli zorluklar onun kirlere karşı aşırı hassasiyet ve bireysel şablon molekülleri 6 genelinde dengesiz amplifikasyon vardır. Tek hücreli sıralama Ancak, WGA kazanıyor popülerlik WGA tarafından WGA teknolojisi 10, ve şablon nicelikleme &quot;katil uygulaması&quot; olarak ortaya çıkmıştır uygulamanın 7 birçok alanda önemlidir. Dijital nükleik asit ölçümü için Alet, daha önce Valfli ve supapsız mikroakışkan forma çeşitli tarif edilmiştirdamlacık bazlı deneyler dahil olmak üzere, ts 11-14, 15,16 (Tablo 2). Ancak, dijital analiz için ticari mikroakışkan sistemler reaksiyon kurulumu ve ürün tespiti 17 için özel ekipman gerektirir. Özel valfli Mikroakiskan esnek, ama hassas mikroüretim ve pnömatik kontrol sistemleri 18 gerektirir. Bu emülsiyon tabanlı dijital deneyleri 19,20 için monodispers mikro damlacıklar yapmak nispeten basit olmakla birlikte, dijital okuma büyük ölçekli geniş alan görüntüleme ya gerektiren, (popüler yeni nesil dizileme teknolojileri benzeri) teknik külfetli olduğu 21,22 veya Yüksek hızlı damlacık algılama 23-25 ​​akış tabanlı. İdeal olarak, bir dijital deney karmaşık enstrümantasyon ihtiyacını azaltarak ve hızlı bir şekilde dışarı okunacak örneklerin çok sayıda izin okunmasını set-up basit olurdu. Burada PCR i konvansiyonel gerçek zamanlı kullanan dijital damlacık deneyleri okuma için basitleştirilmiş bir yöntem tarifişle- mini yaparken damlacık tabanlı dijital testlerin toplu floresan ölçmek için. Yeni yaklaşım, dijital PCR uygulanabilir olsa da, (PCR için mükemmel sonuç verir) sorunlu gerçek zamanlı amplifikasyon deneylerini analog olan bir dijital WGA deneyleri için özellikle avantajlıdır. WGA yaygın sekansı, uzunluğu, ve baz içeriği heterojendir şablon molekülleri ile örneklere uygulanır. Bu farklı şablon molekülleri referans (&quot;standart&quot;) eşleşen özelliklere sahip numunenin kullanımını gerektiren, farklı oranlarda 6 güçlendirilir. Genellikle, böyle bir standart mevcuttur ya da gelen örneklerin özellikleri bilinmemektedir. Giriş kütlesi, moleküllerin giriş numarasını, iki ya da ne bir arada - WGA kimyaları giriş malzeme ve uzunluğu bağımlı mülkiyet heterojenliği 26 de sayısal ediliyor ne de belirsizlik yaratarak sonuçların yorumlanmasını zorlaştırmaktadır. FHerhangi bir dizinin kirletici molekülleri müdahale için potansiyele sahip çünkü inally, dizi-dışı özgüllük kantitatif PCR daha kirlenmeye kantitatif çoklu deplasman amplifikasyon (MDA) daha duyarlı hale getirmektedir. Mikroakışkan dijital tahliller şablon molekülleri ayırma ve daha az kirletici örneklenmiş öyle ki tepkime hacimleri azaltarak kirlenmesini hitap etmektedir. Burada popüler bir izotermal WGA yöntemi, MDA 27 kullanın. Unutmayın ki, PicoPlex ve MALBAC 28 dahil olmak üzere birçok diğer WGA kimyaları ilk izotermal sarmal yer değiştirme merdivenlerinde önemlisi bağlıdır. Izotermal adımlar nicel WGA analog gerçek zamanlı deneyleri uygulanarak meydan alevlenmesine. WGA ne tamamen kurulum sırasında engelledi istenmeyen değişken ön büyütme giden, ne heterojen moleküllerin çoğaltma tamamlanmasına tahrik ve durdurulabilir bir şekilde (&quot;sağlanıncaya&quot;) discretized edilebilir PCR 11 gibi sonraki döngüsü önce </sup&gt; (Şekil 1). WGA için dijital tahlil biçimi nedeniyle tahlil uç noktada sayımı için her molekülün ayrılığı tipik reaksiyon kurulum işlemlerini barındıran özgün okuma doğruluğu amplifikasyon verimliliği varyasyon büyük ölçüde bağımsız olacağını ifade (yani preamplıfikasyon sonuçlarını etkilemez). Tahlil uç noktada damlacık başına sinyal seviyesi damlacık hacmine bağlıdır olarak tahlil, üniforma hacimli yağ üretilen damlacıklar bağlıdır ve biz sonuçların tutarlılığı damlacık boyutları dağılımı boyunca ortalama bağlıdır istemiyorum. Monodispers damlacıkları yapma şimdi (yaklaşık 3.500 monodispers damlacık kağıtları 2013 yılından bu yana yayınlanmış) standart bir prosedür olduğunu, ancak mikroakışkan enstrümantasyon 25 gerektirir. Aslında, fazla altı şirketlerin bu tür damlacıkların üretimine dayanan bağımsız ticari ürünler geliştirdik ve damlacık yapma mikroakışkan cips23,29 ticari olarak temin edilebilir. Bu çalışma için, in-house (Protokol bakınız) üretilen özel mikroakışkan cihazları kullanılır. Şırınga cihazlar yoluyla akışı da ticari olarak temin edilebilir sürücü pompalar, fakat alternatif olarak, maliyetleri azaltmak için 30 vakum bağlı akış için tek tek kullanımlık şırınga ile sübstitüe edilmiş olabilir.

<table><tbody><tr><td>Evagreen Boya</td><td>Biotium</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>New England Biyoteknoloji</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu</td><td>New England Biyoteknolojileri</td><td>B0269S</td><td>Agrega Lambda DNA'sı çözülene kadar periyodik olarak girdap</td></tr><tr><td></td><td>New England Biyoteknoloji</td><td>N3011S</td><td>50 oC'ye ısıtılır ve söndürülür seyreltme öncesi buz</td></tr>, <tr><td>Randomize MDA oligoları</td>, <td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>, 5'-NNNNN*N-3'PCR</td></tr> <tr><td>primerleri</td><td>, Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>, 5'-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3' ve 5'-TGCGGCAAAGACAACGG-3'</td></tr><tr><td>UltraPure Nükleaz içermeyen su</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>Kullanmadan önce Stratalinker 2400'de 30 dakika UV ile muamele edilmiş (isteğe bağlı)</td></tr><tr><td>ROX referans boyası</td><td>Life Technologies</td><td>12223-012</td><td></td></tr><tr><td>PCR optik şerit kapakları</td><td>Life Technologies</td><td>4323032</td> PCR tüpleri Agilent Technologies 401428 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP (her biri 25 mikromolar)</td><td>Agilent Teknolojiler</td><td>200415</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler - Mx3000P qPCR sistemi</td><td>Agilent Technologies</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Bariyer pipet uçları</td><td>VWR</td><td>89003-046</td><td></td></tr><tr>evagreen <td>Bio-rad</td><td>186-4005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JumpStart Taq ReadyMix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2893-100RXN</td><td></td></tr> için biyo-rad yağı</tbody></table>

dijital nükleik asit kantifikasyon tahliller basit toplu saati

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Dijital deneyler hücrelerin nadiren ve tek tek nükleik asit moleküllerinin sayımı saptanmasını sağlayan güçlü yöntemlerdir. Ancak, dijital tahliller rutin nedeniyle maliyet ve piyasada mevcut yöntemlerle ilgili özel ekipman, uygulanan değil hala. Burada damlacık tabanlı dijital tahliller kütle floresan ölçmek için geleneksel bir gerçek-zamanlı PCR cihazı kullanılarak dijital damlacık deneylerinin okunması için basit bir yöntem sunulmaktadır. Biz sentetik damlacık karışımları ve damlacık dijital çoklu deplasman amplifikasyon (MDA) testi kullanılarak toplu okuma testinin performansını karakterize. Dijital reaksiyon biçimi Kantitatif MDA özellikle faydaları, ama bizim yeni bir yöntem herhangi bir dijital tahlil için de geçerlidir. Dijital PCR gibi kurulan dijital deney protokolleri için, bu yöntem, hızlandırmak ve deney okuma kolaylaştırmak için hizmet eder. Bizim toplu okuma metodolojisi partitione avantajlarını getiriyorözel okuma enstrümantasyon gerek kalmadan d tahliller. Bu standart için gereksinimler geleneksel gerçek zamanlı deney için daha az talepkar olmasına rağmen toplu okuma metodolojisi temel sınırlamalar, damlacık sayma platformları ve standart bir numune için ihtiyacı ile karşılaştırıldığında dinamik aralık azalır. Kantitatif tüm genom amplifikasyonu (WGA) WGA reaksiyonlarda kirletici maddeler için test etmek için kullanılır ve farmasötik kalite kontrol ve astrobiyolojiden dahil olmak üzere çeşitli uygulama alanlarında yöntemi büyük umut veren bilinmeyen dizilerle DNA parçalarının varlığını tespit etmek için, en hassas bir şekilde işleme tabi tutulur.

Geleneksel bulk / gerçek zamanlı kantitatif PCR okumaları ve kantitatif WGA tahlilleri (Şekil 1) her ikisi için de kullanılabilmesine rağmen, bir dijital sayısal deneyler avantajları (Tablo 1) sağlar. Açıklanan yöntemde, basit bir toplu uç ölçümü (Şekil 2) ile mikro damlacık formatında dijital deneyleri okudu. Bu yöntem genel olarak uygulanabilir iken bu yöntem, geleneksel gerçek zamanlı deneyleri için özel zorluklar sunuyor, çünkü biz niceliksel WGA (MDA) odaklanır. </...

Basitleştirilmiş (analog) bir okuma ile nükleik asitleri ölçmek için bir uç nokta dijital testi tanımlıyoruz. Damlacık bazlı dijital tahlillerin toplu floresansını özel enstrümantasyon yerine standart bir qPCR makinesi kullanarak ölçüyoruz ve sonuçlarımızı mikroskopi ile doğruluyoruz.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Bu prosedürün genel amacı, bir analizin toplam floresansını ölçmek için geleneksel bir gerçek zamanlı PCR cihazı kullanarak dijital damlacık analizlerinin okumasını basitleştirmektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen örneklerin ve iki standardın amplifikasyon reaksiyonlarının hazırlanması ve ardından her birini binlerce nanolitre boyutunda reaktöre bölmek için damlacıkların oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, her bir damlacık içindeki nükleik asitleri amplifiye etmek için damlacıkların inkübe edilmesidir.Ardından, her bir örneğin veya standartın toplam floresansı, standart bir QPC veya termosiklatör ile ölçülür. Son adım, standart örneklerden oluşturulan bir standart eğriyi kullanarak, ilgilenilen örneklerdeki floresan damlacık oranını tahmin etmektir. Bu yöntemin performansını doğrulamak için, toplam floresan analizinin kantifikasyon performansını bağımsız olarak değerlendirmek amacıyla floresan mikroskobu kullanılabilir.Bu tekniğin damlacık sayımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, özel enstrümantasyon gerektirmemesidir. Bu analiz hazırlığına başlamadan önce, protokol metninde açıklanan tüm gerekli reaktiflerin yanı sıra iki standart gereklidir. Bunlar; nükleaz içermeyen su gibi bir şablon kontrolü ve lambda DNA gibi yüksek şablon konsantrasyonuna sahip bir standarttır. Her bir standarttan 3,3 µL'yi, bir qPCR tüpü içerisinde 3,3 µL denatürasyon tamponu ile denatüre edin.Oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Her birini 3,3 µL nötralizasyon tamponu ile söndürün. Benzer şekilde, ilgili kalıbın 3,3 µL'sini, oda sıcaklığında üç dakika inkübe edilen 3,3 µL denatürasyon tamponu ile denatüre edin.3.3 µL nötralizasyon tamponu ile söndürün. Daha az veya yalancı pozitif sonuç için örnek başına 11 µL master karışım hazırlayın. Damlacıkları oluşturmadan önce master karışımı UV ışığına maruz bırakın.İlk olarak, buz üzerinde 0,5 mililitrelik veya 1,5 mililitrelik şeffaf bir tüp içerisinde örnek başına 10 µL ön karışım hazırlayın. Ön karışım; randomize oligo, B-S-A-D-N-A polimeraz reaksiyon tamponu, dn, NTP'ler ve nükleaz içermeyen sudan oluşur. Tüpü buz üzerindeki suya yerleştirin ve UV maruziyetinin ardından UV ışığına maruz bırakın.A-D-S-D-N-A bağlayıcı boyayı ve referans diyeti ön karışım karışımına ekleyin. Polimerazın 7.5'ten çok daha yüksek veya düşük pH seviyeleriyle karşılaşmamasını sağlamak için PHI 29 DNA polimerazı en son ekleyin. İyi karıştırın; 10 µL denatüre şablon veya standart ile 10 µL master karışımı birleştirip iyice karıştırın.Damlacıklar statik elektriğe ve kayma gerilmesine karşı çok hassas olabildiğinden, deney yapan kişi statik elektrik oluşturabilecek kıyafetlerini çıkarmalı ve damlacıkları oluşturmadan önce bulunduğu yeri topraklamalıdır. Bu gösterim için kullanılan mikroakışkan cihaz kurum içinde üretilmiştir; yağ girişi ve damlacık oluşturmak için akış odaklama birleşimi olan iki sulu girişten oluşmaktadır. Sürfaktan içeren 55 microliters yağın ve 20 microliters reaksiyon karışımının mikroakışkan çip üzerindeki akış hızlarını kontrol etmek için iki şırınga pompası kullanın.20.001 nanolitre damlacıklar üretmek için en zor adımlardan biri, emülsiyonu bozmadan damlacıkları toplamaktır. Pipetleme işleminin yavaşça ve tercihen geniş ağızlı bir uç kullanılarak yapılması önemlidir.Her bir örnek için tüm damlacıkları PCR tüplerine toplayın. Geniş ağızlı bir uç kullanarak ve çok yavaş pipetleme yaparak, optik kapaklı taze PCR tüplerine 30 µL yağ paylaştırın. Yağın üzerine 20 µL damlacık aktarın.Tutarlı hacimler, analizin mümkün olduğunca doğru olmasını sağlar. Tüp kapaklarını sıkıca kapatın; gevşek kapaklar yağın buharlaşmasına neden olur. Emülsiyon tüplerini, emülsiyondan mümkün olduğunca uzak olacak şekilde tüpün üst kısmından tutun. İzotermal amplifikasyon için bir PCR termosiklatör, A-Q-P-C-R termosiklatör veya bir ısıtıcı plaka kullanılabilir.Bu gösterimde A-Q-P-C-R termosiklet cihazı kullanılmıştır. Örnekleri 30 °C'de yedi saat inkübe edin ve 75 °C'de bir dakika boyunca inaktive edin. Reaksiyon ve aktivasyonun hemen ardından.QPCR termal döngüleyici kullanarak tüm örneklerin floresans seviyelerini ölçün. Her bir örnek için, dsDNA bağlayıcı boyanın floresans yoğunluğunu referans boyanın floresans yoğunluğuna bölün.Arka plan floresansını veya kalıp içermeyen kontrolün normalize edilmiş floresansını tüm örneklerden çıkarın. Standartlardan elde edilen düzeltilmiş floresans ölçümlerini kullanarak doğrusal bir standart eğrisi oluşturun. Kalıp içermeyen kontrol standardı, %0 floresan damlacıklı bir örnek ile yüksek kalıp konsantrasyonu için floresansı temsil eder.Floresan ölçümü, ilgili standart eğrisi kullanılarak %100 floresan damlacıklara sahip bir örnek için beklenen floresanstır. Pozitif ve negatif damlacıkların ara oranlarını, toplam floresan değerlerine dayanarak tahmin edin. Bu yöntem, damlacık tabanlı dijital analizlerin toplam floresanını ölçmek için geleneksel bir gerçek zamanlı PCR cihazı kullanır.Floresan ve floresan olmayan damlacıklar farklı oranlarda önceden karıştırılmış ve toplu floresans ile pozitif damlacık fraksiyonu arasında bir karşılaştırma yapılmıştır. Beklendiği üzere, toplu floresans ve pozitif damlacık sayıları, girişteki floresan damlacık fraksiyonu ile doğrusal olarak ölçeklenmektedir. Standartlara dayalı öngörülen oranlar, beklenen floresan giriş fraksiyonları ile karşılaştırılmıştır.Çizgi, doğrusal bir ilişki varsayıldığında beklenen değeri göstermektedir. Sonuçlar, iki logluk dinamik aralık boyunca damlacık oranı miktar tayininde iyi bir performans sergilemektedir. Bu yöntemi gerçek bir kantitatif tüm genom amplifikasyon testi ile test etmek için; bir dijital damlacığın floresan seviyeleri ve pozitif damlacık oranları.Artan kalıp Lambda DNA konsantrasyonları ile MDA analizi ölçülmüştür. Çizgi, deney verilerini modellemek için Poisson dağılımı kullanılarak beklenen floresan fraksiyonu göstermektedir. Damlacıkların temsili floresan görüntüleri gösterilmiştir; dijital MDA örneklerinden elde edilen hem toplu (bulk) floresan hem de pozitif damlacık fraksiyonu, damlacık başına ortalama kalıp miktarına göre beklendiği gibi ölçeklenmektedir ve bu durum, toplu okumanın dijital bir analiz sonucunu güvenilir bir şekilde yansıtabileceğini göstermektedir.Bu yöntem, analiz okumasını hızlandırarak, paralelleştirerek ve basitleştirerek dijital PCR gibi diğer dijital analizlere fayda sağlayabilir.

simple-bulk-readout-of-digital-nucleic-acid-quantification-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Pratik ve verimli bir alternatif olarak geleneksel nükleik asit kantitatif metodolojiye NanoDrop microvolume sistemlerinin kullanımı iki microvolume nükleik asit kantitatif protokolleri gösteri ile tarif edilir.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Bu iletişim, doğruluk ve tekrarlanabilirlik dsDNA ve protein kantitatif BioSpec-nano UV-VIS spektrofotometre veri sunmaktadır. Ultra-küçük birimler bile otomatik silme fonksiyonu, hacmi ve daha kesin sonuçlar için en az taşınmasını sonuçları artırıyor (1 ila 2 L), tekrarlanabilirlik, mükemmel.

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Bu videoda, iki farklı genetik belirteci aynı anda tespit etmede yararlı olan geleneksel PCR tekniğinin bir modifikasyonu olan çift yönlü dijital PCR (ddPCR) tekniğini gösteriyoruz. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız olarak amplifiye edilen nanolitre boyutunda emülsifiye edilmiş damlacıklara bölünür ve hedef dizilerin başlangıç konsantrasyonunu hesaplamak için damlacıkların fraksiyonundan farklı renkli floresan amplifikasyon sinyallerinin tespiti kullanılır.

Çift genetik belirteçlerin eş zamanlı olarak ölçülmesi için dubleks dijital PCR

Bu video, DNA örneklerindeki tek nükleotid varyasyonlarının tespiti için tüp içinde çip formatında dijital PCR'nin faydasını göstermektedir. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız PCR reaksiyonları olarak işlev gören odalara bölünür ve odalardaki güçlendirilmiş hedeflerden gelen floresan sinyallerinin tespiti, numunedeki varyant alelin frekansını hesaplamak için kullanılır.

Tek nükleotid varyantlarının miktar tayini için tüp içinde çip tabanlı dijital PCR

Kolorimetrik tahlillerin paketi hızla ayırt edici protein, RNA, DNA, ve potansiyel olarak heterojen biyomoleküler örneklerinde yeniden ducing şekerler için açıklanmıştır.

Rapid Kolorimetrik Tahliller Nitelik Biyomoleküler Örnekleri RNA ve DNA ayırt etmek

Onkoloji örneklerinin hedeflenen yeni nesil dizilimi için entegre bir sistem tanımlanmıştır. Bu çapraz platform sistemi, düşük kaliteli ve düşük miktarlı tümör biyopsileri için optimize edilmiştir, düşük DNA girdilerini barındırır, iyi karakterize edilmiş çok varyantlı kontroller içerir ve kantitatif pre-analitik kalite kontrol önlemleriyle bilgilendirilen yeni bir varyant arayan içerir.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Boya bazlı bir kimya ve damlacık dijital PCR teknolojisi kullanılarak hücresiz mikroRNA'ların miktar tayini için hassas ve doğru bir yöntem açıklanmaktadır.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) amplifikasyon ve sıralama tek, tam uzunlukta (sağlam ve arızalı) HIV-1 proviruses yakınındaki bir verimli ve yüksek işlem hacmi yöntemi sağlar ve potansiyellerini belirlenmesi için izin verir çoğaltma-yetkinlik. DÖNDÜRÜR önceki deneyleri gizli HIV-1 rezervuar sıralamak için tasarlanmış sınırlamalar üstesinden gelir.

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektör genom kopyalarının kesin miktar tayini kritiktir, ancak standart bir protokol henüz oluşturulmamıştır. Bu protokol, saflaştırılmış AAV numunelerinin hazırlanması ve viral genom titresinin güvenilir bir şekilde ölçülmesi için dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonunun (dd_PCR) yürütülmesi için doğrulanmış bir yöntemi tanımlar.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saflaştırılmış Vektör Örneklerinde Adeno İlişkili Viral Genomların Miktar Tayini

Bu protokol, Mycobacterium tuberculosis'teki 18 ilaca dirençli bölgenin uzun okumalı bir dizileme platformu kullanılarak hedeflenen derin dizilimi için optimize edildi ve ardından uzun okunan veriler için tasarlanmış tüberküloza özgü bir biyoinformatik boru hattı ile analiz edildi.

Uzun Okuma Dizileme Teknolojilerini Kullanarak Amplikon Dizileme

Bu protokol, bir sinyal raportörü olarak floresan ışıklı aptamer DAP-10-42 kullanan bölünmüş hibridizasyon problarının tasarımını ve bunların nükleik asit tespiti ve tek nükleotid ikameleri ile hedefler arasında farklılaşma için uygulamalarını ana hatlarıyla belirtir.

Diziye Özgü Nükleik Asit Analizi için Sinyal Raportörü Olarak DNA Floresan Işıklı Aptamer Kullanan Bölünmüş Hibridizasyon Probu

Öğrenin, dijital damlacık tahlillerinin toplu floresans ölçümünü standart qPCR cihazlarıyla basitleştirmeyi. Bu yöntem, nükleik asit kantifikasyonunu erişilebilir teknolojiyle sağlar ve floresan mikroskopi ile doğrulanır.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Daha fazla video keşfet