Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Bu prosedürün genel amacı, bir analizin toplam floresansını ölçmek için geleneksel bir gerçek zamanlı PCR cihazı kullanarak dijital damlacık analizlerinin okumasını basitleştirmektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen örneklerin ve iki standardın amplifikasyon reaksiyonlarının hazırlanması ve ardından her birini binlerce nanolitre boyutunda reaktöre bölmek için damlacıkların oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, her bir damlacık içindeki nükleik asitleri amplifiye etmek için damlacıkların inkübe edilmesidir.

Ardından, her bir örneğin veya standartın toplam floresansı, standart bir QPC veya termosiklatör ile ölçülür. Son adım, standart örneklerden oluşturulan bir standart eğriyi kullanarak, ilgilenilen örneklerdeki floresan damlacık oranını tahmin etmektir. Bu yöntemin performansını doğrulamak için, toplam floresan analizinin kantifikasyon performansını bağımsız olarak değerlendirmek amacıyla floresan mikroskobu kullanılabilir.

Bu tekniğin damlacık sayımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, özel enstrümantasyon gerektirmemesidir. Bu analiz hazırlığına başlamadan önce, protokol metninde açıklanan tüm gerekli reaktiflerin yanı sıra iki standart gereklidir. Bunlar; nükleaz içermeyen su gibi bir şablon kontrolü ve lambda DNA gibi yüksek şablon konsantrasyonuna sahip bir standarttır. Her bir standarttan 3,3 µL'yi, bir qPCR tüpü içerisinde 3,3 µL denatürasyon tamponu ile denatüre edin.

Oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Her birini 3,3 µL nötralizasyon tamponu ile söndürün. Benzer şekilde, ilgili kalıbın 3,3 µL'sini, oda sıcaklığında üç dakika inkübe edilen 3,3 µL denatürasyon tamponu ile denatüre edin.

3.3 µL nötralizasyon tamponu ile söndürün. Daha az veya yalancı pozitif sonuç için örnek başına 11 µL master karışım hazırlayın. Damlacıkları oluşturmadan önce master karışımı UV ışığına maruz bırakın.

İlk olarak, buz üzerinde 0,5 mililitrelik veya 1,5 mililitrelik şeffaf bir tüp içerisinde örnek başına 10 µL ön karışım hazırlayın. Ön karışım; randomize oligo, B-S-A-D-N-A polimeraz reaksiyon tamponu, dn, NTP'ler ve nükleaz içermeyen sudan oluşur. Tüpü buz üzerindeki suya yerleştirin ve UV maruziyetinin ardından UV ışığına maruz bırakın.

A-D-S-D-N-A bağlayıcı boyayı ve referans diyeti ön karışım karışımına ekleyin. Polimerazın 7.5'ten çok daha yüksek veya düşük pH seviyeleriyle karşılaşmamasını sağlamak için PHI 29 DNA polimerazı en son ekleyin. İyi karıştırın; 10 µL denatüre şablon veya standart ile 10 µL master karışımı birleştirip iyice karıştırın.

Damlacıklar statik elektriğe ve kayma gerilmesine karşı çok hassas olabildiğinden, deney yapan kişi statik elektrik oluşturabilecek kıyafetlerini çıkarmalı ve damlacıkları oluşturmadan önce bulunduğu yeri topraklamalıdır. Bu gösterim için kullanılan mikroakışkan cihaz kurum içinde üretilmiştir; yağ girişi ve damlacık oluşturmak için akış odaklama birleşimi olan iki sulu girişten oluşmaktadır. Sürfaktan içeren 55 microliters yağın ve 20 microliters reaksiyon karışımının mikroakışkan çip üzerindeki akış hızlarını kontrol etmek için iki şırınga pompası kullanın.

20.001 nanolitre damlacıklar üretmek için en zor adımlardan biri, emülsiyonu bozmadan damlacıkları toplamaktır. Pipetleme işleminin yavaşça ve tercihen geniş ağızlı bir uç kullanılarak yapılması önemlidir.

Her bir örnek için tüm damlacıkları PCR tüplerine toplayın. Geniş ağızlı bir uç kullanarak ve çok yavaş pipetleme yaparak, optik kapaklı taze PCR tüplerine 30 µL yağ paylaştırın. Yağın üzerine 20 µL damlacık aktarın.

Tutarlı hacimler, analizin mümkün olduğunca doğru olmasını sağlar. Tüp kapaklarını sıkıca kapatın; gevşek kapaklar yağın buharlaşmasına neden olur. Emülsiyon tüplerini, emülsiyondan mümkün olduğunca uzak olacak şekilde tüpün üst kısmından tutun. İzotermal amplifikasyon için bir PCR termosiklatör, A-Q-P-C-R termosiklatör veya bir ısıtıcı plaka kullanılabilir.

Bu gösterimde A-Q-P-C-R termosiklet cihazı kullanılmıştır. Örnekleri 30 °C'de yedi saat inkübe edin ve 75 °C'de bir dakika boyunca inaktive edin. Reaksiyon ve aktivasyonun hemen ardından.

QPCR termal döngüleyici kullanarak tüm örneklerin floresans seviyelerini ölçün. Her bir örnek için, dsDNA bağlayıcı boyanın floresans yoğunluğunu referans boyanın floresans yoğunluğuna bölün.

Arka plan floresansını veya kalıp içermeyen kontrolün normalize edilmiş floresansını tüm örneklerden çıkarın. Standartlardan elde edilen düzeltilmiş floresans ölçümlerini kullanarak doğrusal bir standart eğrisi oluşturun. Kalıp içermeyen kontrol standardı, %0 floresan damlacıklı bir örnek ile yüksek kalıp konsantrasyonu için floresansı temsil eder.

Floresan ölçümü, ilgili standart eğrisi kullanılarak %100 floresan damlacıklara sahip bir örnek için beklenen floresanstır. Pozitif ve negatif damlacıkların ara oranlarını, toplam floresan değerlerine dayanarak tahmin edin. Bu yöntem, damlacık tabanlı dijital analizlerin toplam floresanını ölçmek için geleneksel bir gerçek zamanlı PCR cihazı kullanır.

Floresan ve floresan olmayan damlacıklar farklı oranlarda önceden karıştırılmış ve toplu floresans ile pozitif damlacık fraksiyonu arasında bir karşılaştırma yapılmıştır. Beklendiği üzere, toplu floresans ve pozitif damlacık sayıları, girişteki floresan damlacık fraksiyonu ile doğrusal olarak ölçeklenmektedir. Standartlara dayalı öngörülen oranlar, beklenen floresan giriş fraksiyonları ile karşılaştırılmıştır.

Çizgi, doğrusal bir ilişki varsayıldığında beklenen değeri göstermektedir. Sonuçlar, iki logluk dinamik aralık boyunca damlacık oranı miktar tayininde iyi bir performans sergilemektedir. Bu yöntemi gerçek bir kantitatif tüm genom amplifikasyon testi ile test etmek için; bir dijital damlacığın floresan seviyeleri ve pozitif damlacık oranları.

Artan kalıp Lambda DNA konsantrasyonları ile MDA analizi ölçülmüştür. Çizgi, deney verilerini modellemek için Poisson dağılımı kullanılarak beklenen floresan fraksiyonu göstermektedir. Damlacıkların temsili floresan görüntüleri gösterilmiştir; dijital MDA örneklerinden elde edilen hem toplu (bulk) floresan hem de pozitif damlacık fraksiyonu, damlacık başına ortalama kalıp miktarına göre beklendiği gibi ölçeklenmektedir ve bu durum, toplu okumanın dijital bir analiz sonucunu güvenilir bir şekilde yansıtabileceğini göstermektedir.

Bu yöntem, analiz okumasını hızlandırarak, paralelleştirerek ve basitleştirerek dijital PCR gibi diğer dijital analizlere fayda sağlayabilir.