Phosphopeptides Gelişmiş Zenginleştirme için Makrogözenekli Polimer Monoliths üzerinde yüksek Gözenekli Koordinasyon Polymer Coatings Hazırlanması

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fosfo peptitlerin seçici ekstraksiyonunda geliştirilmiş performansa sahip yeni bir destek materyali hazırlamaktır. Bu, uygun fonksiyonel gruplara sahip gözenekli bir polimer kılcal monolitin uygun şekilde hazırlanmasıyla elde edilir. İlk olarak, bir metal türü, bir polimer monolitin fonksiyonel grupları üzerinde hareketsiz hale getirilir, bu da desteği fosfo peptitlerin ekstraksiyonu için seçici hale getirir.

Metal organik çerçevenin birden fazla katmanının daha sonraki adım adım büyümesi, metal bölgelerin miktarını arttırmak ve böylece fosfo peptitler için seçiciliği arttırmak için gerçekleştirilir. Sonuçlar, matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu, uçuş süresi kütle spektrometrisine dayalı protein sindirimlerinden fosfo peptitlerin ekstraksiyonu için gelişmiş seçicilik göstermektedir. O peptidinin zenginleştirilmesi genellikle, bir kromatografik kolona paketlenmiş geleneksel silika partikülleri veya polimer partikülleri üzerinde gerçekleştirilen metal aslan afinite kromatografisi ile yapılır.

Malzememiz, iyi kütle taşıma özelliklerine sahip makro gözenekli bir polimer monolitin avantajlarını metal bir organik çerçevenin yüksek bağlama kapasitesi ile birleştirir. Bunu başarmanın yolu, metal organik çerçeveyi monolitin yüzeyinden sırayla büyütmektir, böylece sonunda analit ile etkileşime girebilecek çok sayıda metal hat katmanına sahip oluruz: Polimer monolit hazırlığının görsel gösterimi ve metal organik çerçeve büyümesinin her ikisi de önemlidir çünkü öğrenmeleri çok zordur. İyi yüzey özelliklerine ve gözenekliliğe sahip bir monolit elde etmek için dikkat edilmesi gereken birkaç önemli adım vardır.

Başlamak için, poliamid kaplı ve 25 mililitrelik bir cam şırıngaya bağlı 100 mikron iç çapa sahip erimiş bir silika kılcal damardan iki metre kesin ve kılcal damarı asetonla yıkayın. Ardından kılcal damarı suyla durulayarak asetonu çıkarın. Daha sonra, 0.2 molar sulu sodyum hidroksit ile doldurulmuş 250 mikrolitrelik bir cam şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ve iç silika kaplamayı aktive etmek için çözeltiyi dakikada 25 mikrolitre noktasında 30 dakika boyunca kılcal damardan akıtın.

30 dakika sonra, atık su nötr olana kadar kılcal damarı suyla durulayın. Nötr pH akışını doğrulamak için kağıt pH şeritleri kullanın. Daha sonra 0.2 molar sulu hidrojen klorür ile şırıngaya yükleyin ve 30 dakikalık akıştan sonra ciol gruplarını protonlamak için çözeltiyi dakikada 25 mikrolitre noktada kılcal damardan pompalayın, tekrar akış nötr olana kadar kılcal damarı suyla durulayın.

PH nötr olduğunda, kılcal damarları %100 etanol ile doldurulmuş 250 mikrolitrelik bir şırınga ile durulayın. Daha sonra, yüzeyi vinil grupları ile işlevsel hale getirmek için bir saat boyunca dakikada 25 mikrolitre noktasında etanol içinde% 20'lik bir üç trimetil propil metakrilat çözeltisi pompalayın. Daha sonra, kılcal damarları asetonla durulayın ve ardından bir nitrojen akışı ile kurulayın.

Numuneleri gece boyunca oda sıcaklığında dinlendirin ve ardından 20 santimetre uzunluğunda bölümler halinde kesin. Polimerizasyon karışımını, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi kauçuk bir septum ile bir mililitrelik bir cam şişede hazırlayın. Başlatıcı olarak monomerlere göre% 1 A IBN ekleyin ve karışımı 10 dakika boyunca sonikleştirin.

Daha sonra, işlevselleştirilmemiş bir silika kılcal damarı bir nitrojen akışına takın ve kauçuk septumdan polimerizasyon karışımına yerleştirin. Flakon kapağını hafifçe gevşetin ve nitrojeni karışımdan 10 dakika boyunca yavaşça kabarcıklandırın. 10 dakika sonra, nitrojen akışı kılcalını polimerizasyon karışımından şişenin üst boşluğuna kaldırın ve kapağı sıkıca kapatın.

İşlevselleştirilmiş kılcal damarlardan birini septumdan polimerizasyon karışımına yerleştirin. Polimerizasyon karışımını işlevselleştirilmiş kılcal damara pompalamak için nitrojen tarafından üretilen aşırı basıncı kullanın. Tamamen dolduğundan emin olmak için polimerizasyon karışımının birkaç damla kılcal damarın atık suyundan akmasına izin verin ve ardından kauçuk bir septum ile kapatın.

Kılcal damarı flakondan çok dikkatli bir şekilde çıkarın ve girişi kauçuk bir septum ile kapatın, kılcal damarda bulunan bir karışımı polimerize etmek için altı saat boyunca 60 santigrat derecede ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirin. Bittiğinde, kılcal damarı oda sıcaklığına soğutun ve ardından kılcal damarın her iki ucundan birkaç milimetre kesin. Ardından, kolonu 30 dakika boyunca dakikada dört mikrolitre Asetonitril ile yıkamak için bir HPLC pompası kullanın.

Bu, reaktif olmayan, monomerleri ve zayıf oluşturucu maddeleri ortadan kaldıracaktır. Kılcal kolonun geri basıncını kontrol edin. Daha sonra, nihai metal organik kaplamayı büyütmek için kılcal monoliti burada gösterilen reaktiflerle döngüler halinde yıkayın.

Kaplama kalınlığı, gerçekleştirilen döngü sayısı ile belirlenir. Kılcal damarları, 100 mikrolitre dört ila bir asetonid denemesi ve% 0.1 sulu trior asetik asit karışımı kullanarak hazırlanan metal organik kaplama ile yıkayın. Daha sonra dakikada iki mikrolitre hızla kolondan bir protein sindirimi pompalayın.

30 dakika boyunca, fosforile edilmemiş peptitleri, dakikada bir mikrolitrelik bir akış hızında 10 dakika boyunca dört ila bir asetil NI denemesi ve% 0.1 sulu Tri Fluor asetik asit karışımı ile tekrar yıkayın. Dakikada bir mikrolitre akış hızında 10 dakika su ile yıkayın. Fosfo peptitleri, pH yedide 250 mikromolar fosfat tampon çözeltisi kullanarak, 15 dakika boyunca dakikada bir mikrolitre hızla kılcal damardan pompalayarak elute edin, ellu'yu bir şişede toplayın ve standart bir protokol kullanarak çözeltiyi tuzdan arındırın.

Daha sonra, metanol içinde iki beş dihidroksi benzoik asitten mililitre başına iki miligram hazırlayın ve bu çözeltinin iki mikrolitresini iki mikrolitre ima edilen fosfo peptit çözeltisi ile karıştırın. Bir pipet ucunun içinde, bu karışımı doğrudan matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon plakasına yerleştirin ve lekenin tamamen kurumasını bekleyin. Matris destekli lazer ile noktaları analiz edin: Desorpsiyon iyonizasyon süresi, uçuş kütlesi spektrometresi, son olarak kolonu suyla iyice yıkayarak yeniden oluşturur, ardından birden fazla mevcut demir tabakası ile modifiye edilmiş metanol kılcal damarları gelir.

İmmobilize metal iyon afinite kromatografisinde kullanım için ideal olan üç grup, burada gösterilen, zenginleştirmeden önce ve sonra sindirilmiş proteinlerden elde edilen spektrumlardır ve 12 farklı fosfo peptit için dikkate değer seçicilik gösterir. Temsili karakterizasyon deneyleri, yeni gözeneklerin ortaya çıkması hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, bir taramalı elektron mikroskobu kullanılarak PCP döngüleri olarak bilinen 30 gözenekli koordinasyon polimer döngüsünden sonra bir toplu toz monolitinin bir görüntüsü verilmiştir.

30 PCP döngüsünden sonra, malzemedeki gözenek genişliklerinin boyutunun, dökme polimere kıyasla çap olarak üç nanometreden daha az olduğu bulundu. Hibrit, küçük gözeneklere sahip büyük miktarda artımlı alana sahiptir. Bu, Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi kullanılarak bir dizi basınç yoluyla nitrojen absorpsiyonunda bir artışa yol açar.

Karboksilik fonksiyonel grupların ilk dahil edilmesi, 10, 20 ve 30 PCP döngülerinden sonra kaplamanın büyümesinin yanı sıra görülebilirdi. Son olarak, her döngüde biriken ek metal bölgelerinin miktarını ölçmek için termo gravimetrik analiz kullanıldı. Burada, artan döngü sayısına sahip artan sayıda metal alanın varlığını doğrulayan bir sıcaklık aralığı boyunca gravimetrik analiz gösterilmektedir.

Bu protokolü takiben, farklı analitlerin belirli bir çerçeveye olan afinitelerine dayalı olarak verimli bir şekilde ayrılmasını hedeflemek için organik ligandlardaki farklı metal merkezleri için benzer bir prosedür geliştirilebilir. Makro gözenekli polimerleri metal organik çerçevelerle birleştiren bizimki gibi kompozit malzemelerin, ayırma bilimi alanında büyük umut vaat ettiğine inanıyorum, çünkü hem analitik hem de hazırlayıcı ölçekte seçiciliği, bağlama kapasitesini ve ayırmaların genel verimliliğini büyük ölçüde artırabilirler.