Name: Anti-tümör özelliklere sahip izole edilmesi ve nötrofil Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Öğrenin kanser immünolojisinde anti-tümör özellikli nötrofillerin izolasyonunu ve sitotoksisite değerlendirmesini. Bu yöntem radyoaktif etiket kullanmadan hücre canlılığını ölçer ve spesifik olmayan aktivasyonu en aza indirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ZG İsrail Bilim Vakfı (Hibe No 41/11) I-CORE Programından hibe tarafından desteklenmektedir, Abisch-Frenkel Vakfı, Rosetrees Güven, İsrail Kanser Araştırma Vakfı (ICRF - Araştırma Kariyer Geliştirme Ödülü) ve FİRMASI vakıf. ZGF İsrail Kanser Araştırma Vakfı (ICRF - Araştırma Kariyer Geliştirme Ödülü) hibe tarafından desteklenen, Sağlık Bakanlığı ve İsrail İsrail Akciğer Derneği Baş Bilim.

<ol><li>Tangye, S. G., Brink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helping+hand+from+neutrophils+in+T+cell-independent+antibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses.</a> Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).</li>
<li>Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+activation+and+regulation+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.</a> Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).</li>
<li>Pruijt, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+indispensable+for+hematopoietic+stem+cell+mobilization+induced+by+interleukin-8+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).</li>
<li>Tecchio, C., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+cytokines+involved+in+physiological+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Immunol+Allergy%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis.</a> Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formylpeptide+receptors+mediate+rapid+neutrophil+mobilization+to+accelerate+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing.</a> PloS one. 9, e90613(2014).</li>
<li>Granot, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+entrained+neutrophils+inhibit+seeding+in+the+premetastatic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung.</a> Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).</li>
<li>Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Multifaceted+Roles+Neutrophils+Play+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Microenviron. , (2014).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33, 657-670 (2010).</li>
<li>Yamashiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+change+of+cytokine-activated+neutrophils%3A+inflammatory+neutrophils+are+heterogeneous+and+enhance+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses.</a> J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).</li>
<li>Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+cell+surface+receptors+and+their+intracellular+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways.</a> Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).</li>
<li>Scapini, P., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+networking+of+human+neutrophils+within+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Social networking of human neutrophils within the immune system.</a> Blood. 124, 710-719 (2014).</li>
<li>Fridlender, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+comparing+tumor-associated+neutrophils+with+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+and+normal+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils.</a> PloS one. 7, e31524(2012).</li>
<li>Fridlender, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+tumor-associated+neutrophil+phenotype+by+TGF-beta%3A+%27N1%27+versus+%27N2%5BTitle%5D)+AND+%22TAN.+Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2.</a> TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).</li>
<li>Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">History of myeloid-derived suppressor cells.</a> Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD15%2B%2FCD16low+human+granulocytes+from+terminal+cancer+patients%3A+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+that+have+suppressive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function.</a> Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).</li>
<li>Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+suppression+by+neutrophils+and+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences.</a> Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).</li>
<li>Lopez-Lago, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemokines+secreted+by+tumor+cells+mount+a+lung+antimetastatic+response+during+renal+cell+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression.</a> Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).</li>
<li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).</li>
<li>Sagiv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Diversity+and+Plasticity+in+Circulating+Neutrophil+Subpopulations+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer.</a> Cell Reports. , (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Nötrofiller tüm beyaz kan hücrelerinin en bol ve enfeksiyon ve inflamasyon durumlarında ilk müdahale vardır. Gibi, onlar dış uyaranlara karşı oldukça duyarlıdır ve kolayca aktive edilir. Buna ek olarak, nötrofiller, çok kısa bir yarı-ömre ve hızlı bir dönüşüm vardır. Birlikte, bu özellikler benzersiz deneysel stratejiler gerekli şekilde nötrofil, çalışan birkaç zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Örneğin, birkaç nötrofil arıtma stratejileri kendi artıları ve eksileri ile her vardır. Nötrofiller ...

Nötrofiller başlangıçta işgal mikroorganizmalara karşı ilk savunma hattı olarak hizmet doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olarak karakterize edildi. Bugün, nötrofiller daha fazla işlevleri geniş kapsamlı olduğu bilinmektedir, yabancı antijenlere karşı 1,2 adaptif immün yanıtları montaj hematopoezisi 3, anjiyogenez 4 düzenleyen ve 5 yara iyileşme müdahil olma. Buna ek olarak, nötrofiller bunların pro- ve anti-tümör faaliyetleri 6,7 sayesinde, tümör büyümesi ve metastaz ilerlemesini etkileyebilir. Nötrofiller, bir polimorfik segmentli çekirdeği ile karakterize edilir (bu nedenle polimorfonükleer (PMN) lökositlerin olarak da adlandırılır) ve en az üç granül ayrı alt sınıfları gibi salgı vezikülleri 8 (Şekil 1A-C) ihtiva ederler. Nötrofiller, yüksek fagositik kapasitesi ve mikrobiyal ortadan kaldırılması için kritik yükseğe NADPH oksidaz aktiviteye sahip olan, ve en önemli kemokinlerin geniş salgılayanEk nötrofil ve inflamasyon 8,9 sitesine diğer bağışıklık hücrelerinin çekiş. Nötrofiller Toll benzeri reseptörler (TLR), dahil olmak üzere, yüzey reseptörleri büyük miktarda ekspresyonu ile karakterize edilir, C-tipi lektin Reseptörler (CLRs), reseptörü 3 (CD11b / CD18) ve diğer yapışma molekülleri (örneğin, L-selektin güzelleştirmek LFA-1, VLA-4 ve karsinoembriyonik antijen-ilişkili hücre adezyon molekülü 3 (CEACAM3 / CD66b)), kemokin reseptörleri (örneğin, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), kemo-çekici reseptörleri (örneğin, PAFR, LTB4 R ve C5aR) , sitokin reseptörleri (örneğin, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR) reseptörleri (örneğin, FPR1-3) peptit formil ve Fc reseptörleri (örneğin, CD16 (FcyRIII İnsan nötrofil CD11b, CD15, CD16 ve CD66b lökosit işaretlerini kullanarak tanımlanır ise), CD32 (FcyRII) ve CD64 (FcyRI) 10. farelerde, nötrofiller genellikle, CD11b + Ly6G + olarak tanımlanır. Ayrıca, genel olarak doku içinde nötrofillerin tespiti için granül proteinleri miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (KD) için leke kabul edilmektedir. Bu nötrofillerin farklı fonksiyonları aynı hücre ya da farklı hücre alt popülasyonları aracılık olup olmadığını hala belirsiz. Toplanan veriler pro-enflamatuar uyarıcı ve mikro-11,12 etkilenen plastisite yüksek derecede gösteren heterojen bir nötrofil nüfusu varlığı açısından göstermektedir. Fridlender ve ark., 13 fena halde yanlısı tümör özelliklere sahip, anti-tümör özellikleri ve N2 N1 olarak adlandırılan iki ana alt popülasyonları içine kanserinde nötrofillerin ayırdık. Kanserde, hem de kronik inflamasyon, T hücresi tepkilerini 14 bastırmak granülositik miyeloid kökenli bastırıcı hücreler (G-MDSCs) arasında oluşan ek bir alt-nüfusu vardır. G-MDSCs bir CD11b + LY6C ile karakterize edilen olgunlaşmamış miyeloid hücreler olduğu düşünülmektedirFarelerde 15 düşük Ly6G merhaba fenotip, insan 16 bir CD15 + / CD16 düşük fenotip yerken. G-MDSCs normal dolaşım nötrofil daha sitokinler ve kemokinlerin ise daha düşük düzeylerde arginaz ve miyeloperoksidaz yüksek seviyeleri ifade etmedi. Onlar daha az fagositer ve göçmen ama ROS 15,17,18 yüksek seviyelerde üretir. Mevcut yazıda anti-tümör özelliklere sahip nötrofillerin izolasyonu ve karakterizasyonu için bazı temel metodolojileri anlatacağız. Nötrofiller insan dolaşımda tüm beyaz kan hücrelerinin büyük nüfusa teşkil ederken (45-70%; 1,800 - 6,000 / ul) -; 300-500 / ul% 15, farelerde, normal şartlar altında, 10 (yerine seyrek ). inflamasyon üzerine ve bazen kronik inflamasyon 7 bir devleti temsil kanser, istikrarlı nötrofil sayısı artar. Nötrofiller multipotent ortak miyeloid öncüsü (CMP) ce gelişirmiyeloblast aşamalarını (MB) promiyelositlerin (PM), miyelositler (MC), metamyelocytes (MM) ve bant hücreleri (BC) geçen bir farklılaşma sürecinde kemik iliğinde LLS, 8. Onlar dolaşıma 8 yayınlanmadan önce 7 gün - olgun, post-mitotik nötrofil 4 kemik iliği içinde kalabilir. Inflamatuar koşullarda uzatılabilir 12 saat, - kanda nötrofil cirosu 6 ortalama yarılanma ömrü genellikle hızlıdır. Uyarılmamış nötrofil forbol ester forbol 12 onları teşhir ederek, anti-tümörijenik aktivite, kemokinler, IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 ve CXCL5 6,19 veya yapay naif nötrofillerin açığa elde edilebilir bir özellik, sınırlı -myristate 13-asetat (PMA) 6. nötrofil sayısının düşük birlikte kan nötrofillerinin kısa yarı ömrü (~ 3-5 10 5 x) naif 6 1 ml kandan elde - 8 hafta eski fare, bunu yaptıkzordur, in vitro olarak farenin nötrofil dolaşım fonksiyonunu keşfetmek için. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, diğer kaynaklar kullanılmaktadır. Örneğin, nötrofillerin büyük çoğunluğunun (tiyoglikolat suyu veya zimosan bir intraperitoneal enjeksiyondan sonra gibi), kemik iliği 20 veya steril enflamasyonun indüksiyonu, aşağıdaki periton elde edilebilir. Bu periton boşluğuna elde edilen nötrofiller herhangi bir anti-tümörijenik aktiviteye (yayınlanmamış gözlem) uygulamayın olmadığını belirtmek gerekir. . 40 milyon kan nötrofilleri de kolayca 1 mi kanından izole edilebilir - Granot ark 6 BALB / c fareleri, 20 olacak şekilde, tümör ilerlemesi 6 (Şekil 2A) ile birlikte ağırlaştırmaktadır nötrofili geliştirmek Fare 4T1 meme karsinomu hücre soyu ile aşılanır ortotopikal görülmektedir 3-4 hafta sonrası tümör aşılama. Bu nötrofiller anti-tümör aktiviteleri edindikleri ve buna göre coi olmuşturamacıyla tanımlanmış tümör tutulan nötrofiller (TEN), saf nötrofil 6 (Şekil 2B) ayırt etmek için. Yüksek yoğunluklu nötrofiller (HDN, Şekil 1A) yüksek bir anti-tümör oluşturucu birlikte, kanser bağlamında üretilen düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN, Şekil 1B) 21 değildir. Aynı zamanda, tümör taşıyan farelerin kemik iliği ve dalak yüksek yoğunluklu nötrofil, anti-tümör aktivitesi (yayınlanmamış veriler) sahiptir. Nötrofil artan miktarları ile, tümör progresyonu ile dalak, giderek büyüyen (splenomegali) haline unutulmamalıdır. TEN spontan (MMTV PyMT ve MMTV Wnt1 meme tümörleri ve K-ras tahrik akciğer tümörlerinin) her iki dahil olmak üzere, diğer kanser modellerinde oluşturulur ve AT-3 (MMTV PyMT) ve E0771 meme karsinomu (enjekte edilir unutulmamalıdır Hücreler, LLC Lewis akciğer karsinoma hücreleri ve B16-F10 melanoma hücreleri) içerir. Bu tum nötrofil seferberlik Ancak, kapsamı3 hafta sonra 1 ml kanda 10 x 10 6 nötrofilleri - ya da modeller 5 ulaşan 4T1-aşılanmış farelerde çok daha azdır.

<table><tbody><tr><td>HÜCRE HATLARI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare 4T1 meme karsinomu hücreleri</td><td>ADCC</td><td>CRL-2539</td><td>Büyüme ortamı: DMEM +% 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS</td></tr><tr><td>PLASTİK EŞYA VE EKİPMANLARI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu Doku Kültürü Plakası ve nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td>Steril</td></tr><tr><td>100 mm Doku Kültürü Plağı&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Steril</td></tr><tr><td>25 cm2 Doku Kültürü Şişesi</td><td>Nunc</td><td>156340</td><td>Steril</td></tr><tr><td>90 mm Bakteri Sınıfı Kültür Kabı&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, İsrail</td><td>20090-01-017</td><td>Steril</td></tr><tr><td>15 ml Steril Konik Santrifüj Tüpü&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, İsrail</td><td>835015-40-111</td><td>Steril</td></tr><tr><td>50 ml Steril Konik Santrifüj Tüpü&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, İsrail</td><td>835050-21-111</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm Yuvarlak Tabanlı Polistiren Tüp&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Millicell 24 Migrasyon Plakası gözenek boyutu 5&mu; m&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>PSMT010R1</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Beyaz 96-Düz Tabanlı Kuyu Plakası&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>Steril Hücreli</td></tr><tr><td>Süzgeç (40 mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>Steril</td></tr><tr><td>20G x 1.5 "İğne</td><td>BD Microlance 3&nbsp;</td><td>301300</td><td>Steril</td></tr><tr><td>23G x 1 "İğne&nbsp;</td><td>BD Microlance 4</td><td>300800</td><td>Steril</td></tr><tr><td>25G x 5/8" İğne&nbsp;</td><td>BD Microlance 5</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>30G x 8mm İğneli Steril 0.3 ml Şırınga</td><td>BD Micro-Fine Plus Demi</td><td>320829</td><td>Steril</td></tr><tr><td>9 mm Klipsler&nbsp;</td><td>BD, AutoClip&nbsp;</td><td>427631</td><td>Steril</td></tr><tr><td>EasySep Magnet&nbsp;</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS Ayırma Kolonu&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>Steril</td></tr><tr><td>MidiMACS Ayırıcı Mıknatıs</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Cam Slayt&nbsp;</td><td>Menzel-Gl&auml; ser Superfrost&nbsp; Plus Thermo J1800AMNZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital Çalkalayıcı&nbsp;</td><td>Ufuk çizgisi, ELMI</td><td>S-3.02.10L</td><td></td></tr><tr><td>Plaka Okuyucu&nbsp;</td><td>TECAN</td><td>InfiniteF200Pro</td><td></td></tr><tr><td>TOZ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA), fraksiyon V</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoksiüridin (BrdU)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td>Steril</td></tr><tr><td>CFSE (5- (ve 6-)-Karboksifloresein diasetat, süksinimidil ester)</td> <td>Moleküler Problar</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran T500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>Domuz bağırsak mukozasından heparin sodyum tuzu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid (NaN < alt > 3 < / alt >)</td> <td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Son derece toksik, dikkatli kullanın</td></tr><tr><td>Tiyoglikolat tozu&nbsp;</td><td>Difco</td><td>225650</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A</td><td>Sigma</td><td>Z4250</td><td></td></tr><tr><td>MEDYA VE TAKVİYELER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM)</td> <td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; Serum ortamını azalttım&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31985062</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI)-1640 orta</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS), ısıyla inaktive edilmiş</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Steril</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Biyolojik Endüstrileri, Beth HaEmek, İsrail</td><td>03-020-1A</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Biyolojik Endüstrileri, Beth HaEmek, İsrail</td><td>03-042-1B</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin x 1000 çözeltisi</td><td>Biyolojik Endüstriler, Beth HaEmek, İsrail</td><td>03-031-5</td><td></td></tr><tr><td>Mg2 + ve Ca 2 + içermeyen steril Fosfat tamponlu salin (PBS);</td><td>Biyolojik Endüstriler, Beth HaEmek, İsrail</td><td>02-023-1</td><td></td></tr><tr><td>Steril PBS x 10, Ca2+ ve Mg2+&nbsp;</td><td>Biyolojik Endüstriler, Beth HaEmek, İsrail</td><td>02-023-5A</td><td>Steril</td></tr><tr><td>HPLC sınıfı su&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>4218-03</td><td>Otoklav</td></tr><tr><td>ÇÖZÜMLERİ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK &ndash; Amonyum-Klorür-Potasyum</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>PBS'de A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoksiüridin (BrdU) çözeltisi (10 mg / ml)</td><td>10 mg BrdU'yu 1 ml PBS ve steril filtrede çözün.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFSE, DMSO'da 5 mM 1 ml DMSO'da</td><td></td><td></td><td>2.8 mg CFSE'yi çözün. Steril 200 ml'lik tüplerde 10 ml'lik alikotlara bölün ve karanlıkta -20oC'de saklayın.</td></tr><tr><td>Eosin Y çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>HT110-2-32</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in dengeli tuz çözeltisi</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, İsrail</td><td>02-016-1A</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Heparin, PBS'de</td><td></td><td></td> 20 mg / ml <td>100 mg Heparini 5 ml steril PBS'de çözün ve steril filtreyi 0,2 mm'lik bir filtreden geçirin.</td></tr><tr><td>Histopak-1119&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>0,2 mm filtreden steril filtre.</td></tr><tr><td>Histopak-1077&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>0,2 mm filtreden steril filtre.</td></tr><tr><td>Lusiferaz hücre kültürü lizis tamponu x5</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Kullanmadan hemen önce steril suda 1:5 oranında seyreltin.</td></tr><tr><td>Lusiferaz tahlil çözeltisi</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>Lusiferaz tahlil substrat tozu (E151A) ve lusiferaz tahlil tamponu (E152A) içerir</td></tr> <tr><td>Mayer'in Hematoksilen solüsyonu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>MHS-32</td><td></td></tr><tr><td>PBS + %0,5 BSA</td><td></td><td></td><td>500 ml PBS'de 2,5 g BSA'yı çözün ve 0,2 mm'lik bir filtreden steril süzün.</td></tr><tr><td>PBS + %1 BSA</td><td></td><td></td><td>1 g BSA'yı 100 ml PBS'de çözün ve 0,2 mm'lik bir filtreden steril filtreleyin.</td></tr><tr><td>%2,5 BSA</td><td></td><td></td> ile 5x PBS <td>12,5 g BSA'yı 250 ml steril HPLC sınıfı su ve 250 ml PBSx10 karışımı içinde çözün ve steril filtreyi 0,2 mm'lik bir filtreden geçirin.</td></tr><tr><td>% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA</td><td></td><td></td> içeren PBS <td>50 ml steril PBS'de 250 mg BSA'yı çözün ve 200 ml 0.5M EDTA pH 8.0 ekleyin, 0.2 mm'lik bir filtreden steril filtre.</td></tr><tr><td>FACS tamponu (% 0.5 BSA, 2 mM EDTA ve% 0.02 NaN içeren PBS) 3)</td><td></td><td></td> <td>250 mg BSA'yı 50 ml steril PBS&nbsp'de çözün ve 200 ml 0.5M EDTA pH 8.0 ve 500 ml 2% NaN3, 0.2 mm'lik bir filtreden steril filtre ekleyin.</td></tr><tr><td>Tuzlu su (%0.9 NaCl)</td><td></td><td></td><td>9 g NaCl'yi 1.000 ml ddw, otoklav</td></tr><tr><td>%0.2 NaCl çözeltisinde</td><td></td><td></td><td>çözün 2 g NaCl'yi 1.000 ml ddw'de çözün, otoklav</td></tr><tr><td>%1.6 NaCl çözeltisi</td><td></td><td></td><td>16 g NaCl'yi 1.000 ml ddw'de çözün, otoklav</td></tr><tr><td>%2 Sodyum azid</td><td></td><td></td><td>1 g sodyum azidi 50 ml steril ddw'de çözün, 4oC'de tutun.</td></tr><tr><td>% 3 Tiyoglikolat çözeltisi</td><td></td><td></td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3 g tiyoglikolat tozunu 100 ml ddw'de çözün. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Çözelti sarı ve otoklav olana kadar kaynatın.</td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi (% 0.4)</td> <td>Sigma</td><td>T8154</td><td>% 0.04'lük bir çözelti elde etmek için PBS'de 1:10 oranında seyreltin.</td></tr><tr><td>Tripsin çözeltisi B&nbsp;</td><td>Biyolojik Endüstriler, Beth HaEmek, İsrail</td><td>03-046-1</td><td>Steril</td></tr><tr><td>1 mg / ml Zymosan A</td><td></td><td></td><td>Bir Eppendorf tüpünde 1 ml steril PBS'de 1 mg Zymosan A'yı yeniden askıya alın. Tüpü kuvvetlice girdap yapın ve tüpü 37 oC'de 30 dakika inkübe edin. Otoklav yapmayın. Kullanmadan önce çözeltiyi taze olarak hazırlayın.</td></tr><tr><td>KİTLER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep PE seçim kiti</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18557</td><td></td></tr><tr><td>EasySep PE seçim kokteyli&nbsp;</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>EasySep manyetik nanopartiküller&nbsp;</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>18150</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G fare MicroBead Kiti</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-332</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Fare Nötrofil Zenginleştirme Kiti</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EasySep İnsan Nötrofil Zenginleştirme Kiti</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>FITC BrdU akış kiti</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>559619</tr><tr><td>MACS Nötrofil izolasyon kiti</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-658</td><td></td></tr><tr><td>Fagositoz Test Kiti&nbsp;</td><td>Cayman Kimya Şirketi&nbsp;</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>ANTİKORLAR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR bloke edici antikor&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış sıçan anti-Ly6G antikoru&nbsp;</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551459</td><td>Klon 1A8</td></tr><tr><td>PE konjuge sıçan anti-fare Ly6G antikoru&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>127608</td><td>Klon 1A8</td></tr><tr><td>FITC-konjuge sıçan anti-fare Ly6G</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551460</td><td>Klon 1A8</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 sıçan anti-fare Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>65-1276</td><td>Klon 1A8</td></tr><tr><td>violetFluor 450-konjuge sıçan anti-fare Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>75-1276</td><td>Klon 1A8</td></tr><tr><td>FITC konjuge sıçan anti-fare CD11b</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553310</td><td>Klon M1/70</td></tr><tr><td>FITC konjuge sıçan anti-fare Ly-6G ve Ly-6C (GR-1)</td> <td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553127</td><td>Klon RB6-8C5</td></tr><tr><td>PE konjuge sıçan anti-fare CD45</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553081</td><td>Klon 30-F11</td></tr><tr><td>FITC konjuge sıçan anti-fare F4 / 80&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab60343</td><td>Klon BM8</td></tr><tr><td>FITC konjuge fare anti-insan CD66b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td>Clone G10F5</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış sıçan izotip kontrol antikoru (IgG2a, k)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553927</td><td>Klon R35-95</td></tr><tr><td>YAPRAK saflaştırılmış Ermeni hamster anti-fare CD3e antikoru</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>Klon 145-2C11</td></tr></tbody></table>

anti-tümör özelliklere sahip izole edilmesi ve nötrofil karakterizasyonu

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Nötrofiller insan dolaşımda bulunan tüm beyaz kan hücreleri en çok bulunan, mikroorganizmalara karşı konak savunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Buna ek olarak, nötrofiller, tümör hücrelerinin immün gözetim merkezi bir rol oynar. Bunlar ya hidrojen peroksit ya da antikor-bağımlı hücre-aracılı sitotoksisite (ADCC) yoluyla kapsayan bir hücre teması-bağımlı mekanizma yoluyla tümör hücre ölümünü tümör hücrelerini tanıyan ve indükleme yeteneğine sahiptir. Anti-tümör aktivitesi olan nötrofiller, kanser hastalarının ve tümör taşıyan farelerin periferal kanından izole edilebilir. Bu nötrofiller önemli bir tümör sitotoksik aktivite gösteren sağlıklı bireylerden veya naif farelerin nötrofillerden ayırmak için, tümör tutulan nötrofilleri (TEN) olarak adlandırılır. Diğer beyaz kan hücreleri ile karşılaştırıldığında, nötrofiller, bir yoğunluk gradyanına tabi tutulduğunda bu mümkün a&gt;% 98 saf nötrofil popülasyonu elde etmek için olan farklı kaldırma kuvveti göstermektedir. Bununla birlikte, ek olarakNormal yüksek yoğunluklu nötrofil nüfus (HDN) için, kanser hastalarında tümör-taşıyan farelerde, hem de kronik iltihaplı koşullar altında, belirgin bir düşük yoğunluklu nötrofil popülasyonları (LDN) dolaşım görünür. LDN mononükleer fraksiyonu ile birlikte arındırmak ve pozitif ya da negatif seçim stratejileri kullanılarak, tek çekirdekli hücrelerden ayrılabilir. Yalıtılmış nötrofiller saflığı akış sitometrisi ile belirlendikten sonra, bunlar, in vitro ve in vivo fonksiyonel deneylerde kullanılabilir. Biz, nötrofil, anti-tümör aktivitesini izlemek için yeteneklerini geçirmek için ve reaktif oksijen türlerini üretmek için, yanı sıra fagositik kapasitesi ex vivo olarak izleme teknikleri tarif eder. Biz ayrıca in vivo izlenmesi için nötrofilleri etiketlemek için teknikleri açıklar, ve in vivo olarak anti-metastatik kapasitesini belirlemek için. Bütün bu teknikler elde etmek ve anti-tümör ile karakterize nötrofilleri nasıl anlamak için gereklidirişlevi.

Yeni bir çalışmada nötrofiller 6 için bir anti-metastatik fonksiyonu belirledi. Tümör taşıyan farelerin nötrofiller bir sitotoksik fenotipi edinebilir ve tümör hücrelerini 6 öldürme kapasitesine sahiptir. Bu, önemli bir anti-tümör etkisi 6 sahip naif farelerin nötrofillerin aksine bulunmaktadır. Protokol bölümünde tarif edilen tekniklerin çeşitli in vitro ve in vivo 6, anti-tümör nötrofil işlevini incelemek için kullanılmıştır. Tü...

Nötrofiller sadece istilacı mikroorganizmalara karşı konak savunmasında değil, aynı zamanda tümör hücrelerinin immün sürveyansında da önemli bir rol oynarlar. Burada, anti-tümör özelliklere sahip nötrofillerin izolasyonu ile ilgili teknikleri ve in vitro ve in vivo olarak anti-tümör nötrofil fonksiyonunu izleme yöntemlerini açıklıyoruz.

Anti-tümör özelliklere sahip izole edilmesi ve nötrofil Karakterizasyonu

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Bu prosedürün genel amacı, kanserde nötrofil fonksiyonunu incelemektir. Bu işlem, öncelikle periferik kanın elde edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda nötrofiller, bir yoğunluk gradyanı üzerinde saflaştırılır ve ardından gece boyu süren bir ko-kültüre tabi tutulur.Lusiferaz ile işaretlenmiş tümör hücreleri kullanılarak, hücrelerin lusiferaz aktivitesi nicelendirilir. Sonuç olarak, her bir ko-kültürdeki lusiferaz miktarı, her bir ko-kültürdeki nötrofillerin sitotoksisitesi ile ters korelasyon içinde olabilir. Bu tekniğin, antikor tabanlı nötrofil ayırma gibi mevcut yöntemlere ve hücre canlılığını değerlendirmeye yönelik diğer yöntemlere kıyasla temel avantajı, bu prosedürün nötrofillerin spesifik olmayan aktivasyonunu minimize etmesi ve radyoaktif işaretleyiciler kullanmadan hücre canlılığının ölçülmesine olanak tanımasıdır.Bu prosedür, laboratuvarımdaki bir lisansüstü öğrenci ve laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Simoni tarafından gösterilecektir. Tümör taşıyan bir fareden nötrofilleri izole etmek için, önce kardiyak ponksiyonla elde edilen bir mililitre kanı, %0,5 BSA içeren PBS ile altı mililitre son hacme gelecek şekilde seyrelterek başlayın. Ardından, 15 mililitrelik konik polipropilen santrifüj tüpünün tabanına üç mililitre steril filtrelenmiş 1,119 gram/ml sükroz ekleyin. Daha sonra tüpü yavaşça ve dikkatlice eğin.Steril filtrelenmiş 1,077 g/mL sakrozun üç mililitresini, 1,119 g/mL sakrozun üzerine ekleyin ve ardından altı mililitre seyreltilmiş kan ekleyin. Hücreleri, oda sıcaklığında 700 G'de 30 dakika boyunca santrifüj ederek sakroz gradyanında ayırın. Ayrıştırma işleminin sonunda, eritrositlerin çoğu tüpün dibinde toplanacaktır.Yüksek yoğunluklu nötrofiller, sükroz katmanları arasındaki arayüzde, beyaz-kırmızı halkada üç mililitre işaretinin civarında olacaktır. Düşük yoğunluklu lökositler ise 1,077 g/mL katmanı ile BSA içeren PBS arasındaki arayüzdeki beyaz halkada, altı mililitre işaretinin civarında bulunacaktır; düşük yoğunluklu hücre katmanının 5 mm üzerine kadar PBS-BSA katmanını aspire edin. Ardından, bir mililitrelik pipet ucu kullanarak, hücreleri yavaşça döndürürken düşük yoğunluklu hücreleri yavaş emişle uzaklaştırın.Hücreleri %0,5 BSA içeren 30 mililitre PBS'ye dağıtın. Ardından yüksek yoğunluklu nötrofilleri, 30 mililitre PBS artı BSA içeren ayrı bir tüpe aktarın. Aynı şekilde, her iki hücre setini santrifüjleyin ve ardından pelletleri 36 mililitre steril HPLC grade su içinde yeniden süspande edin.30 saniye sonra, hücrelerin izotonikliğini %2,5 BSA ile desteklenmiş dokuz mililitre 5 XPBS ile yeniden sağlayın ve hücreleri santrifüjle çöktürün. Hücreleri tekrar 10 mililitre P-B-S-B-S-A içinde süspande edin ve tripan mavisi dışlama yöntemiyle canlı hücre sayısını belirleyin. Ardından, başka bir santrifüjleme işleminin ardından nötrofilleri uygun nihai hücre yoğunluğundaki inkübasyon ortamında yeniden süspande edin.Kanser hastasından dolaşımdaki nötrofilleri izole etmek için; öncelikle 10 mililitre heparinli insan kanını, eritrositleri çöktürmek amacıyla oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ederek eşit hacimdeki salin içindeki %3 DExT strand T 500 ile karıştırın. Alyuvarlar çöktüğünde, lökosit açısından zengin süpernatantı 10 mililitre 1,077 gram/mililitre sükrozun üzerine yavaşça ekleyin ve hücreleri santrifüjle ayırın. Az önce gösterildiği gibi, yüksek yoğunluklu insan nötrofilleri pellette bulunurken, düşük yoğunluklu nötrofiller 1,077 gram/mililitre sükroz tabakası ile plazma arasındaki ara yüzeyde monositler ve lenfositlerle birlikte saflaşacaktır.Az önce gösterildiği gibi nötrofiller toplandıktan sonra, kontamine eritrositleri liz etmek için hücreleri 10 mililitre %0,2 sodyum klorür içerisinde 30 saniye boyunca seyreltin. Ardından, hücrelerin izotonisitesini geri kazandırmak için 10 mililitre %1,6 sodyum klorür ekleyin ve karıştırmak için tüpü bir kez ters çevirin. Hücreleri santrifüjle çöktürün ve peleti 20 mililitre HBSS ile üç kez yıkayın.Ardından hücreleri sayın ve uygun hücre yoğunluğunda %2 FBS ile desteklenmiş RPMI 1640 içerisinde yeniden süspande edin. Gliyan veya Xan ile uyarılmış nötrofilleri izole etmek için, intraperitonal enjeksiyon amacıyla 23 gauge bir inçlik iğneye sahip bir tüberkülin şırıngası kullanın.Uygun çözeltinin bir mililitresi farenin karın boşluğuna enjekte edin. Dört ila 24 saat sonra, ötanize edilmiş hayvanın peritonuna, 25 gauge beş sekizde bir inç iğne takılmış beş mililitrelik bir şırınga ile beş mililitre steril PBS enjekte edin. Peritonu nazikçe masajla ovalayın, ardından periton eksuda hücrelerini toplamak için sıvıyı şırıngaya geri çekin.Hücreleri %10 FBS ile desteklenmiş RPMI 1640 besiyerinde yıkayın. Daha sonra makrofajları uzaklaştırmak için, ml başına 10⁶ hücreyi, FBS ile desteklenmiş besiyeri içeren doku kültürü sınıfı bir kültür kabında 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. İzole edilen nötrofilleri boyamak için, 10⁵ hücreyi 50 µL'lik PBS alikotları içinde yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonlarını ince tabaka hücre hazırlama adaptöründe 150 ×g'de santrifüjleyin. Beş dakika sonra, önceden etiketlenmiş cam lamları adaptörden ayırın, hücreleri fikse edin ve boyayın.Ardından, lamları musluk suyunda 15 kez yıkayın. Lamların tekrar havada kurumasını bekleyin ve ardından nötrofillerin antitümör aktivitesini değerlendirmek için hücreleri bir ışık mikrosobu altında inceleyin. Mililitre başına 10⁴ lusiferaz işaretli tümör hücresini, %0,5 FBS ile desteklenmiş optimize edilmiş düşük serumlu besiyerinde beş kat seyreltin.Ardından, beyaz 96 kuyucuklu düz tabanlı doku kültürü plağının her bir kuyucuğuna, %0,5 FBS içeren 100 µL optimize edilmiş düşük serumlu besiyerinde 5 × 10³ tümör hücresi ekleyin. Dört saat sonra, her bir kuyucuğa gece boyu inkübasyon için %0,5 FBS içeren 50 µL optimize edilmiş düşük serumlu besiyerinde 1 × 10⁵ nötrofil ekleyin. Ertesi sabah, süpernatanı nazikçe aspire edin ve her bir kuyucuğu 200 µL PBS ile yıkayın.Ardından PBS'yi aspire edin ve her kuyucuğa 50 µL pasif lizis tamponu ekleyin. Daha sonra plakayı folyo ile kapatarak oda sıcaklığında, 150 RPM hızında orbital sarsıcıda inkübe edin. 20 dakika sonra plakayı lüminesans plaka okuyucusuna yerleştirin.Her bir kuyucuğa 50 µL lusiferaz assay solüsyonu enjekte edin ve her kuyucuk için 10 saniye boyunca kemilüminesansı okuyun. Son olarak, bu temsili deneyde nötrofil sitotoksisitesinin derecesini test etmek için tümör lizis yüzdesini hesaplamak üzere 1 × 10⁵ formülünü kullanın. Nötrofiller, tümörsüz farelerden saflaştırılan nötrofillerle yapılan ko-kültürlerde olduğu gibi, lusiferaz eksprese eden 4T1 hedef hücreleri ile ko-kültürlenmiştir.Tümör hücrelerinde çok az öldürme gözlemlendi. Bununla birlikte, düşük ve yüksek yoğunluklu nötrofillerin immünsupresif özelliklerini test etmek amacıyla, tümör taşıyan farelerden saflaştırılan nötrofiller anlamlı düzeyde sitotoksisite sergiledi. Anti CD three veya anti CD three artı düşük veya yüksek yoğunluklu nötrofillerle stimülasyon sonrası CD eight pozitif splenik T hücrelerinin sayısı, anti CD three aktivasyonunun ardından değerlendirildi.CD eight pozitif hücrelerde belirgin bir artış gözlemlendi. Bununla birlikte, düşük yoğunluklu nötrofillerle yapılan ko-kültür, CD eight pozitif hücrelerde fark edilir bir azalmaya neden oldu; bu etki yüksek yoğunluklu nötrofillerin varlığında gözlemlenmedi. Proliferasyonun bir göstergesi olarak CFSE tutulum oranı da değerlendirildi.Anti-CD3 ile işlem görmüş hücrelerde ve yüksek yoğunlukta nötrofil varlığında kültüre edilmiş anti-CD3 işlem görmüş hücrelerde, her iki durumda da CD8 pozitif hücrelerin proliferasyonunda artış gösteren sola doğru kelime kaymasına dikkat edin. Bu prosedürün ardından; farklı patolojik senaryolar altında nötrofil fonksiyonunun nasıl etkilendiği gibi ek soruları yanıtlamak için oksidatif burst, fagositoz veya migrasyon ölçümü gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

isolation-characterization-neutrophils-with-anti-tumor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu yazıda, tümör infiltre lökositlerin oldukça saflaştırılmış nüfusu izole edilmesi için bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, karmaşık tümör doku hücreleri izole edilmesi için, verim ve saflıkta geliştirmek için Miltenyi Biotech protokolü uyarlanmıştır.

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Bu videoda, süreksiz sükroz gradyan santrifüjleme ile tümör taşıyan bir farenin kanından sitotoksik yüksek yoğunluklu nötrofillerin ve düşük yoğunluklu nötrofillerin izolasyonunu gösteriyoruz.

Tümörlü Fare Kanından Sitotoksik Nötrofillerin İzolasyonu

Bu videoda, anti-anjiyojenik tümörle ilişkili nötrofiller (TAN'lar) oluşturmak için bir test gösterilmektedir. Pro-anjiyojenik TAN'lar içeren bir murin melanom tümörü alındıktan sonra, tek hücreler floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) kullanılarak izole edilir ve anjiyogenezi uyarma kapasitesini azaltmak için bir nikotinamid fosforibosil transferaz (NAMPT) inhibitörü ile tedavi edilir.

Anti-anjiyojenik tümörle ilişkili nötrofillerin üretilmesi

Nötrofiller en bol bulunan beyaz kan hücresi türüdür. Nötrofillerin insan kanından yoğunluk gradyan ayırma yöntemi ile izolasyonu ve insan promiyelositik (HL60) hücrelerinin granülositik yol boyunca farklılaşması burada açıklanmaktadır; lenfoma hücrelerinin anti-lenfoma ajanlarına duyarlılığı üzerindeki rolünü test etmek.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Yeni iletişim kuralları burada yalıtmak ve insan türetilmiş microparticles karakterize açıklanmıştır ve fare nötrofiller. Bu protokoller ultrasantrifüj, Akış Sitometresi ve microparticle içeriği analiz etmek için immunoblotting teknikleri kullanmak ve çeşitli hücre tiplerinin hücresel işlevde türetilen microparticles rolü çalışma için kullanılabilir.

Yalıtım ve nötrofil kaynaklı Microparticles karakterizasyonu için fonksiyonel çalışmalar

Burada ayırmak ve kurulan subkutan tümörler tümör bağışıklık ve non-immün microenvironment bileşenlerinin zenginleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik tümör bağışıklık sızmak ve tümör bağışıklık microenvironment kapsamlı karakterizasyonu izin verebilir non-immün tümör kesirler ayrı analiz için sağlar.

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

Burada, postoperatif peritoneal lavaj sıvı, kurtarılan insan düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), büyük nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) üretmek ve verimli bir şekilde daha sonra grow ücretsiz tümör hücreleri tuzak bir yöntem mevcut.

Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

Burada, tümör taşıyan farelere transferinden sonra anti-anjiyojenik tümör ilişkili nötrofiller terapötik potansiyelini gösteriyoruz. Bu protokol, nötrofil aktivitesini ex vivo olarak işlemek ve daha sonra tümörlerin geliştirilmesinde in vivo olarak işlevselliğini değerlendirmek için kullanılabilir. Potansiyel nötrofil bazlı immünoterapileri incelemek için uygun bir modeldir.

Anjiogenik potansiyelinin In vivo çalışması için Işlenmiş tümör ilişkili Nötroflelerin tümör taşıyan fareler içine aktarılması

Bu protokol, nötrofillerin tam kan, buffy coats veya lökferez zarlarından izole edilmesinin, iyi verim, yüksek saflık ve minimum hücre aktivasyonu elde edilmesinin bir yöntemini detaylandırmaz. Yüksek kaliteli/saflıkta nötrofil preparatı elde etmek için gradyan saflaştırma, kırmızı kan hücresi (RBC) sedimilasyonu ve RBC lizizini kullanıyoruz.

İnsan Nötrofillerinin Tam Kan ve Buffy Coats'tan İzolasyonu

Bu tanımlanmış protokol, insan nötrofil hücre dışı tuzak (NET) salınımını in vitro olarak görselleştirmek ve ölçmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir mikroskopi yaklaşımını tanımlar. Tekrarlanabilir yöntem, farklı NETosis indükleyicileri ile stimülasyon üzerine NET salınımının özelliklerinin ve kinetiğinin araştırılmasına olanak tanır ve NETosis antagonistlerinin farmakolojisinin değerlendirilmesini sağlar.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Salınımının Gerçek Zamanlı, Yüksek Verimli Mikroskobik Miktar Tayini ve Antagonistlerin Farmakolojisinin Değerlendirilmesi

Burada, manyetik izolasyon (negatif seçim) ve süreksiz yoğunluk gradyan ortamı kullanarak düşük ve normal yoğunluklu nötrofillerin tam kandan izole edilmesi için güvenilir bir yaklaşım sunuyoruz. Yüksek saflıkta hücrelerin (%≥93) el değmeden izolasyonunu sağlayarak, sağlık ve hastalıktaki rollerini anlamak için çok önemli olan nötrofil alt popülasyonlarının doğru aşağı akış analizini kolaylaştırır.

Tam Kandan Düşük ve Normal Yoğunluklu Nötrofillerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Öğrenin kanser immünolojisinde anti-tümör özellikli nötrofillerin izolasyonunu ve sitotoksisite değerlendirmesini. Bu yöntem radyoaktif etiket kullanmadan hücre canlılığını ölçer ve spesifik olmayan aktivasyonu en aza indirir.

Anti-tümör özelliklere sahip izole edilmesi ve nötrofil Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet