Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, zebrafish embriyogenezi sırasında belirli mekansal ve zamansal noktalarda yerel doku ortamında değişiklikler meydana getirmek için mikroboncuk implantasyonu kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle mikroboncukların hassas bir şekilde taşınmasını ve implantasyonunu kolaylaştırmak için bir boncuk implantasyon tepsisi hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, zebrafish yumurtaları gelişimin istenen evresine kadar inkübe edilir.

Mikro boncuklar daha sonra uygun deneysel çözeltiler içinde hazırlanır ve embriyo içindeki istenen konuma dikkatlice aktarılır. Nihayetinde, mikro boncuk implantasyonu, normal zebra balığı gelişimini bozmadan gerçekleştirilebilir ve böylece ilgi duyulan moleküllerin zebra balığı embriyogenezi üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine olanak tanır. Bu yöntem, gelişimsel biyoloji alanındaki, farklı moleküllerin organogenez sürecini nasıl etkilediği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan bireyler, mikroboncukların kullanımında uzmanlaşmak pratik gerektirdiğinden zorluk yaşayabilirler. Mikroboncuk implantasyon tepsisini hazırlamak için öncelikle yeni hazırlanmış %2 aro çözeltisini 90 saniye boyunca ısıtın. Bunu, jelin köpürerek taşmasını önlemek için her 30 saniyede bir çalkaladığınız 250 mililitrelik bir erlenmeyer flask içerisinde gerçekleştirin.

Ardından, 60 by 15 milimetrelik bir Petri kabının kapağını, kapağın iç kısmı yukarı bakacak şekilde 150 by 15 milimetrelik bir kabın içine yerleştirin. Daha sonra, küçük Petri kabının kapağını bir işaret parmağıyla sabitleyerek sıcak agar jelini büyük kaba dökün.

Yoğuşma oluşumunu önlemek ve agros soğurken boncukların mikroskop altında daha kolay görülmesini sağlamak için küçük kapağın altında ince bir agros tabakasının oluşmasına izin verin. Ancak jel katılaşmadan önce, embriyoların daha kolay yerleştirilmesini sağlamak için jelin üst kısmına bir kuyucuk kalıbını yavaşça açılı şekilde yerleştirin. Jel katılaştığında, kuyucuk kalıbını dikkatlice çıkarmak için bir mikro spatula kullanın.

Ardından kaba E3 solüsyonu ekleyin ve 4 °C'de saklayın. Zebrafish embriyolarını toplamak için bir çiftleşme kabını sistem suyuyla doldurun. Daha sonra kabın ortasına bir ayırıcı yerleştirin ve yetişkin erkek ve dişi zebrafishleri kabın uygun tarafına ekleyin.

Ertesi sabah, döllenmiş yumurtaları toplamak için ince telli bir süzgeç kullanın. Süzgeci temiz bir 10 santimetrelik Petri kabının içine ters çevirin ve süzgeçte hiç yumurta kalmayana ve kapta yaklaşık 25 mililitre E three çözeltisi oluşana kadar süzgeci ince bir E three akımıyla durulayın. Ardından, aşırı kalabalıklaşmayı önlemek için yumurtaları kap başına 50 ila 60 yumurta düşecek şekilde birkaç kaba paylaştırın ve mikroboncukları implante etmeden önce yumurtaları 28,5 derece Celsius sıcaklıktaki E three çözeltisinde inkübe edin; ardından ilgili süre boyunca uygun hacimdeki test molekülü veya kontrol taşıyıcı içerisinde inkübe edin.

Ardından, embriyolar istenen gelişim zaman noktasına ulaştığında, koryonlarını çıkarmak için ince pensler kullanın ve zebra balıklarını filtrelenmiş ringer çözeltisi içinde inkübe edin. Embriyolar aklimatize olurken 10 dakika boyunca antibiyotiklerle takviye edin. Mikro boncukları, implantasyon tepsisinin içine yerleştirilmiş önceden hazırlanmış mikro boncuk plakasına aktarın ve boncukları ringer çözeltisi ile 10 dakika boyunca durulayın.

Boncuklar yıkandıktan sonraki 50 dakika içinde, mikroboncuk implantasyon alanının erişilebilir olmasını sağlayacak şekilde, implantasyon tepsisinin kuyucuğu içerisinde her seferinde bir embriyoyu dizin. Tungsten bir iğne kullanarak embriyo üzerinde küçük bir insizyon yapın, ardından mikroboncuğu kapiler sütuna nazikçe çekmek için bir mikro kapiler transfer pipetinin balonuna bastırın ve mikroboncuğun daha kolay taşınabilmesi için basıncı serbest bırakarak boncuğu implantasyon tepsisine aktarın. Boncuğu, kalıp içindeki ringer solüsyonunun içine batacak şekilde nazikçe itin.

Ardından mikroiğne kullanarak, mikro boncuğu embriyonun üzerine ve insizyonun içine taşıyın. Son olarak, boncuğun iyileşme sırasında dışarı atılmaması için bıyık aracını kullanarak mikro boncuğu insizyon bölgesinden uzaklaştırın. Mikro boncuk implantasyonunun başarısı, boncuğun doku içinde stabil bir şekilde konumlanması sayesinde stereo mikroskop altında hemen değerlendirilebilir.

Bu deneyde, yalnızca ringer solüsyonu ile durulanan iki farklı boyuttaki tekli mikroboncuklar, zebrafish embriyolarına kuyruk tomurcuğu aşamasında veya miyogenezin ilerleyen zaman noktalarında implante edilmiştir; bu işlem, boncuk konumunun endojen doku morfogenezi nedeniyle deney süresince kaymadığından emin olmak için yapılmıştır. Embriyo örnekleri, görüntülerin mikroboncuk implantasyonunu gösterdiği gibi, yaşam seyri fotoğrafçılığı ile görselleştirilebilir veya periyodik aralıklarla kontrol edilebilir. Herhangi bir konjugasyonun yokluğunda, küçük moleküller, SPR balık embriyosundaki normal gelişim sırasında belirgin morfolojik etkiler oluşturmadan elde edilebilir.

Bu prosedürü takiben, Microbead'in gen ekspresyonunu nasıl etkilediğini incelemek için Whole Mount In situ hybridization gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Genel olarak, boncuğun zaman içindeki konumunun anlaşılması; küçük bir molekülün hedef bir doku veya gelişimsel süreç üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi gibi sonuçların yorumlanmasında kritik öneme sahiptir.