Basit ve Bilgisayar destekli Fareler için Koku Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farelerde doğuştan gelen koku ayırt etme, koku tercihi veya kaçınması ve koku duyarlılığını test etmektir. Bu işlem, farenin yeni bir çekici veya itici kokuya ve nötr bir koku olan suya maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. Bu sırada, davranışsal oturum bir video kamera tarafından kaydedilir.

Ardından, koku ve su parametrelerinde geçirilen süreyi elde etmek için video, sağlanan makrolar kullanılarak Image J'de analiz edilir. Sonuçlar, post hoc bilgisayar destekli analize dayanarak farklı genotipler arasında kokulara karşı suya kıyasla tercih veya kaçınma davranışını gösterir. Olfaktorik testin özel arena ve olfaktorik kullanımı üzerindeki temel avantajı, tanıdık bir arena kullanması ve bu nedenle hızlı tamamlanması ve kurulumunun basit olmasıdır.

Ayrıca, prosedürü demonstre etmek için laboratuvarımdaki doktora öğrencisi Emmanuel Abry tarafından uygun maliyetli donanımlar kullanılacaktır. Bu deney için üç ile beş ay arasında değişen yaşlarda, erkek, C 57 black, altı yabanıl tip ve transgenik fareler kullanın. Bu demonstrasyonda iki nakavt hattı ve kardeş kontrol grubu kullanılmıştır.

Deneysel arenalar için, üç santimetre altlık içeren temiz sterilize edilmiş fare kafesleri kullanın. Ardından, kamera düzeneğini hazırlayın. Kamerayı, özel bir tripod bağlantısı üzerinde kafes tabanının 58 santimetre üzerine konumlandırın.

Kafesin konumunun neresi olması gerektiğini belirtmek için tezgaha bazı işaretler koyun. Merkez görüntü için kamerayı saniyede yaklaşık 15 kare hızında, 320 x 240 piksel çözünürlüğünde video kaydedecek şekilde ayarlayın. Testi hazırlamak için, mümkün olduğunca her kokunun konsantrelerini çözücü içinde saklayın.

Tercih testi için, fıstık yağında ağırlıkça hacme %10'luk fıstık ezmesi çözeltisi hazırlayın. Kaçınma testi için %98'lik metil bütirik asit çözeltisi hazırlayın. Hassasiyet testi için, testten bir ila iki gün önce aynı soydan bir fareden dişi idrarı toplayın.

Dişi bir hayvanı karnı kafes ızgarasının üzerinde olacak şekilde sabitleyin ve idrar damlalarını plastik bir kaba toplayın. Normalizasyon sağlamak için birkaç farklı dişiden örnekler toplayın. Bireysel değişkenlik için, tüm örnekleri 1,5 milliliter'lik bir tüpte birleştirin ve -20 °C'de saklayın.

Alıştırma işlemine başlamak için hayvanlardan birini temizlenmiş bir kafese yerleştirin ve keşfetmesine izin verin. Beş dakika boyunca test kafesinin ortamı, ev kafesinin ortamı ile aynı olmalıdır. Alıştırma aşamasını her test gününde bir kez tekrarlayın; alıştırma süresi tamamlandığında kaydı başlatın ve 60 µL hoş bir koku pipetleyin.

Bu durumda, karşıt duvarlardan birine fıstık ezmesi, diğerine ise aynı miktarda su pipetleyin. Nötr bir koku olarak, damlaları her duvarın yaklaşık 10 santimetre yukarısına uygulayın. Şimdi hayvanın iki dakika boyunca keşif yapmasına izin verin, ardından kaydı durdurun ve fareyi ev kafesine geri götürün.

Süreci test edilecek her bir fare için tekrarlayın. Her seferinde yeni test kafesleri kullanın. Tüm tercih testlerini gerçekleştirdikten üç ila beş gün sonra, yeni bir test kafesi kullanarak kaçınma testini yürütün.

Her bir fare için kaçınma testini gerçekleştirin. Çekim testinde olduğu gibi, sadece hoş kokuyu, iki metil bütirik asit olan kaçınma kokusuyla değiştirin. Hassasiyet testi için, aynı fareye ait denemeler arasında tek bir kafes yeniden kullanılabilir.

Kafesin su tarafını işaretleyin ve denemeler arasında kısa duvarları %70 etanolle ıslatılmış kağıtla temizlemeye hazır olun. Deney gününde, on katlı seyreltme serisi ile idrarın dört farklı konsantrasyonunu hazırlayın. Kaçınma testinde olduğu gibi çift distile su kullanarak, her hayvanı test kafesine beş dakika boyunca alıştırın.

Ardından, her bir fareyi önce en yüksek dilüsyon olan 1:10.000 oranındaki idrara maruz bırakın. Kayıt sırasında, idrar dilüsyonunu test kafesine, suyu ise karşı duvara uygulayın. Diğer testlerde yapıldığı gibi, hayvanın keşfetmesine izin verin.

İki dakika boyunca bekletin. Ardından hayvanı temiz bir fare kafesine aktarın. Tüm hayvanlar en düşük konsantrasyona maruz kaldıktan sonra, tüm test kafesi duvarlarını temizleyin ve her fare üzerinde bir sonraki en konsantre idrarı kullanarak testi tekrarlayın.

Saf idrar test edilene kadar bu işleme devam edin. Bir deney için tüm veriler toplandıktan sonra, ayarlanmış videoları Image J'de açın; düzenleme ve işleme detayları, açıklanan protokoller kullanılarak metin protokolünde sunulmuştur. İki farklı nakavt hattı.

B ve C grupları, yatak malzemesinden yapılmış kontrol grubu A ile karşılaştırılmıştır. Genotipler içinde koku ve su arasında geçirilen süreyi karşılaştırmak için eşit veya eşit olmayan varyanslı, yönlendirilmemiş bir Student T-testi uygulanmıştır. Genotipler arasındaki davranışlar tek yönlü ANOVA kullanılarak karşılaştırılmıştır. Hem B hem de C deneysel grupları, çekici kokuya karşı herhangi bir tercih göstermemiştir. Kaçınma testinde, itici 2-metil bütirik asit kokusuna verilen yanıt A ve B grupları için beklendiği gibiyken, C grubu bu kokuya karşı herhangi bir kaçınma davranışı göstermemiştir.

Hassasiyet testinde, çekim eşiği, 1'e 1000 seyreltmede tercih edilen idrar ile suyun birlikte geçirilen süreleri arasındaki fark çıkarılarak elde edilmiştir. B ve c deney gruplarının her ikisinin ise tercih göstermesi için 100 kat daha yüksek bir konsantrasyona ihtiyaç duyduğu görülmüştür. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem düzgün bir şekilde yürütülürse birkaç saat içinde tamamlanabilir; ardından bu prosedürü takiben, koku plastisitesini ve öğrenmeyi araştırmak için kokuyla öğrenme ve sönme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.