Name: Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Keşfedin, 3D kollajen matris içinde kemotaksisi araştırmak için düzlemsel gradyan difüzyon sistemi nasıl oluşturulur. Bu yöntem, hücre göçü mekanizmalarını anlamak için konfokal mikroskopi kullanarak güçlü bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Dr. Jonathan Reichner ve Dr. Angle Byrd'a hücre deneyi içgörüleri için teşekkür etmek istiyor. Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı (GRFP) bu çalışmayı destekledi.

1. 3D Kalıp Tasarımı ve Parçaları <ol><li> Kalıp <ol><li> Çalışmaya başlamadan önce, bir silikon elastomer kiti, bir canlı hücre görüntüleme odası, 22 mm cam lamel ve boyutları 10.07 mm x 3.95 mm x 5.99 mm ile işlenmiş alüminyum metal küp edinin. Alt tutucu lamel yerleştirerek ve satıcı tarafından yönlendirildiği gibi odasının kalanını montaj döküm için canlı hücre görüntüleme odası hazırlayın. </li><li> Sonra, forseps kullanarak, canlı hücre görüntüleme odası konut ortasında ve lamel üstüne işlenmiş alüminyum metal küp yerleştirin ve sonra bir kenara koyun. </li><li> Elastomer 5 ml yapmak için, üreticinin protokolüne uygun olarak, silikon elastomer çözüm karıştırın. </li><li> Tek kullanımlık laboratuar spatula kullanarak, canlı hücre görüntüleme odası kurulum içine silikon elastomer çözüm dökün ve yerleştirilen işlenmiş alüminyum metal küp taşımak için değil emin olun. Kür için güvenli bir yer O / N, laboratuar bankta sistemi yerleştirin. </li><li> Ertesi sabah, deconstructCanlı hücre görüntüleme odası, üretici tarafından önerilen ve forseps kullanarak kalıp çekin. Forseps kullanarak, dikkatli bir kalıptan işlenmiş alüminyum metal küp ayıklayın. Lavaboya gidin ve deiyonize su ile kalıp durulayın. Kurutmak için kağıt havlu üzerine kalıp yerleştirin. </li><li> Kuruduktan sonra, bir hobi maket bıçağı kullanılarak, kalıp yarıklar kesme silikon kalıbın içinde, her bir uzunlamasına ucundan 2.34 mm aralıklı. Eğer bir deney için sistem inşa hazır olana kadar güvenli ve kuru bir yerde kalıp kalır emin olun. </li></ol></li><li> Hidrofilik ve hidrofobik Cam Lameller Hazırlık <ol><li> Kolajen matrisi, bir yüzeye yapışır hidrofil lamelleri oluşturmak için izin vermek için: <ol><li> Tek kullanımlık bir pipet kullanarak, 3-aminopropil-trimetoksisilan, 150 ul ölçmek ve 50 ml&#39;lik bir tüp içinde çözelti dökün. İkinci bir pipet ile 50 ml tüp% 100 etanol içinde 30 ml ilave edilir ve kapağı kapatın. Tüm karıştırma sağlanması, 2 dakika için çözelti vorteksleyin. PBizim cam Petri kabındaki solüsyonu ve bir kenara koyun. </li><li> İkinci Petri kabındaki% 100 etil alkol 15 ml dökün ve kenara (yemekleri etiket emin olun). </li><li> Yeni bir atılabilir pipet kullanılarak, deiyonize su içinde 30 ml ölçmek ve 50 ml&#39;lik bir tüp içine dökün. Sonra, glutaraldehit 1.875 ul yeni atılabilir pipet ölçü dışarı kullanarak ve aynı 50 ml tüp içine çözüm dökün ve kapağını kapatın. Tüm karıştırma sağlanması, 2 dakika için çözelti vorteksleyin. Üçüncü Petri kabı içine karışımı dökün ve bir kenara koyun. </li><li> Forseps kullanarak, tek 22 mm yuvarlak cam lamel çıkar ve tek kullanımlık pipet kullanarak% 100 etanol karışımı ile her iki tarafı durulayın. </li><li> % 100 etanol çözeltisi çanağı 30 ml 3-aminopropil-trimetoksisilan içine durulanmış cam lamel yerleştirin ve 5 dakika boyunca çözelti içinde bekletin. </li><li> Forseps ile cam lamel çıkarın ve tek kullanımlık pipet ile% 100 etanol çözeltisi ile tekrar yıkayın. </li><li> 1875 içine durulanır cam lamel BırakGlutaraldehid ul 30 deiyonize su karışımı içinde çözdürülür ve 30 dakika için bir kenara. </li><li> 30 dakika sonra, forseps ile cam lamel çıkarın ve iyonu giderilmiş su ile durulayın ve oda sıcaklığında kurumaya kuru ince dokulu O / N üzerine yerleştirin. </li><li> Tekrarlayın lamel daldırma ve aynı oluşturulan çözümleri ile gerektiği kadar lamelleri için hareket. </li></ol></li><li> Verilen protokol hidrofobik lamelleri sağlayın. <ol><li> Tridekaflor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl 500 ul asetik asit, 100 ul, 2 dakika boyunca 50 ml&#39;lik bir tüp ve girdap içinde, heksan içinde 19.4 ml ekleyin. Cam Petri kabındaki solüsyonu dökün ve bir kenara koyun. </li><li> Temiz forseps kullanarak, tek cam lamel almak ve 2 dakika için hazırlanan karma çözüm içine bırakın. 2 dakika geçtikten sonra, forseps ile cam lamel çıkarın ve oda sıcaklığında kurumaya kuru doku O / N üzerine atılan bir pipet ve yer lamel kullanılarak deiyonize su ile durulayın. Kullanılıncaya kadar plastik Petri kapları saklayın lamel. </li><li> Tekrarlama lamel DIPPing ve aynı oluşturulan çözümleri ile gerektiği kadar lamelleri için hareket. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Kalıp Montaj <ol><li> Tek kullanımlık pipet bir kimyasal atık konteyner üzerinde% 90 etil alkol ile kalıp durulayın kullanarak kalıplar kullanmadan önce. Daha sonra, iyondan arındırılmış su ile dolu bir Petri kabındaki kalıp yerleştirmek ve O / N bekletin. </li><li> Kalıp aksamını başlamadan önce kuru hava bir havlu üzerine forseps ve yer kullanarak çözümün dışında kalıp atın. </li><li> Kalıp hava kurutma iken, yüksek hassasiyetli elmas lıklar aracını kullanarak x 5.99 mm 3.95 mm&#39;den biraz daha büyük iki dikdörtgen içine kare hidrofil lamelleri kesti. Silikon kalıp halinde kesilmiş yuvalarına her kesim dikdörtgen lamel kaydırın. </li><li> Baş aşağı çevirin ve kalıp tek kullanımlık pipet kullanarak silikon kalıp alt kısmındaki vakum gres sürün. Sonra, arka sağ taraftaki yukarı kalıp çevirmek ve dairesel hidrofil cam kapaklar üzerine kalıbın alt basınBir mühür oluşturmak için dudak. </li><li> Tek kullanımlık eldiven ile monte kalıp pick up ve tek kullanımlık Petri kabı içine ve daha sonra bir biyo-kaputun içine yerleştirin. Deneme oluşmadan önce kalıp sterilize etmek için 1 saat UV Bio-luk lamba açın. </li></ol> 3. Kolajen Karışımı ve 3D Matrix <ol><li> Kollajen karışımı, leke hazırlama ve standart protokoller 28 göre görüntülenmesi için hücreleri hazırlamak önce. </li><li> Bir biyo-başlığı içinde, standart laboratuvar teknikleri ve protokolleri 29,30 kullanarak, istenen kimyasal çekici madde konsantrasyonu 15 ml&#39;lik bir tüp içinde, hücre ortamı ve kemoatraktan karıştırın. Pipet 5, bir 15 ml tüp içine spesifik hücre ortam kemoatraktan konsantrasyonu solüsyonu ve ısıtılmış bir su banyosu içine solüsyon hareket ettirin. </li><li> Bir pipet kullanarak, mikroskopi deneyleri için çözeltiyi ısıtmak için bir ısıtılmış su banyosu içinde, ikinci bir 15 ml tüp ve yerine, sadece hücre medya 5 ml ekstrakte edin. </li><li> 10x fosfat tampon, bir biyo-kaput, pipet 30 ulmikro santrifüj tüpüne ed çözeltisi (PBS). 15 saniye için aynı mikro santrifüj tüpü ve girdap içine 1 N sodyum hidroksit (NaOH), 6 ul ekleyin. </li><li> Buzdolabından kollajen I sıçan kuyruğu çözümü edinin ve standart laboratuar teknikleri ve protokolleri 29 kullanılarak biyo-kaput taşıyın. Kollajen hala soğuk olduğundan emin olun. Aynı mikro santrifüj tüpüne kollajen 168.3 ul pipetle. </li><li> Daha sonra, aynı mikro santrifüj tüpüne bir pipet kullanılarak, sarı-yeşil floresan karboksilat ile modifiye edilmiş mikro-18 ul ekle. Vortex 30 sn tüm çözümleri ile mikro santrifüj tüpü. </li><li> Mikro santrifüj tüpüne istenilen hücre medya-hücre karışımı (yaklaşık 2 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonu) 77.7 ul ekleyin ve 20 saniye süreyle pipet kullanarak karıştırın. Gerektiğinde, flüoresan boncuklar ve hücre canlılığı tablo (Tablo 1) ilave için uyarlanmış özel kolajen karışım, aşağıdaki matris yoğunluğunu değiştirmek. </li><li> Pipet 300 &amp; #181; de merkezi haline kollajen hücre karışımı l hazırlanan kalıp düzeneğinin (iyi # 2). Tek kullanımlık bir Petri kabı üzerine kalıp yerleştirilir ve% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 20 dakika boyunca standart bir inkübatör içine hareket eder. </li><li> Inkübatör sistemi çıkarın ve biyo-kaputun içine geri koyun. Forseps kullanarak, her lamel tepesine sıkma ve uzak kalıp yukarı çekerek ve hem hidrofobik kapak fişleri çıkarın. </li><li> Kollajen kalıp taraf düzlemsel difüzyon degrade sağlamak için düz hala emin olmak için istenen mikroskopi ve görüntü için tüm sistemin taşıyın. </li><li> 100 ul tek kanallı pipet kullanarak mikroskop altında hala sistemi ile, iyi 1. içine hücre medya 100 ul ekleyin. Sonra, 100 ul tek kanallı pipet kullanarak iyi 3. içine istenilen kemoatraktan konsantrasyonuna sahip hücre medya 100 ul ekleyin. </li><li> Hemen her iki kuyulara çözümler ekledikten sonra, görüntüleme başlar. </li></ol> 4. Görüntüleme ve DifüzyonModelleme <ol><li> Belirli bir konsantrasyon hesaplamak için belirli kollajen yoğunluğu için difüzyon katsayısı bulmak istiyorsa, aşağıdaki protokolü uygulayın: <ol><li> Yerine istenen kemoatraktan konsantrasyonuna sahip hücre ortamını oluşturma &quot;, Kolajen Karışımı ve 3D Matrix&quot; Yukarıdaki başlıktaki verilen protokol takip standart hesaplamalar ve protokolleri 30 ile 15 ml tüp içinde 5 mcM rodamin olun. </li><li> Görüntü konfokal sistemi ile 3D kollajen matrisleri floresan yakalamak için argon lazer (488 nm) kullanılarak ters mikroskop üzerine monte edilmiş. Resim kadar 7 saat boyunca her 2 ya da 3 sn. </li></ol></li><li> Difüzyon Modelleme için: Aşağıda gösterilen matematiksel model kullanarak, bu genel adımlarla işleme ve analiz için bir hesaplama yazılım kodu yazmak. <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol><li> Maksimum niyet etme yoluyla yeniden ölçekleme ve normalleştirme için hesaplamalı yazılımı içine İthalat görüntüversitesi. Kenar seçmek için görüntünün gri renk haritasına görüntüleri dönüştürün. Merkezin sağında ve merkezin solunda, görüntünün ortasında boyunca ekseni seçin. </li><li> Hesaplamalı yazılım kodu kullanarak, gerçek yoğunluk ve ikisi arasındaki fark ile birlikte normalize yoğunluğunu arsa. </li><li> Fitingin (yoğunluk, süre ve uzunluğu) için gerekli Sonra, parametreleri. </li><li> Zamana karşı normalize konsantrasyon ve verilere polinom geçme ile x-ekseni boyunca konsantrasyon profili çizilir. </li><li> Hesaplamalı yazılım kodu kullanarak difüzyon katsayısı hesaplayın. </li></ol></li></ol> 5. Deneysel Ölçümler <ol><li> Lütfen difüzyon denklemi referansla, aşağıda gösterildiği gibi, sistem içinde herhangi bir noktada belirli bir konsantrasyonunu bulmak için denklemi yeniden. <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> Nerede: Th L = UzunlukE kolajen matrisi soruşturma kapsamında, x = yeri Difüzyon D = katsayısı t = geçen süre </li><li> Kemotaksis deneyleri sırasında, moment kemokin sisteme eklendiğini belirli bir zaman kaydetmek için emin olun. Hücre göçü hareketi bulunduğunda, konfokal time-lapse kayıt kayıt ve görüntüleme meydana kenarından belirli bir zaman ve konumunu not sağlamak. </li><li> Veri analizi sırasında, difüzyon ve hücre deneyleri hem kolajen içindeki herhangi bir noktada normalize spesifik konsantrasyon bulmak için denklemin içine belirli bir hücre için not geçen zaman, yer ve difüzyon katsayısı takın. </li></ol> TFM kullanılması 6. Takip Cep Göç <ol><li> TFM / DVC teknikleri aşağıdaki protokolü takip kullanarak hücre göçü izlemek için: <ol><li> # 3 içine arzu edilen kemoatraktan konsantrasyonda ilave edildikten sonra, ters çevrilmiş bir MICR üzerine monte edilmiş bir konfokal sistemi ile 3D kolajen matrisleri görüntüleme başlamakOscope hücre araştırmak için bulmak için. </li><li> Hareketli hücre bulunduğunda, görüş alanının ortasında hücreyi yerleştirin ve (z-ekseninde görüntüye) bir piezoelektrik motor, görüntü her 1 veya 2 dk kullanmaktadır. </li><li> Hücre kuvvet oluşturma ve deformasyon hesaplamak için, TFM / DVC protokolleri 31 aşağıdaki floresan boncuk deplasmanları bulmak için bir hesaplama kodu üretmek. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Adzick, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+and+Cellular+Biology+of+Wound+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair.</a> Ann Surg. 225 (2), 236(1997).</li>
<li>Reddi, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+an+unconventional+approach+to+isolation+of+first+mammalian+morphogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+F.+R%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens.</a> Cytokine Growth F. R. 8 (1), 11-20 (1997).</li>
<li>Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cancer.</a> Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).</li>
<li>Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+effect+of+chemotaxis+on+glioblastoma+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression.</a> AIChE J. 57 (3), 778-792 (2011).</li>
<li>Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+gradient+sensing%3A+towards+building+predictive+models+of+chemotaxis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 284-291 (2012).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Cristini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+Instability+and+Cancer+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Morphologic Instability and Cancer Invasion.</a> Clin. Cancer Res. 11 (19), 6772-6779 (2005).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell%27s+sense+of+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell's sense of direction.</a> Science. 284 (5415), 765-770 (1999).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+under+agarose%3A+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li>
<li>Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+controlled+molecular+gradients+in+3D+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generating controlled molecular gradients in 3D gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 91 (6), 754-759 (2005).</li>
<li>Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor-induced+cell+motility+in+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Growth factor-induced cell motility in tumor invasion.</a> Acta Oncol. 41 (2), 124-130 (2002).</li>
<li>Wilkinson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+leukocyte+locomotion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 216 (1-2), 139-153 (1998).</li>
<li>Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multichamber+fluidic+device+for+3D+cultures+under+interstitial+flow+with+live+imaging%3A+development%2C+characterization%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications.</a> Biotechnol. Bioeng. 105 (5), 982-991 (2010).</li>
<li>Noo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotechnol. 20 (8), 826-830 (2002).</li>
<li>Shao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab Chip. 9 (21), 3118-3125 (2009).</li>
<li>Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+agarose-based+microfluidic+platform+with+a+gradient+buffer+for+3D+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies.</a> Biomed. Microdevices. 11 (4), 827-835 (2009).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat. Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Sixt, M., Lammermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+chemotactic+leukocyte+migration+in+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments.</a> Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J. Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell. Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).</li>
<li>Gilbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+diffusion+through+collagen+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Macromolecular diffusion through collagen membranes.</a> Int. J. Pharm. 47 (1-3), 79-88 (1988).</li>
<li>Ramanujan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+and+convection+in+collagen+gels%3A+implications+for+transport+in+the+tumor+interstitium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium.</a> Biophys. J. 83 (3), 1650-1660 (2002).</li>
<li>Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusivity+of+125I-calmodulin+through+collagen+membranes%3A+effect+of+source+concentration+and+membrane+swelling+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio.</a> Biomaterials. 7 (4), 263-267 (1986).</li>
<li>Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+modifications+of+collagen+gels%3A+impact+on+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion.</a> Biopolymers. 89 (2), 135-143 (2008).</li>
<li>Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-stimulated+chemotaxis+of+human+neutrophils+in+a+3-D+conjoined+fibrin+gel+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay.</a> J. Immunol. Methods. 180 (2), 193-211 (1995).</li>
<li>Sundd, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+paxillin+in+rolling+neutrophils+by+dual-color+quantitative+dynamic+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting.</a> Microcirculation. 18 (5), 361-372 (2011).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Volume+Transfers+with+Serological+Pipettes+and+Micropipettors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors.</a> J. Vis. Exp. (63), 2754(2012).</li>
<li>Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. , Elsevier Science. (2010).</li>
<li>Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fast+Iterative+Digital+Volume+Correlation+Algorithm+for+Large+Deformations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mech%22%5BJournal%5D)">A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations.</a> Exp. Mech. In press, (2014).</li>
<li>Shenoy, V., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Macromolecules+in+Collagen+and+Hyaluronic+Acid%2C+Rigid-Rod-Flexible+Polymer+Composite+Matrixes%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes.</a> Macromolecules. 28 (26), 8751-8758 (1995).</li>
<li>Leddy, H., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Molecular+Diffusion+in+Articular+Cartilage+Measured+using+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

veya hücrelerin olmadan başarılı difüzyon deneyleri için en kritik adımlar şunlardır: doğru kalıp düzeneğini kurma; hidrofobik lamelleri çıkarılması sırasında zarar görmesini önlemek için gerekli el becerisi geliştirme; doğru difüzyon katsayısını hesaplamak için çok iyi bir doğrusal başlangıç ​​çizgisine bulmak için sağlanması; kollajen ve kemoatraktan hem deneysel hesaplamalar düzeltmek; Doğru kurumaz matris sağlamak için canlı hücre görüntüleme sisteminin kullanımı; ve steril, sağlıklı kültürünü sürdürmek. <p clas...

kemotaksisi olarak bilinen bir konsantrasyon gradyanı doğru hücrelerinin tercih edilen bir hareketi, vücut patolojik ve fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Bu gibi örnekler, deri ve mukoza yara iyileşmesi, 1 morfogenez 2, iltihap 3 ve tümör büyümesi 4,5 bulunmaktadır. Aynı zamanda kanser hücreleri hem bireysel hem de kolektif hücre göç stratejilerinin 6 doğru göç edebildiğini ortaya konmuştur. Ayrıca, difüzyonel istikrarsızlık mekanizmaları besin kaynağına doğru göç ve dolayısıyla daha geniş alanları ve dokuları 7 istila edebilir sonra bir tümörlü beden / nesneden tek veya kümelenmiş hücrelerin ayrılmasını teşvik edebilirsiniz. Ayrıca, çeşitli göç mekanizmaları nedeniyle adezyon moleküllerinin 8 farklı roller, 2D ve 3D aktif olabileceği gösterilmiştir. Bu nedenle, in vitro tayinlerde fizyolojik ilgili bir hareket, bir measureabl hücre hareketliliğini araştırmak içinE ve basit bir şekilde hücre hareketi fenomeni 9 anlamada önem taşımaktadır. Ne yazık ki, hücre göçü analiz zorluk, kapsamlı ölçülebilir kemotaksi deneyi genellikle tarafsız hücre hareketi ve ulaşım olayları modellerinin ölçümü üzerine kurulmuş uzun zahmetli bir yöntem gerektirir. Hücre kemotaksisini araştırmak için Geçmiş deneysel yaklaşımlar Boyden haznesi 10 ve under agaroz tahlil 11 arasındadır. Bununla birlikte, bu ilk deneylerde, hücre göçü deneyleri zamana göre hareketi izlemek yoktu. Daha da önemlisi, deneyler için kullanılan konsantrasyon gradyanlar iyi tanımlanmış değil veya sadece birkaç saat fazla için sinyalizasyon sürdürülmesi sırasında tam olarak anlaşılamamıştır. Ayrıca, erken kemotaksis odasının girişimleri iki boyutlu hücre göçü kısıtlı ve bir göç 12 kinetiği izlemek için izin vermedi. Boyden odasının baktığımızda, bir uç nokta deneyiAraştırmacı görsel göç gözlemlemek için izin vermez ve doğrudan kemokinezinin (rastgele hareket) den kemotaksis (yönlü hareket) ayırt edemedi. Buna ek olarak, gözenek boyutu ve kalınlığı birkaç değişken-farklar kolayca üretmek için çok zor odasını membranların yapımı ve kemokinlere 13,14 hücrelerin göçmen tepkisini gizli. Mikroakiskan yeni anlayışla, yeni odaları ve mikro cihazlar interstisyel akış koşulları altında hücre lokomosyon araştırmak için bir araç olarak incelenmiştir veya 15,16 kemotaksis oylandı. Bu yeni cihazlar altında, yeni hücre ölçümlerini tanıtıldı ve bir hücre 17,18 üzerinde kayma gerilmesi etkisi gibi, incelendi. Ne yazık ki, geçmiş ve şimdiki mikroakışkan kemotaksis odaları tümör hücre invazyonu ve metastaz, ve im de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçler, çünkü 2B yüzeyler-önemli bir gerileme hücre göçü çalışmalar sınırlıbağışıklık hücre göçü, göç 3D içerir. Doğrudan gözlem odaları-burada bir kemoatraktanttır çözeltisi hücreleri ihtiva eden bir 3 boyutlu jel ile temas halinde olan, aynı zamanda, aynı zamanda 19,20 bildirilmiştir. Bu odalar yatay birbirlerine 21 yanında veya konsantrik halkalar 22 olarak birleştirilmiş, iki bölmeleri, bir kemoatraktan içeren bir ve hücreleri içeren bir tane var. Bu sistemler doğru yöne, ancak uzun bir süre için bir kemotaksis sistemi tutmuyorum. Bundan başka, araştırmacılar da diyaliz hücreleri, hem de hidrostatik basınç 23-25 ​​tabi kolajen örnekler aracılığıyla izleyici moleküllerinin difüzyonuna kolajen zarları aracılığıyla yayılma inceledik. Kollajen jel bazı difüzyon deneyleri manyetik alanlar ve kimyasal birleşme 26 kullanılarak jel fiziksel ve kimyasal değişiklikler dayanır. Colla içinde yayılma modellemek için popüler bir yöntemotojen dokular sürekli nokta photobleaching floresan görüntüleme dayanır. Bu yöntem odaklı kollajenoz dokularda makromoleküllerin difüzyon katsayılarında anizotropiye ortaya koymuştur. Oysa, photobleaching eklem kıkırdağı kullanılır ve matrisleri kollajen edilmiştir. Benzer birlikte, gerekli olan modelleme deneyleri özellikle kollajen jel difüzyon katsayısı anlama yoluyla yapılması gerekir. Daha da önemlisi, sistem, hücre gücü üretimi ölçmek için bir yöntem kullanmaktadır yoktur. Ne yazık ki, çoğu sistem için ideal bir sistem için bir ya da iki temel unsuru eksik gibi görünüyor: Hücre izleme, matris tekrarlanabilirliği bir kolaylığı ile nispeten basit bir set up, en aza indirilmesi yoluyla kemotaktik faktörü ile difüzyon degrade anlayışının izin etkileşimler hücre-hücre ve boyutsal ölçümü için birimler (örneğin, hız, kuvvet, belirli konsantrasyon) ölçmek için yeteneği. Moghe ve diğ. </em&gt; 27 hücreleri başlangıçta jel boyunca dağınık ziyade filtre yüzeyinde konsantre edildiği, bu gereksinimleri en yerine bir sistem önerdi, ancak hücre üretir kuvvetleri ölçmek için zordu. Bu amaçla, biz bir hücreyi ölçmek için görüntü analiz teknikleri ile birleştiğinde time-lapse mikroskopi dayalı mevcut deneyleri, modern yayılma odası sınırlamaları aşmak için izin veren bir 3D kollajen matriks içinde kemotaksis araştırmak için bir düzlemsel degrade difüzyon sistemi sunuyoruz 3 boyutlu bir ortamda kuvvetler. Bu protokol, farklı hücrelerde 3D kemotaksis araştırmak için kullanılabilecek basit bir 3D difüzyon odasını oluşturma basit ama yenilikçi bir yol sağlar.

<table><tbody><tr><td>Silikon elastomer kiti</td><td>Dow Corning Corp</td><td>182 SIL ELAST KİTİ .5KG</td><td>10:1 karışımlı iki parçalı bir mistür</td></tr><tr><td>Canlı hücre görüntüleme odası</td><td>Canlı Hücre Aleti</td><td>CM-B18-1</td><td>CMB 18 & nbsp; mm yuvarlak lameller</td></tr><tr><td>22&nbsp; mm Cam Lamel</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0180281</td><td>Neuvitro Corp. kapak slipi 22&nbsp; mm 1.5</td></tr><tr><td>İşlenmiş alüminyum metal küp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hobi maket bıçağı</td><td>X-Acto</td><td>X3201</td><td></td></tr><tr><td>3- (aminopropil) trimetoksisilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00216A-10</td><td>Gluteraldehit, EM Sınıfı, %8</td></tr> <tr><td>50 ml tüp</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Standart zemin model ve masa üstü santrifüjler</td></tr><tr><td>Cam Petri kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>Yeniden Kullanılabilir Petri Kapları: Komple (60 x 15&nbsp; mm)</td></tr> <tr><td>Forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td>İnce Uçlu Forseps</td></tr><tr><td>Kapak camları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-105A</td><td>Dikdörtgen; 30 x 22&nbsp; Mm; Kalınlık No. 1</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooktil</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Asetik asit ACS reaktifi, > %99,7</td></tr> <tr><td>Hekzan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td>susuz, %95</td></tr> <tr><td>Etil alkol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 kanıt, moleküler biyoloji için</td></tr><tr><td>Yüksek hassasiyetli elmas kazıma aleti</td><td>Lunzer</td><td>PV-081-3</td><td>Düz uzatılmış uçlu yazıcı, .020" (.50&nbsp; mm) çap .200 "(5.0&nbsp; mm) uç uzunluğu</td></tr><tr><td>Vakumlu gres</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5C</td><td>Yüksek Vakumlu Gres</td></tr><tr><td>15 ml tüp</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>15 ml hidrofobik, biyolojik olarak inert yüzeyli konik santrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>10x fosfat tamponlu çözelti</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td>1.37 M Sodyum Klorür, 0.027 M Potasyum Klorür ve 0.119 M Fosfat Tamponu</td></tr><tr><td>1&nbsp; N sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38215</td><td>Sodyum hidroksit konsantresi</td></tr><tr><td>Kollajen I, sıçan kuyruğu</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>Sıçan kuyruğu&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikro santrifüj tüpü</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-332</td><td>Hacim: 2.0 ml; OD x L: 13&nbsp; x&nbsp; 40&nbsp; Mm; steril; tek sarmalı</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Karboksilat ile modifiye edilmiş mikroküreler</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; F-8813</td><td>Karboksilat ile modifiye edilmiş mikro küreler, 0.5 & m, sarı-yeşil floresan (505/515), %2 katı</td></tr><tr><td>madde Floresan için Rhodamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83689</td><td>Rhodamine B</td></tr></tbody></table>

planar gradient difüzyon sistemi 3d kollajen matrix kemotaksis araştırma

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Hücre göçünün önemi, insan yaşamının gelişmesiyle görülebilir. Hücreler göç ettiğinde kuvvetler üretirler ve bu kuvvetleri çevrelerine aktararak hücre hareketine ve göçüne yol açarlar. Hücre göçünü değiştirebilecek ve/veya etkileyebilecek mekanizmaları anlamak için bu kuvvetler incelenebilir. Teorik olarak, hücre göçünün altında yatan temel mekanizmaları ve güçleri anlamak, hastalıkları tedavi etmek ve hücresel transplantasyonu teşvik etmek için etkili yaklaşımların vaadini taşımaktadır. Ne yazık ki, geliştirilen modern kemotaksis odaları genellikle iki boyutla (2D) sınırlıdır ve deneyin yorumlanmasını zorlaştıran karmaşık difüzyon gradyanlarına sahiptir. Bu amaçla, hücre 3D göçünü incelemek için 3D ortamda hücre kuvvetlerini ve oda içindeki spesifik konsantrasyonu ölçebilen modern kemotaksis odası engellerinin üstesinden gelmeye olanak tanıyan kemotaksis çalışmaları için doğrudan görüntüleme odası geliştirdik ve bu yazıda tanımladık. Daha da ilgi çekici olan bu yaklaşım, 3D kollajen matrisleri aracılığıyla difüzyonun başarılı bir şekilde modellenmesine ve bir kemoatraktanın birden fazla farklı kollajen konsantrasyonu yoluyla difüzyon katsayısının hesaplanmasına olanak tanırken, sistemi çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) ve dijital hacim korelasyonu (DVC) analizi için basit ve kullanıcı dostu tutar.

doğru hücre migrasyonunu değerlendirmek için bu testin becerisi sistemin iyi bir kurulum dayanır. Bu nedenle, doğru difüzyon sistemi kalıp tasarım ve Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, hidrofobik ve hidrofilik hem lamelleri yerleştirerek büyük özen emin yapmak için kritik öneme sahiptir. Sistem düzgün tasarlanmış ve çok bulmak sağlanması difüzyon modelleme aşamasında ise sistemin yayılmasını analiz etmek için, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, bir güzel ulaşmak mümkün, lineer başlangıç ​...

Hücre göçü, insan gelişiminin ve yaşamının önemli bir parçasıdır. Hücre göçünü değiştirebilecek mekanizmaları anlamak için, mevcut tahlillerin modern difüzyon odası sınırlamalarının üstesinden gelmeye izin veren bir 3D kollajen matrisinde kemotaksisi araştırmak için düzlemsel bir gradyan difüzyon sistemi sunuyoruz.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Bu prosedürün genel amacı, 3D kolajen matrisindeki kemotaksisi incelemek için düzlemsel bir gradyan difüzyon odası oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle canlı hücre görüntüleme odası kullanılarak 3D bir silikon kalıbın üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise hidrofilik ve hidrofobik lameller hazırlamak ve bunları 3D silikon kalıbı monte etmek için kullanmaktır.Ardından, kolajen hücre karışımı merkez bölmeye eklenir ve polimerize olması beklenir. Son adım, inkübasyonun ardından hidrofobik lamellerin kalıptan çıkarılması ve bir rezervuara sade besiyeri, diğer rezervuara ise kemoatraktan içeren besiyeri eklenmesidir. Son aşamada, hücre kemotaksisini zaman içinde takip etmek ve kolajen matris içindeki hücre hareket yer değiştirmesini görselleştirmek için konfokal mikroskopi kullanılır.Bu tekniğin boin chamber ve mikro atletikler gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı, tek kullanımlık bir pipet kullanarak basit bir difüzyon gradyanı ile 3D uzaydaki migrasyonu incelemek için basit bir kurulum sağlamasıdır. 150 µL amino seline A-P-T-M-S ölçün ve 50 mL'lik bir tüpe boşaltın. Ardından, ikinci bir tek kullanımlık pipetle tüpe 30 mL %100 ethanol ekleyin ve kapağı kapatın.Tam karışım sağlandığından emin olmak için çözeltiyi iki dakika boyunca vorteksleyin. Ardından çözeltiyi cam bir Petri kabına dökün ve kenara ayırın. Sonrasında, ikinci bir Petri kabına 15 milliliters %100 etil alkol dökün ve yeni bir tek kullanımlık pipet kullanarak bunu ilk kabın yanına yerleştirin.30 mililitre deiyonize su ölçün ve çözeltiyi 50 mililitrelik bir tüpe boşaltın. Ardından, tüpe 1,875 mililitre glutaraldehit eklemek için yeni bir tek kullanımlık pipet kullanın ve kapağı kapatın. Çözeltiyi iki dakika boyunca vorteksleyin ve ardından karışımı üçüncü bir Petri kabına boşaltın.Pens kullanarak 1 adet 22 milimetre yuvarlak cam lamel alın ve her iki tarafını %100 etanol karışımı ile durulayın. Tek kullanımlık bir pipet yardımıyla, durulanan cam lameli amino seline içeren ilk kaba yerleştirin ve pens kullanarak beş dakika boyunca çözeltide bekletin. Cam lameli dışarı çıkarın ve tekrar %100 etanol ile durulayın.Ardından, durulanan cam lamelle'i glutaraldehit içeren kaba bırakın ve 30 dakika boyunca bekletin. 30 dakika sonra, cam lamelle'i pensle çıkarın ve deiyonize su ile durulayın. Durulanan lamelle'i oda sıcaklığında gece boyunca kuruması için bir peçete üzerine yerleştirin.Hidrofobik lamel hazırlamak için, önce 50 ml'lik bir tüpe 500 µL TTS, 100 µL asetik asit ve 19,4 mL heksan ekleyin ve iki dakika boyunca vorteksleyin. Ardından çözeltiyi cam bir Petri kabına dökün ve temiz bir pens yardımıyla bir cam lameli hazırlanan çözeltinin içine bırakıp iki dakika bekletin. İki dakika sonra cam lameli pensle çıkarın, tek kullanımlık bir pipet kullanarak deiyonize su ile durulayın, lameli bir peçete üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında gece boyunca kurumaya bırakın.Kurutulmuş lamelleri, başlangıç için gerekene kadar plastik bir Petri kabında saklayın ve canlı hücre görüntüleme haznesini beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde monte edin. Ardından, beş mililitre elastomer hazırlamak için silikon elastomer çözeltilerini üretici talimatlarına göre karıştırın. Son olarak, kalıp bileşenlerini yerinden oynatmamak için tek kullanımlık bir laboratuvar spatulası kullanarak silikon elastomer çözeltisini canlı hücre görüntüleme haznesi düzeneğine yavaşça dökün.Kalıbı, oda sıcaklığında bekletmek üzere gece boyunca güvenli bir yere ayırın. Ertesi sabah, kalıbı pens yardımıyla çıkarın ve işlenmiş alüminyum metal kübü kalıptan dikkatlice ayırın. Ardından, lavaboya giderek kalıbı deiyonize su ile durulayın ve kuruması için bir kağıt havlu üzerine yerleştirin.Kuruduktan sonra, silikon kalıbın her iki boyuna ucunun iç kısmına, hobi maketi bıçağı kullanarak 2.34 milimetre aralıklarla yarıklar açın. Kullanımdan önce, deney için gerekli olana kadar kalıbın güvenli ve kuru bir yerde kaldığından emin olun. Kalıbı %90 etanol ile durulayın ve gece boyunca bekletmek üzere deiyonize suyla dolu bir Petri kabına yerleştirin.Ertesi sabah, kalıbı bir kağıt havluya aktarın ve kalıp kururken havayla kurumasını bekleyin. Kareyi kesmek için yüksek hassasiyetli bir elmas çizici araç kullanın. Hidrofilik lamelleri, 3,95 mm x 5,99 mm ölçülerinden biraz daha büyük iki dikdörtgen şeklinde kesin.Ardından, kesilmiş dikdörtgen lamellerin her birini silikon kalıba açılmış yuvalara kaydırın, kalıbı ters çevirin ve tek kullanımlık bir pipet kullanarak silikon kalıbın altına vakum gresi uygulayın. Sonrasında, kalıbı tekrar düz konuma getirin ve kalıbın tabanını dairesel hidrofilik cam lamelin üzerine bastırın. Sızdırmazlık sağlamak için, 15 mililitrelik bir tüpte istenen konsantrasyonda besiyeri ve kemoatraktan karışımı hazırlayın; bu karışımın beş mililitresini yeni bir mililitrelik tüpe, beş mililitre saf besiyerini ise ikinci bir tüpe pipetle aktarın.Her iki tüpü de 37 °C'ye ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirin. Ardından, bir mikro santrifüj tüpüne 30 µL 10 XPBS pipetleyin. Aynı mikro santrifüj tüpüne altı µL 1 N sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin ve 15 saniye boyunca vorteksleyin.Ardından, bir mikro santrifüj tüpüne 18 µL sarı-yeşil floresan karboksilat modifiyeli mikroküre ve 168,3 µL buz soğukluğunda tip 1 sıçan kuyruk kolajeni ekleyin. Karışımı 30 saniye boyunca vorteksleyin.Ardından, mikro santrifüj tüpüne besiyeri içerisinde 2 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonunda olan istenen hücreden 77,7 µL ekleyin ve karıştırın. Bir pipet ucu kullanarak 20 saniye boyunca, 300 µL kolajen hücre karışımını hazırlanmış kalıp düzeneğinin orta kuyucuğuna pipetleyin.Ardından kalıbı tek kullanımlık bir Petri kabına yerleştirin ve 37 °C sıcaklıkta, %5 karbon dioksit içeren standart bir inkübatöre 20 dakika boyunca koyun. İnkübasyon süresinin ardından, her bir lamelin üst kısmından tutarak ve kalıptan yukarı ve dışarı doğru çekerek her iki hidrofobik lameli pens yardımıyla çıkarın. Tüm sistemi mikroskoba taşıyın ve kolajen kalıbın kenarlarının hala düz olduğundan emin olmak için hazneyi inceleyin; böylece sistem mikroskop altındayken daha düzlemsel bir difüzyon gradyanı sağlanmış olur. İlk kuyucuğa 100 µL hücre besiyeri ekleyin.Ardından, matrisin diğer tarafındaki kuyucuğa istenen kemoatraktan konsantrasyonuna sahip 100 µL hücre besiyeri ekleyin. Hücre migrasyonunu, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde, floresan işaretli mikroküreleri referans alarak takip edin. Burada sunulan görüntü dizisi, 1 mg/mL kolajen jel boyunca hareket eden rumine difüzyonunu göstermektedir.Bu örnek, sisteme eklenen herhangi bir kemoatraktant için de beklenebilecek olan gerçek düzlemsel difüzyon gradyanını göstermektedir. Burada gösterilen örnekte, rumine sinyalinin yoğunluğu kırmızı karelerle belirlenen konumlarda zaman içinde ölçülmüştür. Bu konumların her birindeki konsantrasyon, grafikte ayrı bir çizgi olarak gösterilmiştir; kararlı durumda yapılan ölçümler, jeldeki konuma bağlı olarak doğrusal bir konsantrasyon gradyanı oluşturmaktadır.Bu ilişki, çeşitli kolajen matris konsantrasyonları boyunca doğrusal kalmaya devam ederek bu sistemi hücre deneyleri için oldukça kullanışlı hale getirir. Bu görüntüde, konum referansı olarak kullanılan floresan yeşil mikrokürelerin dağıldığı bir kolajen matris içerisinde kırmızıya boyanmış bir nötrofil gösterilmiştir. Sonraki üç görüntü, beyaz okla belirtilen kemoatraktan gradyanı boyunca ilerleyen nötrofilin yönlendirilmiş migrasyonunu göstermektedir.Bu videoyu izledikten sonra, 3D kolajen matris içinde hücre göçünü incelemek için basit bir difüzyon odasının nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

planar-gradient-diffusion-system-to-investigate-chemotaxis-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Hücre göçü, bir kanser gibi yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin ve patofizyolojik süreçler gibi, fizyolojik bir bolluk dahil bir biyolojik bir olgudur. 3D-kollajen matris göç deneyi 3D fizyolojik gibi bir ortamda içinde farklı hücre tipleri göç özelliklerini analiz etmek için çok yönlü bir araçtır.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

Mekanik özellikler ve hücre dışı matris mikro güçlü hücre 3D göç etkiler. In vitro bir yöntem, nüfus ve tek tek hücre düzeylerde biyofiziksel değişken ortamlarda uzaysal hücre göçü davranışı incelemek için, tarif edilmektedir.

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

Kolajen ECM temel bir bileşenidir ve göç farklılaşma ve çoğalması kadar çeşitli hücresel süreçler için gerekli ipuçları sağlar. 3D kolajen hidrojellerin içinde hücreleri gömmek için bir protokol ve PDMS mikrokanallar kullanılarak randomize veya hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için daha gelişmiş bir teknik burada sağlanmıştır.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Görsel kemotaksis deneyleri kemoatraktan aracılı yönlü hücre göçü nasıl kontrol ökaryotik hücreler daha iyi anlaşılması için gereklidir. 1) Gerçek zamanlı, çoklu kemotaksis deneyleri yüksek çözünürlüklü izleme ve 2) aynı anda kemoatraktan degrade görselleştirmek ve nötrofil gibi HL60 hücrelerinde sinyal olaylarının zamanmekansal dinamiği: Burada ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Bu makale, tam kandan alınan çipte nötrofil izolasyonunu ve kemotaks testini tek bir mikroakışkan yonga üzerine entegre ederek hızlı bir nötrofıl kemotaksis tahlilini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.

Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi

Bu iletişim kuralı hücreleri hücre microenvironment koruma sırasında bir üç boyutlu ortamda göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için kullanılabilir bir ters dikey işgali tahlil açıklar. Bu tahlil nadir ve/veya hassas hücreler için uygundur.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Burada, 3D matrislerde büyüyen akons davranışlarını analiz etmek, doğal gelişimini taklit etmek için bir yöntem sağlıyoruz.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

Gelişimkolektif hücre göçü, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı genellikle büyüme faktörleri veya sinyal moleküllerinin gradyanları tarafından yönlendirilir. Burada açıklanan bir mikroakışkan sistem ve biyokimyasal gradyan altında kolektif göç mekaniği ölçmek için nasıl bir gösteri ile çekiş mikroskobu birleştiren deneysel bir sistemdir.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Burada, kemotaktik kompleman C5a gradientinde fare yerleşik periton makrofajlarını görüntülemek için zaman atlamalı, faz-kontrast mikroskobu kullanan yöntemleri açıklıyoruz. Protokoller diğer bağışıklık hücrelerine genişletilebilir.

Fare Makrofaj Kemotaksisinin Hızlandırılmış Görüntülemesi

Keşfedin, 3D kollajen matris içinde kemotaksisi araştırmak için düzlemsel gradyan difüzyon sistemi nasıl oluşturulur. Bu yöntem, hücre göçü mekanizmalarını anlamak için konfokal mikroskopi kullanarak güçlü bir platform sunar.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

Daha fazla video keşfet