Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

Bu prosedürün genel amacı, bir 3D kollajen matrisindeki kemoterapi vergilerini araştırmak için bir planya gradyan difüzyon odası oluşturmaktır. Bu, önce bir canlı hücre görüntüleme odası kullanılarak bir 3D silikon kalıbın üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hidrofilik ve hidrofobik lameller yapmak ve bunları 3D silikon kalıbı monte etmek için kullanmaktır.

Daha sonra, kollajen hücre karışımı orta bölmeye eklenir ve polimerize olmasına izin verilir. Son adım, inkübasyondan sonra hidrofobik örtü fişlerini kalıptan çıkarmak ve bir rezervuara düz ortam ve diğer rezervuara kemoterapi çekici ortam eklemektir. Sonuç olarak, konfokal mikroskopi, zaman içinde hücre kemotaksisini izlemek ve kollajen matrisi içindeki hücre hareketi yer değiştirmesini görselleştirmek için kullanılır.

Bu tekniğin boin odası ve mikro atletizm gibi mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, tek kullanımlık bir pipet kullanmadan, basit bir difüzyon gradyanı ile 3B uzayda göçü araştırmak için basit bir kuruluma izin vermesidir. 150 mikrolitre amino selin A-P-T-M-S'yi ölçün ve 50 mililitrelik bir tüpe dökün. Daha sonra ikinci bir tek kullanımlık pipetle tüpe 30 mililitre% 100 etanol ekleyin ve kapağı kapatın.

Tam karışımı sağlamak için çözeltiyi iki dakika boyunca girdaplayın. Sonra çözeltiyi bir cam Petri kabına dökün ve bir kenara koyun. Daha sonra, ikinci bir Petri kabına 15 mililitre% 100 etil alkol dökün ve yeni bir tek kullanımlık pipet kullanarak ilk kabın yanına yerleştirin.

30 mililitre deiyonize su ölçün ve çözeltiyi 50 mililitrelik bir tüpe dökün. Ardından, tüpe 1.875 mililitre glu aldehit eklemek için yeni bir tek kullanımlık pipet kullanın ve kapağı kapatın. Çözeltiyi iki dakika boyunca girdaplayın ve ardından karışımı üçüncü bir Petri kabına dökün.

Forseps kullanarak 1 adet 22 milimetre yuvarlak cam kapak kayışını çıkarın ve her iki tarafını da %100 etanol karışımı ile durulayın. Tek kullanımlık bir pipet kullanarak, durulama camı kapak fişini amino selin içeren ilk kabın içine yerleştirin ve forseps kullanarak çözelti içinde beş dakika bekletin. Cam kapak kayışını çıkarın ve tekrar %100 etanol ile durulayın.

Daha sonra durulanmış camı bırakın, kapağı glutaraldehit ile tabağa kaydırın ve 30 dakika bekletin. 30 dakika sonra, cam kapak kayışını forseps ile çıkarın ve deiyonize su ile durulayın. Durulanmış örtü kılıfını, gece boyunca oda sıcaklığında kuruması için bir mendil üzerine yerleştirin.

Hidrofobik lamel hazırlamak için önce 50 mililitrelik bir tüpe 500 mikrolitre TTS, 100 mikrolitre asetik asit ve 19.4 mililitre heane ekleyin ve iki dakika boyunca vorteksleyin. Daha sonra çözeltiyi bir cam Petri kabına dökün ve bir cam kapak damlatmak için temiz forseps kullanın, hazırlanan çözeltiye kaydırın ve iki dakika orada bırakın. İki dakika sonra, forseps kullanarak cam kapak astarını çıkarın ve tek kullanımlık bir pipet kullanarak deiyonize su ile durulayın, kapak mendilini bir mendil üzerine yerleştirin ve gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın.

Kurumuş lamel kapakları, başlamak için gerekli olana kadar plastik bir Petri kabında saklayın, canlı hücre görüntüleme odasını ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi monte edin. Ardından, beş mililitre elastomer yapmak için silikon elastomer çözeltilerini üreticinin talimatlarına göre karıştırın. Ardından, kalıp bileşenlerini rahatsız etmemek için silikon elastomer solüsyonunu canlı hücre görüntüleme odası kurulumuna yavaşça dökmek için tek kullanımlık bir laboratuvar spatulası kullanın.

Gece boyunca oda sıcaklığını ayarlamak için kalıbı güvenli bir yerde bir kenara koyun. Ertesi sabah, forseps kullanarak kalıbı dışarı çekin ve işlenmiş alüminyum metal küpü kalıptan dikkatlice çıkarın. Daha sonra, lavaboya gidin ve kalıbı deiyonize suyla durulayın ve ardından kalıbı kuruması için bir kağıt havlu üzerine koyun.

Kuruduktan sonra, silikon kalıbın içindeki her bir uzunlamasına uçtan 2,34 milimetre aralıklı yarıklar kesmek için bir hobi maket bıçağı kullanın. Kullanmadan önce kalıbın deney için gerekli olana kadar güvenli ve kuru bir yerde kaldığından emin olun. Kalıbı %90 etanol ile durulayın ve kalıbı gece boyunca oturmak için deiyonize su ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin.

Ertesi sabah kalıbı bir kağıt havluya aktarın ve kalıp kururken kurumaya bırakın. Meydanı kesmek için yüksek hassasiyetli bir elmas kazıma aleti kullanın. Hidrofilik kapak, 3,95 milimetreye 5,99 milimetreden biraz daha büyük olan iki dikdörtgene kayar.

Ardından, kesilen dikdörtgen kapak kızaklarının her birini yuvalara kaydırın, silikon kalıba kesin, kalıbı ters çevirin ve tek kullanımlık bir pipet kullanarak silikon kalıbın altına vakumlu gres sürün. Ardından, kalıbı sağ tarafı yukarı çevirin ve kalıbın altını dairesel hidrofilik cam kapak kızağının üzerine bastırın. Bir sızdırmazlık oluşturmak için, istenen konsantrasyonda 15 mililitrelik bir tüpte bir ortam ve kemoterapi cezbedici karışımı hazırlayın, karışımın beş mililitresini yeni bir mililitre tüpe ve beş mililitre düz ortamı ikinci bir tüpe pipetleyin.

Her iki tüpü de 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış bir su banyosuna taşıyın. Ardından, 30 mikrolitre 10 XPBS'yi bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin. Aynı mikro santrifüj tüpüne bir normal sodyum hidroksit çözeltisinden altı mikrolitre ekleyin ve 15 saniye boyunca girdap yapın.

Daha sonra bir mikro santrifüj tüpüne 18 mikrolitre sarı yeşil floresan karboksilat, modifiye edilmiş mikroküreler ve 168.3 mikrolitre buz gibi soğuk ekleyin. Bir sıçan kuyruğu kollajeni yazın. Karışımı 30 saniye boyunca girdaplayın.

Ardından, istenen hücrenin 77.7 mikrolitresini ekleyin. Mikro santrifüj tüpüne ortamdaki mililitrede altı hücreye iki kez 10 yazın ve karıştırın. 20 saniye boyunca bir pipet ucu kullanarak, 300 mikrolitre kollajen hücre karışımını hazırlanan kalıp düzeneğinin orta kuyucuğuna pipetleyin.

Daha sonra kalıbı tek kullanımlık bir Petri kabına yerleştirin ve %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca standart bir inkübatöre taşıyın İnkübasyon süresinden sonra, her bir kapak fişinin üstüne kenetleyerek ve ardından kalıptan yukarı ve uzağa çekerek her iki hidrofobik örtü kızağını çıkarmak için forseps kullanın. Tüm sistemi mikroskoba taşıyın ve kollajen kalıbının kenarlarının hala düz olduğundan emin olmak için odayı inceleyin, bu da hala mikroskop altında bir sistemle planya difüzyon gradyanına izin verir. İlk kuyucuğa 100 mikrolitre hücre ortamı ekleyin.

Daha sonra, matrisin diğer tarafındaki kuyucuğa istenen kemoterapi cezbedici konsantrasyonuna sahip 100 mikrolitre hücre ortamı ekleyin. Ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi floresan etiketli mikro kürelere göre hücre göçünü izleyin. Burada sunulan bir dizi görüntü, mililitre kollajen jeli başına bir miligram boyunca hareket eden ruminin difüzyonunu göstermektedir.

Bu örnek, sistemin gerçek düzlemsel difüzyon gradyanını gösterir ve bu, tanıtılan herhangi bir kemoterapi cezbediciden de beklenebilir. Burada gösterilen örnekte, rumin sinyalinin yoğunluğu, kırmızı karelerle tanımlanan konumlarda zaman içinde ölçülmüştür. Bu konumların her birindeki konsantrasyon, bu grafikte, kararlı durumda ölçüldüğünde, jeldeki konuma bağlı olarak doğrusal bir konsantrasyon gradyanı üreten ayrı bir çizgi olarak gösterilmiştir.

Bu ilişki, bir dizi kollajen matris konsantrasyonu boyunca doğrusal kalır ve bu sistemi hücre deneyleri için çok kullanışlı hale getirir. Bu görüntüde, konum referansları olarak kullanılan floresan yeşil mikro küreciklerle dağılmış bir kollajen matrisi içinde kırmızı renkli bir nötrofil gösterilmektedir. Sonraki üç görüntü, nötrofilin beyaz okla gösterilen bir kemoterapi cezbedici gradyanda yukarı doğru hareket ederken yönlendirilmiş göçünü göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir 3D kolajen matrisinde hücre göçünü araştırmak için basit bir difüzyon odasının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.