Faz Diyagramı Karakterizasyonu Sıvı Taşıyıcılar Manyetik Boncuk Kullanarak

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir laboratuvar ve tüp düzeneği içindeki bitişik sıvı segmentler arasındaki taşıma hacmini manyetik boncuklar kullanarak analiz etmektir. Bu işlem; hidrofobik tüpler kullanılarak düzeneğin oluşturulması, bir şırınga pompasıyla hava valflarıyla ayrılmış birden fazla sıvı segmentinin yüklenmesi ve sıvılardan birine hem manyetik boncukların hem de floresan bir boyanın dahil edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, manyetik boncukların her bir transferi harici bir mıknatıs kullanılarak gerçekleştirildikten sonra, bitişik sıvı segmentlerin floresan yoğunluğu bir mikroskop yardımıyla ölçülür.

Manyetik boncukların taşınma hacmini hesaplamak amacıyla, bu floresan yoğunluk ölçümleri üzerinde sayısal analizler yapılır. Sonuçlar, iki sıvıdan oluşan çok bileşenli bir sistemdeki faz değişiminin analizinin, mikrolitre boyutundaki sıvı hacimlerini komşu rezervuarlar arasında aktarma yöntemi olarak manyetik boncukların kullanılabilirliği sayesinde mümkün olduğunu göstermektedir. Bugün göreceğiniz üzere, daha karmaşık geleneksel mikroakışkan devrelerin aksine, basit bir tüp içinde sıvıların aktarılmasında manyetik boncukların kullanıldığı bu oldukça heyecan verici ve basit teknikle çalışıyoruz.

Bu yöntemi başlangıçta izin verilen akışkanlar arasındaki faz bazlı incelemelere uyguladık ve şu an bunu; tam kanın diyagnostik analizi, proteinlerin kırmızı kan hücrelerinden ayrılması, idrar analizi, immünassaylar ve benzeri diğer uygulamalara genişletiyoruz. Bu tekniğin, mikroakışkan kanalların kullanımı gibi mevcut diğer yöntemlere göre temel avantajı, basit olması ve maliyet etkin bir üretime sahip olmasıdır. Farklı deney türleri arasında yüksek kullanıcı değişkenliği sunar ve tutarlı sonuçlar verir.

Bu yöntem, çok küçük, pik hacimlerin hareketini gerektiren uygulamalar hakkında bilgi sağlayabilse de aynı zamanda kan ayırma, ilaç hedefleme ve kontrast maddeler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Tüpü hazırlamak için önce boruyu 15 santimetrelik segmentler halinde kesin, tüp segmentlerini bant kullanarak dikey olarak asın ve fazla floropolimer çözeltisini toplamak için tüplerin altına bir kağıt havlu yerleştirin. Bir pipet kullanarak, her tüp segmentinin üst açıklığından, iç duvarın tüm çevresiyle temas edecek şekilde 100 µL floropolimer çözeltisi enjekte edin.

Fazla floropolimer çözeltisinin uzaklaşması için tüp segmentlerinin bir saat boyunca asılı kalmasını sağlayın. Ardından, floropolimer kaplama tabakasını tavlamak için tüp segmentlerini 100 °C'deki bir fırında bir saat bekletin. Sonra, 20 mL'lik bir numune şişesini mikro terazinin üzerine yerleştirip terazayı sıfırlayarak seyreltilmiş manyetik boncuk çözeltisini hazırlayın.

Manyetik boncuk çözeltisi kabını çalkalayın ve ardından bir mikropipet kullanarak 0,6 milliliters çekin. Pipetlenmiş çözeltiyi terazideki örnek tüpüne aktarın ve örnek tüpüne 0,4 milliliters distile su ekleyin. Ayrıca, ağırlıkça yüzde 0,02 oranında boyayı deiyonize su içerisinde çözerek ve çözeltiyi bir dakika boyunca vorteksleyerek floresan boyayı hazırlayın.

Hortum düzeneğini hazırlamak için, hortumun bir ucuna dişi luer lock konnektör takın. Hortumu, üç mililitre hacimli ve 0,1 mililitre derecelendirmeli bir luer lock şırınganın içine yerleştirin. Şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ve besleme hızını saatte iki mililitre olarak ayarlayın.

Şırınga pompasıyla 20 µL çekip tüpe yerleştirmeden önce, manyetik boncuk çözeltisi içeren kabı vorteksleyin. Test odasına sıvı aktarımı tamamlandıktan sonra, tüpe altı µL hava çekin. Bu hava hacmi, daha sonra iki sıvı segmenti arasında bir valf oluşturacaktır.

Hava boşluğu yerleştirme işlemi tamamlandıktan sonra, floresan boyalı sıvıdan 180 µL çekmeye başlayın. Tüpün diğer ucuna ikinci bir dişi luer lock konnektörü yerleştirin ve tüp düzeneğini şırıngadan çıkarın. Ardından, düzeneğin her iki ucuna luer lock kapaklar takın.

Ters mikroskop kullanarak test odasının ve rezervuarın başlangıç floresan yoğunluk ölçümünü yapın. Tüm manyetik boncukların test odasındaki tek bir bölgede toplanması için cihazı küp mıknatısın üzerine yerleştirin. Cihazı mıknatısın üzerinde hareket ettirerek boncukları rezervuara aktarın.

Manyetik boncuk kümesi hava boşluğu üzerinden geçirilip rezervuara aktarıldıktan sonra, rezervuarın homojenizasyonu tamamlanana kadar, cihazı mıknatısın üzerine yerleştirip döndürerek küme içinde hapsolan sıvının salınmasını sağlayın ve manyetik boncukları karıştırın. Ardından, rezervuardaki tüm manyetik boncuklar tek bir bölgede toplanacak şekilde cihazı mıknatısın üzerine yerleştirin. Manyetik boncuk kümesini tekrar test haznesine aktarın.

Küme test haznesine ulaştığında, cihazı mıknatısın üzerine yerleştirip döndürerek manyetik boncukları çalkalayın. Test haznesinin homojenizasyonu tamamlanana kadar hapsolmuş floresan sıvıyı serbest bırakın. Ters mikroskop kullanarak hem test haznesinin hem de rezervuarın floresan yoğunluk ölçümlerini yapın.

Her iki sıvı segmenti benzer floresan yoğunluklarına ulaşana kadar bu adımları tekrarlayın. Tüp düzeneğini hazırlamak için, tüpün bir ucuna dişi luer lock takın ve tüpü luer lock şırıngaya yerleştirin. Ardından şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ve besleme hızını saatte iki mililitre olarak ayarlayın.

Şırınga pompası çekimi kullanarak, tüpe bir bölü bir oranında su içinde manyetik boncuklar ve C 12 E 5 karışım çözeltisinden 20 µL ekleyin. Test odasındaki sıvı ekleme işlemi tamamlandıktan sonra, hava boşluğu eklemesini takiben tüpe 6 µL hava çekin. Optikleri kurmak için 180 µL saf C 12 E 5 sürfaktan çekmeye başlayın.

İlk olarak, manyetik boncuklar içeren test odasının stereo mikroskopla odak noktasında kalacak şekilde tüp düzeneğine sahip şırınga pompasını hareket ettirin; çapraz polarizörler kullanılır. Çöktürülmüş katı faz ile sıvı faz arasındaki kontrastı artırmak için, bir LED ışık kaynağının üzerine bir polarize film tabakası yerleştirin. LED ışık kaynağını şırınga pompasına bağlı tüpün altına kaydırın.

Başka bir polarize film şeridini, iki polarize filmin birbirine göre 90 derece açıyla yerleştirildiğinden emin olarak, bant yardımıyla stereo mikroskobun lensine tutturun. Küp mıknatısı, bir standa monte edilmiş haldeyken test odasının yanına yerleştirin. Manyetik boncuklar bir küme oluşturduğunda, manyetik boncuk kümesinin test odasından hava boşluğu boyunca geçerek sürfaktan rezervuar odasına taşınmasını sağlayacak şekilde, tüpe saatte iki mililitre besleme hızıyla sıvı pompalamaya başlayın.

Manyetik boncuk kümesi rezervuar bölmesinin orta noktasına ulaştığında, şırınga pompasındaki pompalama işlemini durdurun. Manyetik boncukların ayrılması ve manyetik boncuk kümesine hapsolmuş sıvının difüzyon süresinin azalması için küp mıknatısı tüpten uzaklaştırın. Sıvının difüzyonu ve faz değişimi tamamlandığında, manyetik boncuklar tekrar bir küme oluşturacak şekilde mıknatısı rezervuarın yanındaki eski konumuna geri yerleştirin.

Şırınga pompasını kullanarak, manyetik boncuk kümesi sürfaktan rezervuarından hava boşluğu üzerinden geçirilip tekrar test odasına aktarılacak şekilde sıvıları çekin. Manyetik boncuk kümesi test odasının orta noktasına ulaştıktan sonra şırınga pompasını durdurun ve küp mıknatısı tüpten uzaklaştırın. Sıvının difüzyonu ve faz değişimi tamamlandığında, manyetik boncuklar bir küme oluşturacak şekilde mıknatısı rezervuar yanındaki eski konumuna geri yerleştirin.

Test odası bir faz değişimi gösterene kadar bu adımları tekrarlayın. Burada, hidrofobik tüpün içindeki manyetik boncukların suyu ve iyonik olmayan sürfaktan C 12 E beşin bir görüntüsü gösterilmektedir. İlk manyetik boncuk aktarım işlemi sırasında, boncuklar harici bir küp mıknatıs kullanılarak yerinde tutulur.

Sıvılar burada sola doğru pompalandığında, boncuklar test haznesinden çıkarak C 12 E beşe girer. Manyetik boncuklar girdikten sonra, sürfaktan su manyetik boncuk yapısından uzaklaşmaya başlar. Manyetik boncuklar sürfaktan haznesinde beş saniye kaldıktan sonra, onuncu saniyede sadece küçük bir faz değişimi görülür.

Manyetik boncuklar tamamen sürfaktan ile çevrelenmiştir. Faz değişimi, dört. dakika işaretindeki 92. noktada devam etmektedir. Dokuzuncu dakikada faz değişimi artış göstermektedir.

Yapı dikey olarak büyürken, yatay faz değişimi azalmaya başlar. 17. dakikada faz değişimi boyut olarak önemli ölçüde küçülmüşken, 25. dakikada faz değişiminden sadece küçük bir miktar kaldığı görülmektedir. Burada, sürfaktan aktarılmadan önce cihazdaki manyetik boncukları içeren bir su C 12 V beş test odasının başlangıç durumu yer almaktadır.

Altı gidiş-dönüş transferinden sonra bir faz değişimi meydana geldi. Buna karşın, cihazda manyetik boncuk bulunmadığında herhangi bir faz değişimi gözlemlenmedi; bu durum, gözlemlenen sonuçların sıvıdan ziyade manyetik boncuk taşınmasından kaynaklandığını kanıtladı. Bu prosedür uygulanmaya çalışılırken tüpün iç duvarlarına yapışma gözlemlendi.

Bu prosedürü izlerken, bitişik rezervuarlar arasında sıvı aktarımı yapıldığında difüzyon sürecinin gerçekleşebilmesi için yeterli zaman tanımanız önemlidir. Bölünme sürecini nasıl hızlandırabileceğiniz ve manuel manipülasyonu nasıl en aza indirebileceğiniz gibi ek soruları yanıtlamak için, elektromanyetik vejetasyon kullanımı gibi diğer seçenekler sistemimize dahil edilebilir. Bağlam olarak belirtmek gerekirse; esasen plastik bir tüp, manyetik boncuklar ve harici bir mıknatıs içeren bu oldukça basit teknik, farklı sıvıların ayrılmasında ve bunların faz diyagramı alanlarının keşfedilmesinde uygulanmıştır.

Buna rağmen, tekniğin çok yönlülüğü ve basitliği, öncelikle farklı sıvıların diyagnostik analizi alanında olmak üzere birçok diğer uygulamada karşılığını verecektir. Manyetik boncukları kullanarak, ya doğrudan ya da manyetik boncukların fonksiyonelleştirilmesi yoluyla küçük hacimleri taşıyarak sıvı örneğinin bileşenlerini analiz edebiliriz. Ve bunun her alanda uygulamaları mevcuttur.

Örneğin, konvansiyonel mikroakışkan cihaz üretiminin getirdiği karmaşıklık ve maliyete gerek duymadan, basit bir teknik kullanılarak tamam kan içindeki eritrositlerden proteinin ayrıştırılması ve analizi, benzer şekilde idrarda ve bu yöntemle analiz edilebilen diğer birçok sıvıdaki analizler buna örnektir.