Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Bu protokol, seçilen reaksiyon izleme kullanılarak karmaşık biyolojik numuneler içindeki hedef proteinlerin mutlak miktar tayini testlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Fare makrofaj kemotaksisi sinyal yolunun proteinlerini doğru bir şekilde ölçmek için kullanıldı. Hedef peptit seçimi, tahlil geliştirme ve kalitatif ve kantitatif tahliller ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, karmaşık biyolojik numuneler içindeki hedef proteinlerin mutlak bolluğunu ölçmek için sıvı kromatografisi, seçilmiş reaksiyon izleme veya L-C-S-R-M kullanmaktır. Peptit hedeflerinin seçilmesini takiben, ham harici peptit standartları sentezlenir ve sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi veya LCM ms kullanılarak SRM tahlilleri geliştirmek için kullanılır. Elde edilen tahliller, hazırlanan biyolojik numunelerin kalitatif lc, SRM analizini gerçekleştirmek için kullanılır.

Biyolojik numuneden türetilen hedef peptit tespit edilirse, biyolojik numuneler, dahili peptit standartlarının kararlı bir izotop seyreltme serisi eklenerek kantitatif lc SRM testleri kullanılarak analiz edilir. Sonuç olarak, lc SRM, çok çeşitli biyolojik örneklerden proteinleri doğru bir şekilde ölçmek ve çok çeşitli protein hedeflerinin araştırılmasını desteklemek için kullanılabilir. Bu tekniğin immünolojik testler gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, tahlil geliştirmenin nispeten hızlı ve ucuz olması ve sonuçta ortaya çıkan tahlillerin çoğullamaya uygun olması ve antikor çapraz reaktivitesine karşı savunmasız olmamasıdır.

Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi liyofilize peptit standartlarını hazırlayın. Daha sonra, 10 mikromolar'lık bir peptit konsantrasyonu üretmek için her bir M Liyofilize peptit standardına 100 mikrolitre formik asit asetonitril çözeltisi ekleyin. Numuneleri iki dakika vorteksleyin ve banyo yapın.

Peptit çözünmesinin tamamlandığından emin olmak için onları beş dakika boyunca sonikleştirin. Çözünmüş peptitleri çekin ve elde edilen karışımı bir vakum yoğunlaştırıcıda 80 mikrolitrelik bir nihai hacme konsantre edin. Çökelmiş herhangi bir peptidi çözmek için 20 mikrolitre asetil nitril ekleyin.

Numune şimdi her bir peptitin 10 mikromolar yanı sıra hacim asetil nitril% 20 hacim içerir ve kullanılabilir Dahili ve harici peptit standartlarını hazırlamak için, harici peptit standartlarının karışımlarını, üçlü dörtlü kütle spektrometresine bağlı bir nano akış HPLC sistemi kullanarak av tüfeği kütle spektrometresi ile enjeksiyon başına her bir peptidin yaklaşık bir ila 10 pikomolünde analiz edin. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, her LCMS çalışmasının 60 dakikalık bir doğrusal gradyan, bir sütun yeniden oluşturma adımı ve bir sütun ree dengeleme adımı içerdiğinden emin olun. Elde edilen av tüfeği verilerini, harici peptit standartlarının dizilerine karşı arama yaparak veritabanını kullanarak analiz edin.

Hepsinin kesin olduğundan emin olmak için tüm peptit tanımlamalarını manuel olarak gözden geçirin ve herhangi bir belirsiz peptit tanımlamasını atın. Skyline Line gibi bir yazılım programı kullanarak bir spektrum kitaplığı oluşturmak için av tüfeği Ms Peptide tanımlamalarını kullanın. Öncü iyon başına en yoğun üç ila 10 geçişi kullanarak bir lc SRM geçiş listesi hazırlayın.

Harici peptit standartlarının karışımlarının lc SRM analizini gerçekleştirmek için ortaya çıkan geçiş listelerini kullanın. Elde edilen L-C-S-R-M verilerini manuel olarak gözden geçirin ve düşük performans gösteren tahlilleri silin. Biyolojik numuneleri hazırlamak.

İlk olarak, hücreleri metin protokolünde açıklandığı gibi hasat edin. 400 mikrolitre taze hazırlanmış üre lizis tamponu ekleyin ve her bir numuneyi nazik pipetleme kullanarak karıştırın. Her numuneyi, yaklaşık 100 mikrolitre 0.1 milimetre Zirkonya silika boncuk, lyce hücreleri içeren bir O-ringli vidalı kapaklı iki mililitrelik bir tüpe, numuneleri tam hızda banyoda beş dakika boyunca vorteksleyerek aktarın.

Homojenizasyona ve protein olgunlaşmasına yardımcı olmak için numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra, kalitatif analiz için bir bissy asit tahlili gibi lizatların bir protein konsantrasyonu tahlili gerçekleştirin. Kararlı bir izotop seyreltme serisi için 200 mikrogram hücre lizatı alikotu hazırlayın.

İç peptit standartlarının yankı molar karışımının kararlı izotop seyreltme serisini numunelere ekleyin. Her numuneye 0.7 mikrolitre bir molar DTT ekleyerek ve numuneleri 60 santigrat derecede 30 dakika inkübe ederek protein sistein kalıntılarını azaltın. Her numuneye yedi mikrolitre tamponlu ITO asetamid ekleyerek ve numuneleri oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika inkübe ederek protein sistinlerini alkilat edin.

Numunelerin her biri için, nihai üre konsantrasyonu bir molar olacak şekilde sodyum hidroksit ile ayarlanmış 482 mikrolitre 100 milimolar hees ekleyin. Daha sonra, üç kez, proteinleri peptitlere sindirin. Hücre lizatı içeren her numuneye mikrolitre başına 0.5 mikrogram dizileme dereceli tripsin ekleyin.

Daha sonra numuneyi 37 santigrat derecede 18 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hacim formik aside 440 mikrolitre hacimce %2 ekleyin, tüm numuneleri oda sıcaklığında 21.000 G'de 20 dakika santrifüjleyin ve bir C 18 SPE kartuşunun katı fazını tıkayacak herhangi bir çökeltiyi peletleyin. Tek kullanımlık bir C 18 SPE kartuş patlaması kullanarak SUP natinlerinin her birini çıkarın.

Bir mililitre tampon B uygulayarak sütunu ıslatın ve iki kez bir mililitre tampon a uygulayarak dengeleyin. Düz bir yüzeyden kauçuk ampule ve bir ekstraksiyon manifolduna kullanarak mobil fazları C 18 SPE kartuşundan geçirin. Numuneyi uygulayın ve ardından kartuşu bir mililitre tampon A ile yıkayın, bir mililitre tampon B uygulayarak peptitleri iki kez elüte edin. Asetil nitrili buharlaştırmak için her bir ilu'yu bir vakum yoğunlaştırıcıda 100 mikrolitrelik son hacme yavaşça konsantre edin.

Daha sonra her numuneye asetil nitril içinde hacimce formik asit olmak üzere iki mikrolitre ekleyin. Daha önce olduğu gibi kalitatif L-C-S-R-M kullanarak örnekleri analiz edin. Kantitatif LCSRM analizi için, harici peptit standartlarını analiz etmek için av tüfeği kütle spektrometresi kullanılan her biyolojik numunenin izotop seyreltme serisini çalıştırın.

Öncü başına en yoğun 10 geçiş L-C-S-R-M için seçildi. LCSRM daha sonra harici peptit standartlarını analiz etmek için kullanıldı. Elde edilen peptit tanımlamaları açık olmalıdır.

Biyolojik örneklerin kalitatif LCSRM analizi tipik olarak daha fazla arka plan sinyali ile sonuçlandı, ancak peptit hedeflerinin çoğu güvenle tanımlandı. Kantitatif L-C-S-R-M, biyolojik numunelere çivilenmiş dahili peptit standartları kullanılarak gerçekleştirildi. Elde edilen protein bolluğu değerleri, biyolojik kopyalar ve hedef protein başına iki hedef peptit arasında tutarlıydı.

Bu videoyu izledikten sonra, karmaşık biyolojik numunelerdeki hedef proteinlerin mutlak bolluğunu ölçmek için L-C-S-R-M tahlillerinin nasıl geliştirileceğini ve gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.