Polarize Sinir Doku Engineered 3D İpek-kolajen bazlı Modeli
October 23rd, 2015
Beynin karmaşık eylemlerine ilişkin içgörü, gelişmiş araştırma araçları gerektirir. Burada, beyin benzeri mimariye benzeyen yeni bir ipek kollajen bazlı 3D mühendislik nöral doku modelini gösteriyoruz. Model, nöronal ağ montajı, aksonal rehberlik, hücre-hücre etkileşimleri ve elektriksel aktiviteyi incelemek için kullanılabilir.
Bu prosedürün genel amacı, 3D beyin benzeri dokuların mühendislik sürecini göstermektir. Bu, önce gözenekli iskelelerin bir tuz liçi tekniği kullanılarak ipek çözeltisinden hazırlanmasıyla elde edilir. İkinci adım, iskeleleri halka şekillerine önceden kesmek ve sterilizasyon ve poli de lisin veya PDL ile kaplayarak hücre kültürüne hazırlamaktır.
Daha sonra, hazırlanan iskeleler taze izole edilmiş primer sıçan kortikal nöronları ile tohumlanır. Son adım, iskelelerin kollajen gömülmesi ve kültür plakalarına aktarılmasıdır. Sonuç olarak, sinir ağlarının sinirsel büyümesini ve gelişimini göstermek için immünofloresan mikroskobu kullanılır.
Bu tekniğin etkileri, beyni etkileyen hastalıkların tedavisine veya teşhisine kadar uzanır, çünkü bu teknik, Parkinson veya Alzheimer'ın yeni araştırma modellerini geliştirmek için bir temel olarak kullanılabilir. Başlamadan önce, %6'lık ipek çözeltisini metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın ve dört santigrat derecede saklayın. Gözenekli iskeleleri hazırlamak için önce elek, granül sodyum klorür ve çapı 500 ila 600 mikrometre arasında olan granülleri toplayın.
30 mililitre ipek çözeltisini politetrafloroetilen veya PTFE kalıba dökün ve ardından 60 gram eleme sodyum klorürü eşit şekilde dağıtın. Çözüm. İpeği polimerize etmek için oda sıcaklığında 48 saat inkübe edin.
İpeğin çapraz bağlanmasını tamamlamak ve kalan sıvıyı buharlaştırmak için küf içeren iskeleyi bir saat boyunca 60 dereceye ayarlanmış bir fırına yerleştirin. Daha sonra, kalıp ve iskele kombinasyonunu 48 saat boyunca iki litrelik bir damıtılmış su kabına batırın. Tuzu süzmek için suyu günde iki ila üç kez değiştirin.
İskeleyi kalıptan çıkarın ve küçük parçalar halinde kesin. Önce beş milimetre çapında bir biyopsi yumruğu ile. Daha sonra iskeleyi iki milimetre yüksekliğinde olacak şekilde kesin ve iki milimetrelik bir biyopsi zımbası ile her parçadan merkezi çıkarın.
İskeleleri 20 dakika boyunca ıslak bir döngüde otoklavlayın. Bir hücre kültürü başlığının içine bir çift sterilize forseps, hücre kültürü ortamı ve otoklav iskeleleri yerleştirin. 96 oyuklu bir plakayı ambalajından çıkarın ve iskeleleri tohumlamak için içine yerleştirin.
İlk önce kuyu başına bir steril iskele yerleştirin. 96 oyuklu plakada, iskeleleri daldırmak için hücre kültürü ortamı ekleyin ve en az 30 dakika dengelemek için bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, fazla ortamı iskelelerden aspire edin.
Daha sonra, iskele başına 100 mikrolitre nöro bazal ortamda altı sıçan kortikal nöronal hücresine iki kez 10 ekleyin. Plakayı inkübatöre geri koyun ve hücrelerin iskeleye yapışmasına izin vermek için gece boyunca bırakın. Ertesi sabah.
Bağlanmamış hücreleri dikkatlice aspire edin ve 200 mikrolitre taze hücre kültürü ile değiştirin. Orta. Kısa bir süre için 37 santigrat derece inkübe edin. Daha sonra, steril forseps kullanarak ortamı kuyulardan aspire edin.
Hücrelerin bulunduğu iskeleleri 96'nın boş kuyularına aktarın. Daha sonra her iskeleye 100 mikrolitre taze seyreltilmiş buz gibi, mililitre sıçan kuyruğu kollajen çözeltisinde üç miligram plaka koyun. Kollajenin 30 dakika boyunca polimerizasyonuna izin vermek için hücreleri 37 santigrat derece inkübatöre geri koyun.
Plakayı inkübatörden çıkarın ve 100 mikrolitre ön ısıtma hücre kültürü ekleyin. Kuyu dönüşü başına orta. İstenilen hücre büyümesi süresi için plakayı inkübatöre çevirin, her bir oyuktaki ortamın yarısını bir haftaya kadar her gün taze ortamla değiştirin.
Bu oldukça gözenekli iskelelerde, nöronal hücreler gösterilen yüksek bir yoğunluğa kadar kültürlenebilir. İşte hücre canlılığı sonuçları. Tohumlamadan bir gün sonra, floresan di asetat etiketli canlı hücreler yeşil ve propidyum iyodür ve ipek iskelesinde görünür.
Kırmızı renkte, düşük büyütme altında görülen canlı hücrelerin yüksek yüzdesine dikkat edin. Bu şekil, halka şeklindeki iskele içindeki nöronal hücre gövdelerinin ve aksonal süreçlerin kompartmanizasyonunu göstermektedir. Nöronal hücre gövdeleri, tohumlamadan bir gün sonra burada görüldüğü gibi ipek iskeleye bağlı kalır: hücreler beta üç tübülin için immünoyla boyanır ve yeşil görünür.
Beklendiği gibi, hücreler kültürün yedinci gününe kadar iskeleyi yoğun bir şekilde doldurmuştur. Buna karşılık, iskelenin merkezi oyuğundaki kollajen matrisi, geniş aksonal büyüme için destek sağlar. Burada gösterilen aksonal ağ işidir.
Tohumlamadan yedi gün sonra. Bu film, sinir ağı hücrelerini içeren iskelenin merkezi kollajen penceresinin konfokal Z taramasını beta üç tübülin için boyama ile işaretlenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, 3D beyin benzeri doku yapılarının nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu çalışma, beyne benzer mimariyi taklit eden yeni bir ipek-kolajen bazlı 3D mühendislikli sinir dokusu modelini sunar. Model, nöronal ağ montajı, aksonal yönlendirme, hücre-hücre etkileşimleri ve elektriksel aktivitenin araştırılmasını kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyomedikal Mühendisliği
- Doku Mühendisliği
Arka Plan
- Beyin işlevini anlamak ileri modeller gerektirir.
- 3D doku mühendisliği beyin benzeri yapıları kopyalayabilir.
- Bu model, nöral etkileşimler üzerindeki araştırmaları geliştirmeyi amaçlamaktadır.
- Potansiyel uygulamalar arasında nörodejeneratif hastalıkların incelenmesi bulunmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Nöral dokuyu incelemek için bir 3D model geliştirmek.
- Kontrollü bir ortamda nöronal davranışı araştırmak.
- Gelecekteki terapötik araştırmalar için bir platform sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Tuz sızdırma kullanarak gözenekli ipek iskelelerin hazırlanması.
- İskeleler üzerinde primer sıçan kortikal nöronlarının hücre kültürü.
- Nöronal büyümeyi desteklemek için kolajen gömme.
- Nöral ağları görselleştirmek için immünofloresan mikroskopi.
Ana Sonuçlar
- Beyin benzeri 3D doku yapılarının başarılı bir şekilde yaratılması.
- İskeleler üzerinde nöronal yapışma ve büyümenin gösterilmesi.
- Aksonal süreçlerin ve hücre canlılığının görselleştirilmesi.
- Parkinson ve Alzheimer gibi hastalıkları modelleme potansiyeli.
Sonuçlar
- Ipek-kolajen modeli nöral çalışmalar için etkilidir.
- Nöronal etkileşimler ve büyüme hakkında bilgiler sunar.
- Bu teknik, yeni araştırma modelleri geliştirmeye yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Engineered 3D silk-collagen neural tissue models address the critical need for physiologically relevant in vitro systems to study brain architecture and function. This platform enables predictive interrogation of neuronal network assembly, axonal guidance, and cell-matrix interactions, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease research. Its compartmentalized design enhances translational continuity from discovery through preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of neuronal outgrowth and network formation in a controlled 3D environment.
- Supports mechanistic de-risking by modeling compartmentalized neural tissue architecture.
- Facilitates hypothesis-driven studies of axonal guidance and cell-cell interactions relevant to disease pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible scaffold for quantitative evaluation of neuronal viability and network assembly.
- Standardizes biological system preparation for downstream compound screening or perturbation studies.
- Enables high-content imaging and immunofluorescence-based readouts for assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling for neurodegenerative disorders such as Parkinson's and Alzheimer's.
- Supports continuity from in vitro discovery to preclinical validation by mimicking native neural tissue compartments.
- Reduces translational risk by providing physiologically relevant data on neural network behavior.
Pipeline & Workflow Integration
This 3D neural tissue model integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and translational research in neurobiology.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on neuronal network assembly and axonal compartmentalization.
- Screening: Provides standardized, reproducible platforms for quantitative viability and network analysis.
- Analytics: Supports immunofluorescence and live/dead cell imaging for robust data outputs.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant neural tissue architecture for preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable system for diverse neurobiological research pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neural target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of neural tissue modeling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing biological ambiguity in early discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neurodegenerative disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue engineering and primary neuronal culture techniques.
- Needs access to cell culture, scaffold fabrication, and advanced imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible scaffold preparation and cell seeding.
- Adaptable to various neuronal sources but may require protocol optimization for different species or cell types.
- Limitations include reliance on primary rat neurons and potential scalability constraints for high-throughput applications.
