Name: Polarize Sinir Doku Engineered 3D İpek-kolajen bazlı Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Keşfedin ipek-kolajen bazlı 3D sinir doku modeli geliştirme yöntemini. Tuz liçingi ile gözenekli iskelet hazırlayıp sıçan kortikal nöronları ekleyerek beyin benzeri yapılar oluşturun.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Stephen Moss'un laboratuvarına embriyonik sıçan beyin dokuları sağladığı için teşekkür ederiz. MDT orijinal protokolü tasarladı. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri P41 Doku Mühendisliği Kaynak Merkezi Hibe EB002520 tarafından finanse edilmiştir. K.C., Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından Doktora Sonrası Bursu ile desteklenmiştir (CH 1400/2-1).

Beyin dokusu izolasyon protokolü Tufts Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Bakımı ve Kullanımı Laboratuvar Hayvanları (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi B2011-45) Sağlık Rehberi National Institutes ile uyumludur edildi. 1. İpek İskele Hazırlık <ol><li> Ipek böceği kozası ipek solüsyonunun hazırlanması, daha önce 19,20 açıklandığı gibi. <ol><li> Makas kullanılarak 8 eşit parçaya her koza kesin. Parçalanmış koza 5 g için yaklaşık 11 koza kullanın. (15 dakika) </li><li> 0.02 M Na 2 CO 3 çözeltisi 2 L hazırlayın ve sıcak bir plaka kullanılarak kaynatın getirmek. (15 dakika) </li><li> Parçalanmış kozaların 5 g tartın ve 30 dakika süre ile, Na 2 CO 3 çözelti içinde kaynatın. Bir spatula ile kaynama ipek dakika her çift karıştırın. Ayrıca de-Gumming adlandırılan bu adım, hidrofil proteinler, sericins ipek fibroin arındırır. (30 dakika) </li><li&gt; elle fibroin sıkın ve kalan sericin ve kimyasallar dışarı yıkamak için distile su ile en az üç kez durulayın. (5 dakika) </li><li> Petri ıslak fibroin yerleştirin ve akış kaput O / N fibroin kurutun. </li><li> Bir sonraki gün kuru fibroin kütle ağırlığında ve bir cam beher içinde fibroin yerleştirin. (15 dakika) </li><li> 4. kuru fibroin kütlesini çarpılarak LiBr 9.3 M LiBr solüsyonu (ml) Gerekli hacmi hesaplamak içinde fibroin eritmek için yavaşça ipek fibroin üzerinde LiBr çözüm dökün ve spatula ile tüm fibroin lifleri batırmayın. Buharlaşmasını önlemek ve fiber çözünmesi için 4 saat süre ile 60 ° C &#39;de yerleştirmek için beher örtün. (15 dakika) </li><li> Şırınga kullanarak, kaptan fibroin çözümü toplamak ve MWCO 3500 diyaliz kasetleri içine yerleştirin. 48 saat süre ile destillenmiş suya karşı diyaliz gerçekleştirin. Suya her iki saatte değiştirin. </li><li> Şırınga kullanılarak, gelen Fibroin çözümü toplamak20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 9000 rpm&#39;de (12700 x g ~), iki kez 50 ml konik tüp ve santrifüj içine kasetleri. Her santrifüj aşamasından sonra yeni bir tüp içine süpernatant dökün ve pelet atın. (40 dakika) </li><li> Kuru ağırlığı tahminine göre fibroin konsantrasyonunu ölçün. Bir tartmak tekne içine ipek solüsyonu 1 ml dökün. 2 saat süre ile 60 ° C &#39;de fırında örnek kurutun. Kuru ipek fibroin tartılır ve 100 ile ipek çözeltisi beklenen konsantrasyon elde edilen ağırlık çarpılarak ipek fibroin çözeltisi konsantrasyonunu hesaplamak 6-9% (a / h). </li><li> Damıtılmış su içinde seyreltilmesi ile (ağırlık / hacim)% 6 ipek konsantrasyonu ayarlayın. Durdurma noktası: Sıvı ipek fibroin kapalı bir kapta en fazla bir ay süreyle 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> Ipek çözeltisinden gözenekli iskelelerinin hazırlanması. <ol><li> Granüller daha sonra aşamalarda kullanılacak 500-600 um büyüklüğünde ayrı zerre NaCI Elek. Granül atıns 500 mikron altında ve 600 mikron üzerinde büyüklükte. (15 dakika) </li><li> Politetrafloroetilen (PTFE) kalıp (Şekil 1) içine 6% ipek çözeltisi 30 ml dökün. Yavaşça ipek üzerine elekten NaCl 60 gr dağılım. Tuz biçimli bir tabakasını elde etmek kabı dokunun. Ipek polimerize etmek için oda sıcaklığında 48 saat inkübe edilir. </li><li> Polimerizasyonu sonlandırmak ve kalan herhangi bir sıvı buharlaştırılması için 1 saat boyunca 60 ° C&#39;de bir fırında iskelesi ihtiva eden PTFE kalıp yerleştirin. </li><li> Tuz süzülecektir 48 st için damıtılmış su 2 L ihtiva eden bir beher içinde PTFE kalıp içerik yerleştirin. Suya günde 2-3 kez değiştirin. . Tuz tamamen noktası durdurma dışarı süzülen zaman kalıplardan sünger iskeleleri kaldırın: süngerler dehidratasyon gelen iskeleleri önlemek için kapalı bir kapta 4 ° C&#39;de suya saklanabilir. </li><li> Hazır olduğunuzda, 5 mm çapında biyopsi yumruk iskeleleri kesip. Yüksekliği yaklaşık 2 mm ulaşmak için iskeleleri Önceden kesilmiş. Pu2 mm çapındaki bir biopsi darbe ucu (Şekil 2A) ile birlikte, skafoldun merkezini NCH. (1 saat) </li><li> . Noktası durdurma (ıslak döngüsü 121 ° C, 20 dakika) ile sterilize edilmeleri için su içine batırılır iskelesi Otoklav: süngerler dehidratasyon iskeleleri önlemek için kapalı bir kapta, 4 ° C sıcaklıkta su içinde daldırılır saklanabilir. </li><li> Planlanan hücre ekim öncesi steril 0.1 mg / ml poli-D-lisin (PDL) çözelti içinde iskeleleri bırakın. 37 ° C &#39;de 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Iskeleleri bağlı olmayan PDL çıkarılması için fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kez yıkanır. (30 dakika) </li></ol></li></ol> Rat Kortikal nöronlar 2. izolasyonu <ol><li> Onaylı hayvan protokolü elde edildikten sonra daha önce Pacifici ve Peruzzi 27 tarafından açıklandığı gibi embriyonik günden itibaren 18 (E18) Sprague-Dawley sıçanları korteks parçalara ayır. (2 saat) </li><li> 3, 20 dakika boyunca (sığır pankreasından)% 0.3 DNase I ile% 0.25 tripsin 5 ml 10 korteksleri inkübe7 ° C. </li><li> 1 mg / ml soya fasulyesi proteinin eşit bir hacminin eklenmesiyle tripsin inaktive. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu oluşturulur kadar pipetleme 10 ml pipet kullanarak Pasteur korteks ve aşağı 20 kez Karışım. Nazik olun ve hava kabarcığı oluşumunu önlemek. (10 dakika) </li><li> 5 dakika boyunca 127 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. </li><li> Yeniden askıya kültür ortamında 10 ml hücre pelletini (Neuro temelli vasat, 1 x B27 takviyesi, 1x Glutamax,% 1 penisilin / streptomisin). Hücreleri saymak. Beklenen hücre konsantrasyonu yaklaşık 2x10 7 / ml&#39;dir. (20 dakika) </li></ol> 3. Meclis ve Kültür Construct <ol><li> Hücrelerle İskele tohumlama. <ol><li> Bir hücre kültürü kaput içinde steril iskeleleri ve gerekli tüm eşyaları taşıyın. Kullanma steril forseps bir 96-yuvalı hücre kültürü plakasında iskeleleri de başına bir iskele tahsis yerleştirin. (10 dakika) </li><li> Bunları önce, tohum hücre dengelenmeye hücre kültür ortamı içinde iskelesi bırakıning. 37 ° C &#39;de 1 saat süreyle inkübe edin. (10 dakika) </li><li> Iskeleler ortamın aşırı aspire. </li><li> Hücre süspansiyonu / iskele 100 ul uygulayın. (10 dakika) </li><li> Iskele hücre bağlanmasına olanak sağlamak için 37 ° de CO / N hücreleri inkübe edin. </li><li> Ertesi sabah olmayan bağlanmış hücreler aspire 200 ul / oyuk taze kültür ortamı uygulanır. (10 dakika) </li></ol></li><li> Kollajen matrisi ile gömme Temel Yapı. (2 saat) <ol><li> Ben buz üzerinde kollajen 10x PBS, su, 1 N NaOH ve sıçan kuyruğu yerleştirin. Üreticinin talimatlarına göre kollajen çalışma çözeltisi hazırlayın. Hücre-numaralı seribaşı yapıları (1 saat kadar) hazır olana kadar buz üzerinde koruyun. </li><li> Inkübatör hücre numaralı seribaşı ipek yapıları çıkarın ve ortamın aşırı aspire. </li><li> Kullanma steril forseps oyuklu bir plaka üzerinde boş oyuklara iskeleleri transferi ve 3 mg / ml kolajen çözeltisi 100 ul her bir iskele bırakın. Geri doku kültürü plakasınıinkübatörde 30 dakika kollajen polimerizasyonunun izin vermek için. </li><li> De / önceden ısıtılmış hücre kültür ortamında 100 ul uygulanır. Kültür bir hafta orta sadece yarısı hacmini değiştirerek her gün orta değiştirmek için yapıları. </li></ol></li></ol> 4. Mikroskopi Analizi <ol><li> Canlı / ölü boyama (1 saat) <ol><li> Propidium iyodür (PI) damıtılmış su içinde 1 mg / ml (1,5 mM) stok çözelti hazırlayın. </li><li> Aseton floresandiasetat (FDA) 2 mg / ml stok çözelti hazırlayın. </li><li> PBS içinde seyreltilmiş 10 uM PI ve 0.15 uM FDA içeren çalışma çözeltisi hazırlayın. Bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;ye kadar çözüm önceden ısıtın. </li><li> Serum esterazlar kaldırmak için önceden ısıtılmış hücrelerin PBS ile yıkayın. PBS aspire. </li><li> 2 dakika için hücreler ile ilgili önceden ısıtılmış çalışma çözeltisi uygulanır ve PBS ile yıkayın. </li><li> FDA eski λ = 490 n; görüntüye epifluorescent mikroskop kullanın hücreleri (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nmm, em λ) 514 nm =. Leke 40 dakika boyunca sabit kalır. Uzun süreli boyama PI hücreleri tarafından alınması ve hücrelerinde PI / FDA eş-lokalizasyonu kaynaklanan spesifik olmayan boyama ile sonuçlanabilir. </li></ol></li><li> Immün <ol><li> Kültür Arzu edilen zaman noktasında oda sıcaklığında 30 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) ile hücrelerin tespit. Nedeniyle PFA toksisitesine sabitleme adımının kimyasal çeker ocak içinde yapılmalıdır dumanı. </li><li> . 3x PBS durdurma noktasına sahip iskeleleri yıkayın: PFA sabit yapılar daha başka aşamalar ile devam etmeden önce, birkaç gün 4 ° C&#39;de PBS içinde saklanabilir. </li><li> 4 ° C &#39;de primer antikor O / N içeren PBS içinde% 0.2 Triton,% 0.25 sığır serum albümini (BSA) iskeleleri inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, boyama çözeltisi atılır ve bağlanmamış birinci antikorları ayıklamak için PBS ile iskeleler 3 x 30 dakika yıkama. </li><li> 2 PBS içinde% 0.2 Triton içinde seyreltilmiş sekonder antikor,% 0.25 BSA ile inkübe edinoda sıcaklığında sa. </li><li> Boyama çözeltisini çıkarın ve Bağlanmamış ikinci antikorları ayıklamak için PBS ile iskeleler 3 x 30 dakika yıkama. </li><li> Görüntü 1 mikron adım numune 100 mikron z-bölümleri alarak 20X amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak iskeleler. Görüntü çözünürlüğü en az 1024 x 1024 piksel olmalıdır ince nevritlerle görselleştirmek için. </li></ol></li><li> RNA, DNA ve protein izolasyonu Not: RNA, DNA ve protein izolasyonu üretici talimatlarına uygun olarak bir ticari AllPrep DNA / RNA / Protein Mini Kit kullanılarak gerçekleştirilir. <ol><li> Kullanımı steril forseps 2 ml steril tüpe kültür plaka dışına iskeleleri aktarın. Tüp başına tek bir iskele yerleştirin. </li><li> Her tüpe RLT tamponu 200 ul ekle. </li><li> Steril microscissors ile parçalamadan tarafından yapı bozar. </li><li> Kesintiye doku homojenize, spin kolona tüpün içeriğini aktarmak. Bir mikrosantrifüj tam hızda 2 dakika süreyle Spin.Bu spin kolon boyunca geçerken lizat homojenize edilir. </li><li> Aracılığıyla akışını toplamak ve RNA, imalatçı protokolü aşağıdaki DNA ve protein izole etmek için hemen kullanabilirsiniz. </li><li> Nükleik asitlerin verim uyumlu herhangi bir yöntem (örneğin, NanoDrop) ölçmek. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak BCA protein deneyi kullanılarak protein verimi ölçmek. Dalga boyu 562 nm mikroplaka okuyucu kullanarak tahlil sonuçlarını ölçün. Not: nükleik asit ve hücre yoğunluğuna göre bir yapı için protein beklenen verim Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. Chapter 1, Public health principles and neurological disorders. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDua%2C+T+%22Neurological+Disorders%22">Neurological Disorders</a>. , World Health Organization. Geneva. (2005).</li>
<li>Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T.+Quantitative+targeted+proteomics+for+understanding+the+blood-brain+barrier%3A+towards+pharmacoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Proteomic%22%5BJournal%5D)">T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics.</a> Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).</li>
<li>Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+energy+demands+of+signaling+and+nonsignaling+components+in+brain+are+conserved+across+mammalian+species+and+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).</li>
<li>Wesseling, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+metabonomic+and+proteomic+approach+identifies+frontal+cortex+changes+in+a+chronic+phencyclidine+rat+model+in+relation+to+human+schizophrenia+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology.</a> Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).</li>
<li>Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+of+axons+in+three-dimensional+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures.</a> Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).</li>
<li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Res. 1158, 103-115 (2007).</li>
<li>East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+of+astrocytes+increases+neuronal+growth+in+three-dimensional+collagen+gels+and+is+maintained+following+plastic+compression+to+form+a+spinal+cord+repair+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).</li>
<li>Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-term+survival+of+in+vitro+engineered+nervous+tissue+derived+from+the+specific+neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Hogberg, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+3D+model+of+human+brain+development+for+studying+gene%2Fenvironment+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions.</a> Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S4(2013).</li>
<li>Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millimeter-sized+neural+building+blocks+for+3D+heterogeneous+neural+network+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly.</a> Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).</li>
<li>Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+three-dimensional+culture+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells+in+collagen+type-1+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Restor+Neurol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel.</a> Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).</li>
<li>Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+formulation+determines+cell+fate+of+fetal+and+adult+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells.</a> Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).</li>
<li>Gurkan, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al..Simple+precision+creation+of+digitally+specified%2C+spatially+heterogeneous%2C+engineered+tissue+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures.</a> Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).</li>
<li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature. 2 (8), 599-605 (2005).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+with+long-distance+axon+tracts+for+determining+functional+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity.</a> J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+functional+brain-like+cortical+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Bioengineered functional brain-like cortical tissue.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).</li>
<li>Rockwood, D. N., Preda, R. C., Yücel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).</li>
<li>Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+film+culture+system+for+in+vitro+analysis+and+biomaterial+design%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design.</a> J. Vis. Exp. (62), e3646(2012).</li>
<li>Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+framework+for+clustering+and+quantitative+analysis+of+white+matter+fiber+tracts%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Image+Anal%22%5BJournal%5D)">A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts.</a> Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).</li>
<li>Vepari, C., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+as+a+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Silk as a biomaterial.</a> Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).</li>
<li>Yao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt-leached+silk+scaffolds+with+tunable+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties.</a> Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).</li>
<li>Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+aqueous-derived+biomaterial+scaffolds+from+silk+fibroin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin.</a> Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).</li>
<li>Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicoidal+multi-lamellar+features+of+RGD-functionalized+silk+biomaterials+for+corneal+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).</li>
<li>Hopkins, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+hydrogels+as+soft+substrates+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering.</a> Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).</li>
<li>Pacifici, M., Peruzzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+embryonic+neural+cells%3A+A+quick+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol.</a> Vis. Exp. (63), e3965(2012).</li>
</ol>

Bu video-makale yayınlanması Corning tarafından desteklenmektedir.

Burada, bölümlere ayrılmış bir 3B beyin benzeri doku modelini bir araya getirmek için yönergeleri açıkladık. Model, morfolojik olarak farklı iki bölmenin gelişmesiyle sonuçlanan yoğun polarize nöron kültürü ile karakterize edilir: biri yoğun şekilde paketlenmiş hücre gövdeleri içerir, ikincisi saf aksonal ağlar içerir. Genel olarak, iskele mimarisi ve büyüme paterni, altı laminer katman ve beyaz cevher yolları21 dahil olmak üzere beyin kortikal dokusunu taklit eder.
Çörek şeklindeki ipek proteini bazlı doku modeli, mekanik özelliklerin, çok yönlü yapısal formların, hidrojel dolgu maddelerinin ve hücresel bileşenlerin değiştirilmesine ve ayarlanmasına olanak tanır. Böylece, bu doku modeli çok çeşitli çalışmalar için bir temel platform oluşturur. İpek, biyouyumluluğu, su bazlı işleme ve sağlam mekanik ve bozunma özellikleri nedeniyle biyomateryal platformları için uygun bir adaydır22. İpek matris ayrıca kültürde zamanla kolajen jel kasılmasını azaltmak için stabil bir çapa görevi görür. Bu modelde kullanılan iskelenin ipek konsantrasyonu ve gözenekliliği gibi özellikler, beyin benzeri doku elastikiyeti18,23,24 ile sonuçlanan optimal hücre büyümesi ve mekanik özellikler elde etmek için önceden ayarlanmıştır. Deneylerin başarılı sonucunu ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için bu parametrelerin sabit tutulmasını öneriyoruz.
3D nöronal ağ oluşumu, farklı mekanik özelliklere sahip iki tip biyomateryalin birleştirilmesiyle elde edildi: nöronal ankraj sağlamak için sert bir iskele ve 3D'de akson penetrasyonuna ve bağlantıya izin vermek için daha yumuşak bir jel matrisi. İpek iskele ve yumuşak hidrojelin seçici malzeme tercihleri, nöronları aksonal bağlantılardan bölümlere ayırmak için temel prensibi sağlar. İpek iskelenin inert doğası nedeniyle, nöronal bağlanma için poli-D-lizin ile işlevselleştirme gereklidir. Bununla birlikte, RGD25 veya fibronektin26 gibi diğer hücre yapışmasını teşvik edici faktörler uygulanabilir. 3 boyutlu ağ oluşumunu sağlamak için ipek iskelenin, nöronlar iskeleye bağlanır bağlanmaz zamanında hidrojel ile doldurulması gerekir. Benzer şekilde, kollajen matris dolgu maddesi diğer hidrojellerle değiştirilebilir, böylece 3D hücre dışı ortamların aksonal ağ oluşumu üzerindeki etkisinin incelenmesine, yeni hidrojelleri nöronal uyumluluk açısından değerlendirmek için bir platform görevi görmesine izin verir. Ek olarak, sıçan kortikal nöronlarının yanı sıra, hipokampal nöronlar veya indüklenmiş pluripotent hücre (iPSc) türevli nöronlar gibi diğer nöronal kaynaklar da kullanılabilir. Ayrıca, doku modeli, nöronlarla birlikte glial hücreleri dahil ederek heteroselüler etkileşimleri incelemek ve daha karmaşık beyin benzeri doku oluşturmak için kullanılabilir.
Daha önce gösterildiği gibi, modelimiz, hücre canlılığı, gen ekspresyonu, LC-MS/MS ve elektrofizyoloji gibi çeşitli tahlillerle 3B mikro ortamda nöronal işlevselliği değerlendirmek için kullanılabilir, böylece model18'in fizyolojik uygunluğunu gösterir. İmmün boyama ve mikroskopi8,9,11 gibi 3D doku mühendisliği yapılarını değerlendirmek için sıklıkla kullanılan diğer yöntemler de hücre dağılımını ve aksonal ağ oluşumunun derecesini değerlendirmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, kollajen matrisinin yüksek yoğunluğu nedeniyle, antikorların penetrasyonunun ve görüntüleme derinliğinin birkaç yüz mikrometre ile sınırlı olduğuna dikkat edilmelidir. Ayrıca, sinyal-gürültü oranı, spesifik olmayan arka plan floresansından etkilenebilir. Bu, lipofilik hücre izleyicileri ve immün boyama ihtiyacını azaltan genetik olarak eksprese edilmiş floresan proteinler kullanılarak aşılabilir11. Alternatif olarak, görüntüleme, sinyal kaybını, foto ağartmayı azaltabilen ve birkaç yüz mikrometre derinliğe kadar genişletilebilen normal tek foton tekniği yerine 2 foton mikroskobu ile gerçekleştirilebilir.
Özetlemek gerekirse, ipek ve kolajen bazlı beyin benzeri doku, nöronal ağları 3 boyutlu olarak incelemek için sağlam bir platform sunuyor ve gelecekte daha gelişmiş nörolojik bozukluk modellerinin geliştirilmesi için bir başlangıç noktası. Değerlendirme modundan bağımsız olarak, bu doku modelinin göreceli basitliği, kullanışlılığını, başarısını ve tekrarlanabilirliğini destekler.

Merkezi sinir sistemi (CNS), yapısal, işlevsel, bulaşıcı veya dejeneratif damar, ilgili muhtelif rahatsızlıkların etkilenebilir. Tahminen 6,8 milyon kişinin 1 dünya çapında büyüyen bir sosyoekonomik yük temsil nörolojik bozukluklar sonucu olarak her yıl ölmektedir. Ancak, hastalıkların sadece birkaç kullanılabilir tedaviler var. Bu nedenle, nörolojik bozukluklar muzdarip hastalar için yeni terapötik stratejiler için ciddi bir ihtiyaç vardır. Ne yazık ki, pek çok CNS hedefli terapötik nedeniyle fizyolojik ilgili işlevsel okumalarla akut ve kronik etkilerinin değerlendirilmesine izin vermez yetersiz klinik öncesi araştırma modelleri, kullanımına kısmen klinik denemeler sırasında başarısız. Geçmiş yıllarda önemli araştırma çabalarına rağmen, CNS yapısı ve fonksiyonu hakkında bilinmeyen büyük bir miktardır. Daha fazla bilgi edinmek için, hayvan modelleri sık sık bize olaned özellikle pre-klinik çalışmalarda, bu tür travmatik beyin hasarı (TBI) veya demans gibi patolojik durumları, model. Bununla birlikte, hayvanlar insan hem de merkezi sinir sisteminin anatomisinde, hem de fonksiyonu, gen ekspresyonu ve metabolizma 2-4&#39;te önemli ölçüde farklıdır. Öte yandan, 2 boyutlu, in vitro kültürler, hücre biyolojisi araştırmak için yaygın yöntem ve rutin olarak ilaç keşfi için kullanılmıştır. Bununla birlikte, 2B hücre kültürleri karmaşıklığı ve insan beyin 5-7 ile karşılaştırıldığında fizyolojik önemi yoksundur. Düşük maliyet ve basitlik 2D hücre kültürü çalışmaları ya da hayvan modellerinde tarafından sağlanan karmaşıklığı için yerini hiçbir şey tutamaz iken, 3D doku mühendisliği vitro ve in vivo yaklaşımları 2D arasında mevcut boşluğu kapatmak için geliştirilmiş araştırma modellerini oluşturabilir. 3D doku mühendisliği 3D hücre-hücre etkileşimleri ve biyomalzeme iskelelerde tarafından sağlanan dışı ipuçları elde daha fizyolojik ilgili deneysel koşullar sağlar. Desp3D kültürlerin değeri arkasında önemli deliller ite, orada bu tür kök hücre türevli organoid kültürler 8-10 gibi birkaç 3D CNS doku modelleri, 11 neurospheroids anda ve hidrojel kültürleri 12,13 dağılmış. Çok katmanlı litografi 14, ve 3 boyutlu baskı 15 dahil olmak üzere gelişmiş teknik yöntemler akciğer, karaciğer ve böbrek dokusunu incelemek için kullanılmaktadır. Ancak, bu tür kortikal mimarisi ve biyoloji taklit olarak bölümlere nöronal büyüme için izin 3D CNS modellerin eksikliği vardır. Nöronal hücre gövdeleri nevritlerin Ayrılmış büyüme önceden akson yolu izleme, kalsiyum akını, ağ mimarisi ve faaliyetlerin çalışma izin mikroüretim 16,17 ile 2D kültürlerde ortaya konmuştur. Bu fikir hücre gövdeleri ve aksonal yolları beynin 18 katmanlı mimarisi taklit farklı bölümlerinde bulunan 3D polarize sinir dokusu geliştirmek için bize ilham </sup&gt;. Yaklaşımımız kapalı bir hacim içindeki hücreleri göz yüksek yoğunluk uygundur ve kolajen jele yoğun aksonal ağ aşırı büyümesini sağlayan benzersiz ipek skafold tasarım kullanımına dayanmaktadır. Burada iskele imalat ve nöronal kültürü gibi beyin gibi doku tam montaj işlemini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223530</td><td></td></tr><tr><td>LiBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>MWCO 3500 diyaliz kasetleri&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>66110</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma plakası</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elek</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>No. 270, No. 35, No. 30</td></tr><tr><td>Evde yapılan PTFE kalıp</td><td></td><td></td><td>(<güçlü>Şekil 1</güçlü>) 10 cm çap, 2 cm yükseklik</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>Biyopsi Punch 5&#160; mm</td><td>Dünya Hassas Alet</td><td>501909</td><td></td></tr><tr><td>Biyopsi Punch 2 & # 160; mm</td><td>Dünya Hassas Alet</td><td>501908</td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>nihai konsantrasyon 10 & # 160; &#956; g / ml, suda çözünmüş</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNaz</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td>son konsantrasyon% 0.3</td></tr> <tr><td>Soya fasulyesi proteini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522-100MG</td><td>nihai konsantrasyon 1 &# 160; mg / ml</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>37&#160'a kadar ısınır; &deg; Kullanmadan önce C</td></tr><tr><td>B27 takviyesi 50x</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen I, sıçan kuyruğu, 100 & # 160; mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>nihai konsantrasyonu 3&# 160; mg / ml</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>aşındırıcı</td></tr><tr><td>Propidyum İyodür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170-10MG</td><td>toksik</td></tr><tr><td>Floresein Diasetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Olympus MVX10</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>toksik, son konsantrasyon %4</td></tr> <tr><td>Sığır Serum</td><td>Albümin Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta; IIITubulin antikoru&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2200</td><td>tavşan 1:500</td></tr><tr><td>anti-tavşan Alexa-546</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11010</td><td>keçi 1:250</td></tr><tr><td>keçi serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>objektif 20X</td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kiti</td><td>Qiagen</td><td>80004</td><td></td></tr><tr><td>Etil alkol, Saf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA protein testi</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Plaka okuyucu Spectramax M2</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>absorbans 562 nm</td></tr><tr><td>Mikro Makas, Ekonomi, Vannas tipi</td><td>TedPella</td><td>1346</td><td></td></tr></tbody></table>

polarize sinir doku engineered 3d İpek-kolajen bazlı modeli

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Beynin anatomisini, bileşimini ve işlevini deşifre etmek için gösterilen büyük çabalara rağmen, insan vücudunun en az anlaşılan organı olmaya devam ediyor. Sinir sistemini daha iyi anlamak için bilim adamları, doku mühendisliği yaklaşımını kullanarak dokuyu temel yapı taşlarından in vitro olarak bir araya getirerek basit bir şekilde yeniden yapılandırmayı amaçlamaktadır. Grubumuz, korteksin beyaz ve gri maddesine benzeyen, doku mühendisliği yapılmış ipek ve kollajen bazlı 3D beyin benzeri bir model geliştirdi. Model, yumuşak kollajen matrisine batırılmış, sıçan beyninden türetilmiş nöronlarla önceden tohumlanmış ipek gözenekli süngerden oluşur. Ayrı aksonal ve hücre gövdesi lokalizasyonu ile polarize nöronal büyüme ve ağ oluşumu gözlenir. Bu bölmeli mimari, doğal nöral dokuyu taklit eden nişlerin benzersiz bir şekilde geliştirilmesine izin verir, böylece nöronal ağ montajı, aksonal rehberlik, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimleri ve elektriksel fonksiyonlar üzerine araştırmalara olanak tanır.

Çörek şekli Katı ipek süngerler hazır kesilmiş sinir dokusu (Şekil 2A) benzeyen bir mimarisi bölümlere ulaşmak için benzersiz ve basit bir fikri temsil etmektedir. Küçük bir hacim içinde tohumlama ve yüksek hücre yoğunluğuna büyümesini sağlayan son derece yüksek bir yüzey alanı içinde yaklaşık 500 um sonuç gözenek boyutlu iskele oldukça gözenekli bir yapı (2x10 7 / ml) (Şekil 2B). Ayrıca, iskelenin yüksek gözeneklilik genişletilmiş zaman dilimlerinde üzerinde yoğun hücre kültürlerinin üstün canlılığı ile sonuçlanan besin ve atıkların sınırsız yayılması için izin verir. Nöronlar tohumlama sonra hızlı bir şekilde ve homojen bir skafold gözenek yüzeyine bağlanır. Hücre bağlanma tamamlandığında ve hücreler, ipek alt-tabaka üzerinde dengelenir sonra, sünger skafold aksonal ağı oluşumu (Şekil 3 için 3 boyutlu bir ortam sağlamak amacıyla yumuşak kolajen matriks ile doldurulur </strong&gt;). Nöronların sadece 2B yüzeyler (Şekil 3B) ile bulunduğu gibi karışık ağlarda elde edilen gözenek yüzeyi üzerinde uzantılar büyüdükçe kollajen matris yokluğunda akson ve hücre gövdeleri bölmelere mümkün değildir. Bunun aksine, kollajen jel nöronal hücre gövdeleri ipek iskele (Şekil 3C) bağlı kalır ise, 3D geniş aksonal dış gelişimini destekleyen bir ağ örgüsü içerir. Bu büyüme paterni hücre gövdeleri ve saf aksonal ağlarda beyinde korteks gri ve beyaz madde benzer (Şekil 3D), compartmentalization yol açar. Ayrı mikroskopisi, konstruktlar deney arkasındaki soruya bağlı olarak, diğer yöntemlerle 18 çeşitli değerlendirilebilir. Örneğin, konstruktların DNA, RNA ve protein izolasyonu kolayca ticari kitler (Şekil 4) kullanılarak gerçekleştirilmiştir olabilir. Nükleik asitler ve protein pe verimir yapı başlangıçta ipek iskelelerinin numaralı seribaşı hücrelerin sayısına bağlıdır. Daha fazla Hücreler DNA, RNA ve protein verimi artar. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig1.jpg" /> Ipek sünger iskele hazırlanmasında kullanılan Şekil 1. PTFE kalıp ölçüleri:.. 10 cm çapında, 2 cm yüksekliğinde <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52970/52970fig2.jpg" /> Şekil 2. 3B beyin gibi doku modeli. (A) Gözenekli ipek sünger iskele. Daha önce kolajen (yeşil-canlı hücreler, kırmızı ölü hücreleri) gömme ipek iskele üzerinde tohumlama üzerine günde 1 nöronların (B) Canlı / ölü boyama. Sağ tarafta Panelleri ma göstermekKırmızı çerçeveli yakalanan alanın gnification. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52970/52970fig3.jpg" /> Şekil 3. nöronal 3D beyin gibi doku modelinde bölümlere akıbet (A) İskele bölmeleri:. Kırmızı hücre gövdesi bölmesi, Mavi-aksonal bölmesi. (B) kollajen katıştırma önce tohumlama üzerine 1 gün de Nöronal büyüme paterni. (C). Hücre gövdesi bölmesinde tohumlama üzerine günde 7 nöronal akıbet. (D) akson bölmeye tohumlama üzerine 7. günde Nöronal sonucudur. Yeşil -. ΒIIITubulin <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig3large.jpg" target="_blank">bu büyük halini görmek için tıklayınız</a>rakam. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52970/52970fig4.jpg" /> (A) RNA ve DNA ve iskele başına seribaşı hücrelerin miktarına bağlı olarak yapı başına (B) protein Şekil 4. Beklenen verim (± SD, n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .</a>

Beynin karmaşık eylemlerine ilişkin içgörü, gelişmiş araştırma araçları gerektirir. Burada, beyin benzeri mimariye benzeyen yeni bir ipek kollajen bazlı 3D mühendislik nöral doku modelini gösteriyoruz. Model, nöronal ağ montajı, aksonal rehberlik, hücre-hücre etkileşimleri ve elektriksel aktiviteyi incelemek için kullanılabilir.

Polarize Sinir Doku Engineered 3D İpek-kolajen bazlı Modeli

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Bu prosedürün genel amacı, 3D beyin benzeri dokuların mühendislik sürecini göstermektir. Bu işlem, öncelikle tuz yıkama tekniği kullanılarak ipek çözeltisinden gözenekli iskelelerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda ise iskeleler önceden donut şeklinde kesilir ve sterilizasyon ile poli-D-lisin veya PDL kaplama yoluyla hücre kültürü için hazırlanır.Ardından, hazırlanan iskelelere taze izole edilmiş primer sıçan kortikal nöronları ekilir. Son adım, iskelelerin kolajen ile gömülmesi ve kültür plaklarına aktarılmasıdır. Nihayetinde, nöral büyümeyi ve nöral ağların gelişimini göstermek için immünofloresan mikroskopi kullanılır.Bu tekniğin etkileri, Parkinson veya Alzheimer için yeni araştırma modelleri geliştirmenin temeli olarak kullanılabileceği için beyni etkileyen hastalıkların tedavisi veya teşhisine kadar uzanmaktadır. Başlamadan önce, metin protokolünde açıklandığı şekilde %6'lık ipek çözeltisini hazırlayın ve dört derece Celsius'ta saklayın. Gözenekli iskeleler hazırlamak için, öncelikle granüler sodyum klorürü eleyin ve çapı 500 ile 600 mikrometre arasındaki granülleri toplayın.İpek çözeltisinin 30 mililitresini politetrafloroetilen veya PTFE kalıba dökün ve ardından üzerine 60 gram elenmiş sodyum klorürü eşit şekilde serpin. İpeğin polimerleşmesi için oda sıcaklığında 48 saat inkübe edin.İpeğin çapraz bağlanmasını tamamlamak ve kalan sıvıyı buharlaştırmak için iskele içeren kalıbı 60 °C'ye ayarlanmış bir fırında bir saat boyunca bekletin. Ardından, kalıp ve iskele kombinasyonunu iki litrelik distile su içeren bir beherin içinde 48 saat boyunca bekletin. Tuzu uzaklaştırmak (leach out) için suyu günde iki ila üç kez değiştirin.İskeleyi kalıptan çıkarın ve küçük parçalara bölün. Önce beş milimetre çapında bir biyopsi punch'ı kullanın. Ardından iskeleyi iki milimetre yüksekliğinde olacak şekilde kesin ve her bir parçanın merkezini iki milimetrelik bir biyopsi punch'ı ile çıkarın.İskeleleri ıslak döngüde 20 dakika boyunca otoklavlayın. Bir hücre kültürü davlumbazı içerisine sterilize edilmiş bir pens, hücre kültürü medyası ve otoklavlanmış iskeleleri yerleştirin. İskeleleri ekmek için paketinden çıkardığınız 96 kuyucuklu bir plakayı içeriye yerleştirin.Öncelikle her kuyucuğa bir adet steril iskele yerleştirin. İskeleleri daldırmak için 96 kuyucuklu plakanın içine hücre kültürü ortamı ekleyin ve dengeye gelmeleri için bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de en az 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, iskelelerdeki fazla ortamı aspire edin.Ardından, iskele başına 100 µL nörobazal besiyeri içerisinde 2 × 10⁶ sıçan kortikal nöronal hücresini ekleyin. Plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve hücrelerin iskeleye tutunmasına izin vermek için gece boyunca bekletin. Ertesi sabah.Yapışmamış hücreleri dikkatlice aspire edin ve yerine 200 µL taze hücre kültür ortamı ekleyin. 37 °C'de kısa bir süre inkübe edin. Ardından, kuyucuklardaki ortamı steril pensler kullanarak aspire edin.Hücre içeren iskeleleri 96 kuyucuklu plakanın boş kuyucuklarına aktarın, ardından her iskeleye 100 µL taze seyreltilmiş, buz gibi soğuk, 3 mg/mL sıçan kuyruk kolajen solüsyonu ekleyin. Kolajenin polimerizasyonu için hücreleri 30 dakika boyunca 37 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin.Plakayı inkübatörden çıkarın ve her kuyucuğa 100 µL önceden ısıtılmış hücre kültürü besiyeri ekleyin. Plakayı istenen hücre büyüme süresi boyunca inkübatöre geri yerleştirin ve bir haftaya kadar her gün her kuyucuktaki besiyerinin yarısını taze besiyeri ile değiştirin.Bu yüksek gözenekli iskelelerde, nöronal hücreler gösterilen yüksek yoğunlukta kültüre edilebilir. İşte hücre canlılığı sonuçları. Ekimden bir gün sonra, floresan diasetat ile işaretlenmiş canlı hücreler yeşil renkte; propidyum iyodür ve ipek iskele ise farklı renklerde görülmektedir.Kırmızı renkte, düşük büyütmede görülen yüksek canlı hücre yüzdesine dikkat edin. Bu şekil, nöronal hücre gövdelerinin ve aksonal süreçlerin donut şeklindeki iskele içindeki kompartmanlaşmasını göstermektedir. Hücre ekimi üzerinden bir gün geçtikten sonra burada görüldüğü üzere nöronal hücre gövdeleri ipek iskeleye tutunmuş durumdadır; hücreler beta three tubulin için immün boyanmıştır ve yeşil görünmektedir.Beklendiği üzere, hücreler kültürün yedinci gününe gelindiğinde iskale yoğun bir şekilde yerleşmiştir. Buna karşılık, iskalenin merkezindeki boşlukta bulunan kolajen matriks, kapsamlı aksonal büyüme için destek sağlamaktadır. Burada aksonal ağ yapısı gösterilmektedir.Ekimden yedi gün sonrası. Bu video, beta three tubulin boyaması ile işaretlenmiş nöral ağ hücrelerini içeren iskelenin merkezi kolajen penceresinin konfokal Z taramasını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, 3B beyin benzeri doku konstrüktlerinin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

engineered-3d-silk-collagen-based-model-of-polarized-neural-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, ipek-kollajen iskeleleri kullanılarak 3D polarize bir nöral doku modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Nöronal hücrelerin gözenekli ipek iskeleler üzerine ekilmesi, hücre bağlanması için kuluçkaya yatırılması, iskelenin kollajen ile gömülmesi sürecini detaylandırıyor ve 3D polarize nöral doku modeli oluşturmada destekleyici kollajen matrisinin önemini vurguluyor.

Polarize nöral dokunun tasarlanmış ipek kollajen bazlı 3D modelinin geliştirilmesi

Kaynak: Struzyna, L. A. et. al., Sinir Sistemi Yeniden Yapılandırması, Modülasyonu ve Modellemesi için Anatomik Olarak İlham Alan Üç Boyutlu Mikro Doku Tasarlanmış Sinir Ağları. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, hücre dışı matris çekirdeğe sahip bir hidrojel mikro sütun kullanılarak mikro doku mühendisliği yapılmış sinir ağlarının gelişimini göstermektedir. Tohumlanmış nöronal agregatlar yapışır, projeksiyonları uzatır ve yapılandırılmış sinir ağları oluşturarak nörogelişim ve nöroterapötik...

Hidrojel Bazlı Bir Mikro Sütun Kullanarak Mikro Doku Mühendisliğine Sahip Bir Sinir Ağı Geliştirme

Bu çalışmada, 3 boyutlu nöronal kültürlerin düzlemsel Mikro-Elektrot Dizilerine (MEA'lar) bağlandığı yeni bir deneysel model presented. 3D ağlar, nöronların üzerinde büyüdüğü ve birbirine bağlı 3B yapılar oluşturduğu cam mikro boncuklardan oluşan bir iskelede nöronların tohumlanmasıyla inşa edilir.

Mikro Elektrot Diziler 3D Engineered Nöronal Kültürler Arayüz: Yenilikçi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deneysel Model

Bu el yazması, mikro-doku ile tasarlanmış sinir ağlarının imalatını ayrıntılarıyla anlatmaktadır: boru biçiminde bir hidrojel içine konan agrega nöronal popülasyon (lar) yı kapsayan uzunlamasına hizalanmış aksonal yollardan oluşan üç boyutlu mikron boyutlu yapılar. Bu canlı iskele, sinirsel devreleri yeniden yapılandırmak veya modüle etmek için fonksiyonel röleler veya gri-beyaz madde nöroanatomisini taklit eden biyofiziksel test yatakları olarak işlev görebilir.

Sinir Sistemi Yeniden Yapılanma, Modülasyon ve Modelleme için Anatomik olarak İlham Almış Üç Boyutlu Mikro-Dokulu Mühendisli Sinir Ağları

Biz kendi kendine montajı, üç boyutlu demetleri boyuna hizalanmış astrositik somata ve süreçlerin bir roman biomaterial encasement içindeki gelişimi vitrin. Bunlar "yaşam iskele santimetre uzunluğunda, genişletme hizmet edebilir henüz test-yatak nörogelişimsel mekanizmaları incelemek veya yönetmenlik nöronal göç ve/veya aksonal neuroregeneration kolaylaştırmak için mikron çaplı çapı sergileyen", mühendislik kılavuz.

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Burada, 3D matrislerde büyüyen akons davranışlarını analiz etmek, doğal gelişimini taklit etmek için bir yöntem sağlıyoruz.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

Bu makale, bir elektrik alanına (EF) maruz kalan lifli iletken malzemelerin sonlu eleman modellerini oluşturmak için bir strateji sunmaktadır. Modeller, bu tür malzemelerde tohumlanan hücrelerin aldığı elektrik girişini tahmin etmek ve iskelenin kurucu malzeme özelliklerini, yapısını veya yönünü değiştirmenin etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.

Hücresel Elektrik Mikroçevriminin Sonlu Eleman Modellemesi

Bu makale, daha önce tarif edilen üç boyutlu kollajen bazlı iskelelerde nöroblastom hücre hatlarını tohumlamak, önceden belirlenmiş bir zaman dilimi için hücre büyümesini sürdürmek ve çeşitli hücre büyümesi ve hücre davranışı analizleri ve aşağı akış uygulamaları için iskeleleri almak için gereken adımları listeler.

Kollajen Bazlı İskeleler Kullanılarak Nöroblastomun Üç Boyutlu İn Vitro Biyomimetik Modeli

Bu çalışma, kendi kendini iyileştiren tavlanabilir parçacık-hücre dışı matris kompozitleri içindeki nöral kök hücrelerin serbest biçimli gömülü 3D baskısı için bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, birbirine bağlı insan sinir dokusu yapılarının yüksek doğrulukla programlanabilir modellenmesini sağlar.

İnsan Nöral Yapılarının Gömülü 3D Baskısı için Mikrojel-Hücre Dışı Matris Kompozit Desteği

Burada, iPSC'den türetilen nöronların ve astrositlerin 3D biyobaskılı kokültürlerini üretmek için bir protokol sunuyoruz. 96 veya 384 oyuklu formatlarda bir hidrojel iskele içinde üretilen bu kokültür modeli, 7 gün içinde yüksek baskı sonrası canlılık ve nörit büyümesi gösterir ve her iki hücre tipi için olgunluk belirteçlerinin ekspresyonunu gösterir.

Tarama Uygulamaları için İnsan iPSC'den Elde Edilen Nöron-Astrosit Kokültürlerinin Üç Boyutlu Biyobaskısı

Keşfedin ipek-kolajen bazlı 3D sinir doku modeli geliştirme yöntemini. Tuz liçingi ile gözenekli iskelet hazırlayıp sıçan kortikal nöronları ekleyerek beyin benzeri yapılar oluşturun.

Polarize Sinir Doku Engineered 3D İpek-kolajen bazlı Modeli

Daha fazla video keşfet