Name: T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Öğrenin, fare hücre modelinde dendritik hücrelerden CD4+ T hücrelerine bakteri transenfeksiyonunu nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, T hücrelerinin bakteri yakalama ve öldürme mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, İspanya Bilim ve Yenilik Bakanlığı'ndan BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC hibeleri ve Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas'tan (CSIC) PIES201020I046 desteklenmiştir.

Not: Deneysel işlemler Universidad Autonoma de Madrid Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanan ve İspanyol ve Avrupa kurallarına uygun olarak Hayvan Refahı ve Sağlık Universidad Autonoma de Madrid Başkanı&#39;nın gözetiminde yapılmıştır. Fareler spesifik patojen free (SPF) konut yetiştirilen ve onlar karbon dioksiti kullanarak eğitimli ve kalifiye personel (CO 2) inhalasyon yöntemi ile ötenazi uygulandı. 1. Fare Kemik DH&#39;ler Farklılaşma ve Enfeksiyon İliği-türevli Not: Şekil 1, bu ilk adımı özetlemektedir. Tüm prosedürler, sadece steril ortam, alet, pipet uçları ve kültür yemekleri kullanarak, bu noktadan kaputu yapılmalıdır. <ol><li> Fare Kemik İliği türetilmiş DH&#39;ler Farklılaşma <ol><li> Bir C57 / BL6 fare 22&#39;den tibia ve femur ayır ve RPMI ortamında 10 ml olan bir plastik çanak içine aktarın. </li&gt; <li> Steril makas, her epifiz kesti ve karakteristik parlak kırmızı renge sahiptir kemik iliği, maruz kalmaktadır. </li><li> Steril bir Petri steril bir şırınga kullanılarak 0.5% sığır serum albümini ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su içinde 10 ml (PBS) (BSA) ve 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (PBS / BSA / EDTA tamponu) kemiğin içine infüze çanak. </li><li> Soğutmalı santrifüj (4 ° C) 600 x g&#39;de bir tüp hücre süspansiyonu ve santrifüj toplayın. </li><li> Amonyum Klorür-Potasyum (ACK) parçalama tamponu (0.15 M NH4CI, 10 mM KHCO 3 ve 0.1 mM EDTA) içinde çözülmüştür, 1 ml hücrelerin tekrar ve kırmızı kan hücrelerinin ortadan kaldırmak için, oda sıcaklığında 30 saniye boyunca inkübe edilir. </li><li> Kümeleri filtreleme ile elimine edilmiştir, çünkü aynı hızda (600 xg) santrifüjlemeden önce kemik parçaları ve hücre kümeleri kaldırmak üzere bir hücre filtresinden (70 um) üzerinden,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile RPMI 1640 ortamının 10 ml ilave edilir ve filtre edin. </li><li> Hücreleri saymak bird RPMI% 10 FBS içeren (50 uM B-merkaptoetanol, 1 mM sodyum piruvat) 5 x 10 5 hücre / ml ayarlayın ve 20 ng / ml birleşik faregiller granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör (rm-GM-CSF) ekleyin nihai bir konsantrasyona kadar. </li><li> Bir CO2 inkübatöründe steril, mikrobiyolojik kalite, 15 cm Petri için, ve kültür Bu süspansiyonu ekleyin (37 ° C,% 5 CO2). </li><li> Her üç gün, 20 ng / ml rm-GM-CSF ihtiva eden taze ortam ile, hücre yoğunluğu 5 x 10 5 hücre / ml&#39;de yıkanarak yapışmayan hücreler ve PBS içinde 5 mM EDTA ile müstakil hücreleri ve tekrar süspansiyon hem de aşağı doğru dönerler. </li></ol></li><li> DH&#39;ler ve Antijen Yükleniyor Olgunlaşma <ol><li> 9. günde en, 20 ng / ml rm-GM-CSF ihtiva eden bir ortam içinde yoğunluğu 5 x 10 5 hücre / ml&#39;de tekrar süspansiyon hücreleri. Daha sonra hücreler, yüksek MHC-II ifadesini sağlayacak ve 24 saat boyunca olmayan bir doku kültürü ile muamele edilmiş, steril 15 cm Petri için inkübe 20 ng / lipopolisakarit (LPS) ilave edin. </li><li> Birinden sonraLPS stimülasyon günü, flow sitometri DC&#39;ler farklılaşmayı kontrol etmek için fare CD11c, MHCII ve Gr-1 karşı antikorlar ile bazı DC hücreleri leke. DC&#39;lerin akış sitometri analizi bir örneği Şekil 3A ve 3B&#39;de gösterilmiştir. <ol><li> Örnek başına 50 ul PBS / BSA / EDTA tampon maddesi içinde nihai konsantrasyon 2.5 mg / ml&#39;de bir anti-fare-CD16 / CD32 monoklonal antikor ile DC&#39;ler (5 x 10 5 hücre / numune) inkübe edin. Daha sonra, MHC II (IA / IE) karşı antikorların 50 ul, CD11c ve 1 farklı florokromlar ile konjuge Gr-1: 100, 1: 200 ve 1: sırası ile, PBS / BSA / EDTA tampon maddesi içinde 500. </li><li> Son olarak, PBS / BSA / EDTA tamponu ile yıkayın ve DC&#39;ler üreticinin protokolüne göre, akış sitometrisi ile analiz edin. Not: Hücreler iyi diferansiye ise, hücreler antijen yükleme için hazırız. </li></ol></li><li> Yıkama RPMI DH&#39;ler,% 10 (antibiyotiksiz), FBS ve 10 ug / ml OTII OVAp (OVA 323-339 ile inkübe; ISQA37 ° C&#39;de en az 1 saat boyunca 5 x 10 6 DH&#39;ler her RMPI% 10 FBS ortamı, 1 ml bir plastik boru üzerine VHAAHAEINEAGR). Bir negatif kontrol olarak, OVAp ile inkübe olmayan DH&#39;ler bırakın. </li></ol></li><li> DH&#39;lerinin Enfeksiyon <ol><li> Bir CO2 kuluçka makinesi içinde 1 saat boyunca 10 bakteri (DC başına 10 bakteriler) enfeksiyon çeşitliliğinde (MOI) enfekte DC&#39;ler (37 ° C,% 5 CO2). </li><li> Yıkama DC hücreleri hücre-dışı bakteriler en yıkamak için RMPI% 10 FBS ve 450 x g&#39;de santrifüje PBS ve 1x 3x. Son olarak, 20 x 10 6 hücre / ml&#39;de (antibiyotiksiz) RMPI% 10 FBS ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li></ol></li></ol> OTII Transgenik fareler ile CD4 + T lenfositlerinin izolasyonu 2. Not: Şekil 1, bu ikinci adımı özetler. Lenf düğümleri, yerine CD4 + T hücreleri izole etmek için dalak kullanılması gereken lenf nodu CD4 + lenfositlerin oranı nedeniyles (~% 50) dalak (~% 25) ve bu nedenle, saflaştırma daha etkili olacağını daha büyüktür. <ol><li> Lenf nodu Tek hücreli Süspansiyon yapın <ol><li> OTII transgenik farelerin 23 düğümleri inguinal, aksiller, brakial, servikal ve mezenterik lenf çıkarın ve RPMI% 10 FBS ortamı 10 ml ile plastik kabına aktarın. </li><li> İki buzlu mikroskop slaytlar kullanılarak steril kaputun altında eziyet lenf nodları. Tek mikroskop lamı buzlu tarafındaki lenf düğümleri yerleştirin ve organlar toprak olmuştur kadar ikinci sürgünün buzlu tarafı ile ovalayın. </li><li> PBS / BSA / EDTA tampon maddesi içinde tek bir hücre süspansiyonu yıkayın. </li><li> Bir hücre süzgecinden (70 mikron) bağ dokusu kaldırmak ve PBS / BSA / EDTA tamponu ile yıkamak için olsa hücreleri Filtre. </li><li> ACK lisiz tamponu 1 ml hücrelerin tekrar ve kırmızı kan hücrelerinin ortadan kaldırmak için, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin. </li></ol></li><li> CD4 + T hücreleri izole edilmesi <ol><li> Adım 2.1.3 ve sayısında tekrar yıkayınHücreler, PBS / BSA / EDTA tampon maddesi içinde 100 x 10 6 hücre / ml&#39;de tekrar süspansiyon onları. 1 de CD8, IgM, B220, CD19, MHC sınıf II (I-Ab), CD11b, CD11c ve DX5 karşı biyotinile antikor ekleyin: 250 30 dakika boyunca buz üzerinde, CD4 + T hücreleri daha sonra negatif seçim için. </li><li> PBS / BSA / EDTA tampon maddesi içinde hücrelerin yıkayın ve buz üzerinde 15 dakika süre ile, üreticinin protokolünde tavsiye edilen konsantrasyon streptavidin mikro-hücreleri ile (100 x 10 6 hücre / ml) inkübe edilir. </li><li> PBS / BSA / EDTA tampon hücreleri yıkayın ve CD4 + T hücre izolasyonu önce bir hücre süzgeç (30 mikron) olsa bunları filtre. </li><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak, bir manyetik hücre ayrıştırma makinesi kullanılarak negatif seçim yoluyla CD4 + T hücreleri izole edin. </li><li> Hücre sayımı ve (antibiyotiksiz) RPMI% 10 FBS ortamı ile 4 x 10 6 hücre / ml olacak şekilde ayarlanır. </li><li> Fix ve akış ile saflık kontrol etmek için buz izole CD4 + T hücrelerinin (3 x 10 5 hücre) devamolarak sitometresi 24 nitelendirdi. CD4 + T hücreleri arıtılmadan bir örneği, Şekil 3C&#39;de gösterilmiştir. </li></ol></li></ol> 3. T Hücre Transinfection ölçüm Gentamisin Koruma Tahlili ile Not: Şekil 2 protokolün bu üçüncü adımı özetler. <ol><li> T hücresi Transinfection <ol><li> Enfekte DC hücreleri (1: 1) ile izole edilmiş CD4 + T hücrelerini inkübe bir CO2 inkübatör (37 ° C immün sinaps oluşumuna imkan vermek üzere, 30 dakika boyunca (DC&#39;ler 1 saat enfekte edilmiş ve yok etmek için yıkanmıştır bakterisiz),% 5 CO2). </li><li> Ekle izole CD4 + T hücreleri (2 x 10 6 hücre) ve 24-çukurlu bir kültür plakasında enfekte DCler (2 x 10 6 hücre) 0.1 ml 0.5 ml. Negatif bir kontrol olarak, 30 dakika boyunca 10 bakteri MOI doğrudan 0,5 mi, CD4 + T hücreleri enfekte etmektedir. </li><li> Kullanarak T hücrelerinden enfekte DH&#39;leri ayıran ek kontroller şunlardırDC-T fiziksel temas engelleyen (gözenek büyüklüğü 3 um) ile bir polikarbonat transwell bariyer. Oyuk (24 çukurlu plaka) alt bölmeye 0,1 transwell içindeki DH&#39;lerin ml ve CD4 + T hücrelerinin 0,5 ml ilave edilir. </li><li> Son olarak, RMPI orta ile tam tüm örneklerde eşit hacimlerde yapmak için her kuyuda 0.6 ml kalmayıncaya kadar. </li><li> Bağışıklık sinaps oluşumu 30 dakika sonra, gentamisin 100 ug / ml ekleyin ve CO2 inkübatöründe hücreleri toplama önce 1 saat boyunca inkübe (37 ° C,% 5 CO2). </li></ol></li><li> Yeniden izolasyon CD4 + T hücrelerinin <ol><li> Yapışmayan hücreleri toplayın ve PBS / BSA / EDTA tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon bunları. DH&#39;lere çoğu plastik kültür plakasına bağlı kalır. Vortex tüpler yavaşça hücre ayrıştırılmasına yönelik çabalara sağlamak. Gentamisin iyi çalışmış olduğunu göstermek için kontrol olarak hücre yüzer 500 ul tutun. </li><li> Adım 2.2 gibi birlikte DH&#39;ler ve T hücrelerini ihtiva örneklerinden CD4 + T hücrelerinin yeniden izole, DH&#39;lerin rağmen çoğu plaka üzerinde takılı olmalıdır. Buz üzerinde kontrol örnekleri tutun. Dikkate% 2&#39;den az kirlenme sadece deneyler alın. Transinfection sonra CD4 + T hücreleri arıtılmadan bir örneği, Şekil 3D&#39;de gösterilmektedir. </li></ol></li><li> Lyse T Hücreleri ve Bakteriler Orta agar Tabaklar üzerinde onları Tohum. <ol><li> PBS ile iki kez, CD4 + T hücreleri yıkanır. </li><li> Hücre sayımı ve PBS içinde 2 x 10 6 hücre / ml&#39;de tekrar süspansiyon onları. </li><li> T hücrelerinin, hücre içi bakteri üzerinden serbest, 1 x 10 6 hücre / ml&#39;de onları parçalamak için T hücrelerinin 500 ul% 0.1 Triton X-100 500 ul ekle. </li><li> Tabii tutulan parçalanmış hücrelerin 3 seri ondalık dilüsyonları yapılır ve bakterilerin orta agar plakaları üzerinde her seyreltme 50 ul tohum. 4 kısma plakaları bölün ve her bölüm içinde lize hücrelerin farklı sulandırmalar tohum. Örnek sonuçlar Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. <ol><li> Bir kontrol olarak, aynı zamanda plakaBu gentamisin sağlamak için agarda konjügatlann saklanan hücre süpernatanı, iyi çalıştı. Ayrıca ek bir kontrol olarak enfekte DC&#39;ler plaka. Durumda, düşük kirlenme DCler (&lt;% 2), düşük DC kirlenme karşılık gelen koloni oluşturan birim (CFU) çıkarma oluşur. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. sayısallaştırılması Akım Sitometrisi T hücre Transinfection arasında Not: Şekil 2 bu adımı özetler. <ol><li> T hücre Transinfection <ol><li> Aşama 1.3 olarak BMDCs Infect, ancak bu durumda GFP ifade eden bakteriler kullanılır. </li><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak 37 ° C&#39;de, 30 dakika için bir hücre izleyici klorometil aminokumarin (CMAC) ile (adım 2.2 lenf düğümleri izole edilmiş) Leke CD4 + T hücreleri ° C. </li><li> Iki kez (antibiyotiksiz) RMPI,% 10 FBS ile etiketlenmiş CD4 + T hücreleri yıkanır. </li><li> Enfekte DC&#39;ler inkübe etiketli CD4 + ile (bakteriler ile 1 saat inkübe edildikten sonra)30 dakika boyunca T hücreleri adım 3.1.1 açıklayan tüm kontrolleri de dahil olmak üzere 37 ºC&#39;de bağışıklık sinaps oluşumunu sağlamak için. </li></ol></li><li> Enfekte CD4 + T hücrelerinin boyanması <ol><li> DC-T bağışıklık sinaps oluşumu 30 dakika sonra, hücrelerin toplanması ve PBS / BSA / EDTA içinde yıkayın. </li><li> PBS / BSA / EDTA tampon hafifçe tüpler vorteks ayrı birleştirilmiş hücrelerin iki kez yıkamadan sonra. </li><li> 0,2 ml / PBS oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 3 PFA ihtiva eden bir tüp içinde örnekleri saptamak. Daha sonra PBS ile yıkayın. </li><li> Dendritik hücrelerin Fc reseptörleri bloke etmek için, buz üzerinde 15 dakika boyunca PBS / BSA / EDTA 50 ul / numune içinde anti-fare-CD16 / CD32 monoklonal antikoru (2,5 ng / ml) ile inkübe edin. </li><li> Hücre dışı bakteriler leke buz üzerinde 30 dakika boyunca 50 ul / PBS / BSA / EDTA Örnek içinde anti-bakteriyel antikoru (nihai konsantrasyon olarak 10 ug / ml) bir tavşan ekleyin. </li><li> PBS / BSA / EDTA ile hücrelerin yıkayıp fikoeritrin (PE) ile konjuge fare CD11c karşı antikor ve bir se inkübetavşan karşı condary antikor 1 Alexa Fluor 647-gibi diğer florokrom ile birleşmiş: buz üzerinde 30 dakika boyunca PBS / BSA / EDTA 200 ul 100 / örnek. </li><li> Hücreleri yıkayın ve flow sitometri örnekleri analiz. Floresan olmayan bakterilere örnekleri telafi ve ayarları 25 sitometri akışını ayarlamak için deneyde kullanılan her florokrom sadece biri ile etiketlenmiş olarak negatif kontrol ve numuneleri kullanılarak transinfected T hücrelerinin bir örnek eklemeyi unutmayın. Örnek analizi, Şekil 5 &#39;de gösterilmiştir. Not: Bakteri GFP ifade yoksa, 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 Triton X-100 ile numune, hücre içi ve hücre dışı bakteriler, etiket hücre dışı bakteriler ayırt düzeltme ve nüfuz edilebilir kılınması için. Daha sonra farklı bir florokromla toplam bakteri (hücre içi + dışı) leke. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+microorganisms+and+activation+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of microorganisms and activation of the immune response.</a> Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).</li>
<li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+biology+of+the+cell%22">Molecular biology of the cell</a>. , Garland Science. New York. (1989).</li>
<li>Pancer, Z., Cooper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The evolution of adaptive immunity.</a> Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).</li>
<li>Rhoades, R. A., Bell, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRhoades%2C+RA+%22Medical+Phisiology%22">Medical Phisiology</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).</li>
<li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Invasion%3A+The+Paradigms+of+Enteroinvasive+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens.</a> Science. 304 (5668), 242-248 (2004).</li>
<li>Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+and+recognition+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation and recognition in bacterial infections.</a> Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Adhesion+and+Entry+into+Host+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells.</a> Cell. 124 (4), 715-727 (2006).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).</li>
<li>Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+clathrin+drives+actin+accumulation+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse.</a> Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).</li>
<li>Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+bone+marrow-derived+dendritic+cells+and+macrophages+to+productive+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes.</a> Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).</li>
<li>Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN%2C+a+dendritic+cell-specific+HIV-1-binding+protein+that+enhances+trans-infection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells.</a> Cell. 100 (5), 587-597 (2000).</li>
<li>Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+mature+dendritic+cells%3A+Trojan+exosomes+riding+the+Trojan+horse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse.</a> PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740(2010).</li>
<li>Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+communication%3A+diverse+structures+for+exchange+of+genetic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information.</a> Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).</li>
<li>McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+serve+as+a+reservoir+for+Listeria+monocytogenes+growth+during+infection+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice.</a> Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).</li>
<li>Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+impairs+T+lymphocyte+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).</li>
<li>Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+kill+bacteria+captured+by+transinfection+from+dendritic+cells+and+confer+protection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice.</a> Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).</li>
<li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).</li>
<li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bone+marrow+derived+murine+dendritic+cells+for+use+in+2-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).</li>
<li>Inaba, K., Inaba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-isolation+of+Salmonella-infected+cells+with+defined+bacterial+load+from+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).</li>
<li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).</li>
<li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+X+%22Current+protocols+in+immunology%22">Current protocols in immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1(2008).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+th17+differentiation+of+na%C3%AFve+CD4+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765(2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li>
<li>Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+operation+of+a+flow+cytometric+immunophenotyping+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+diagnostic+pathology%22%5BJournal%5D)">Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory.</a> Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).</li>
<li>Itano, A. A., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+to+naive+CD4+T+cells+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node.</a> Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

T hücreleri veya T lenfositleri adaptif bağışıklık yanıtı 26 hücre-aracılı bağışıklığın bir rol oynayabilir ve ait lökosit türüdür. T hücreleri in vitro enfekte olma dirençli ama bazı raporlar, in vivo 14,15 enfekte olabilir göstermektedir. Bağışıklık sinaps sırasında APC ve T hücrelerinin samimi kişiler HIV gibi bazı virüsler 11 de dahil olmak üzere biyolojik madde 13, alışverişi için platformlar olarak hizmet vermektedir. Son zamanlarda dogma, T hü...

Bir patojen konukçu bulaştığında, genellikle bakteriyel temizlenmesi için gerekli olan doğal ve kazanılmış bağışıklık tepkilerinin, bir aktivasyon vardır. Doğuştan gelen bağışıklık çoğu enfeksiyonları önler ilk savunma hattıdır. Doğuştan gelen bağışıklık mikroorganizma ana gruba arasında korunan bir hassas bir şekilde elemanları (patojenle ilişkili molekül örnekleri, PAMPS) 1 ayırt. Doğuştan gelen bağışıklık mekanizmaları fagositler (makrofajlar, nötrofiller ve dendritik hücreler), mast hücreleri, eozinofiller, bazofiller ve doğal öldürücü hücreleri içerir, fiziksel deri gibi engelleri, kimyasal bariyerler (antimikrobiyal peptitler, lizozim) ile doğuştan gelen lökositler arasında, 2. Bu hücreler temas yoluyla veya patojenin içine çeken ve öldürme içeren fagositoz yoluyla onlara saldırarak ya tanımlamak ve patojenleri ortadan kaldırır. Bu sistem, p karşı bağışıklık belleğini kazandıran adaptif bağışıklık aksine, yaşam boyu savunma izin vermezathogens. Adaptif bağışıklık sistemi savunma İkinci satır ve tanımak ve birden mikrobik olmayan mikrobiyal maddelerin 3 spesifik antijenlere tepki yapabiliyor. Adaptif immün sisteminin ana bileşenleri B ve T hücrelerini içerir lenfositlerdir. B hücreleri, patojenler veya dışsal proteinlere karşı antikorlar salgılayan, hümoral yanıt olarak dahil edilmektedir. Bununla birlikte, T hücreleri sitokin sekresyon veya öldürme patojen ile enfekte olmuş hücrelerde 4 bağışıklık tepkisini modüle hücre aracılı bağışıklık temsil etmektedir. Büyük histo uyumlu kompleks (MHC) 5-7 hücre yüzeyinde sunulur antijenler içine fagosite ederler patojenler ve işlem bakteriyel bileşenler tanıyabilir dendritik hücreler ya da makrofajlar, doğal bağışıklık sisteminin bir parçası, aşağıdakileri içeren Antijen sağlayan hücreler (APC &#39;ler). APC &#39;ler patojenleri fagosite sonra, bunlar genellikle T etkileşime boşaltma lenf düğümlerine göçHücreler. T lenfositleri, T hücre reseptörleri tarafından spesifik peptit-MHC kompleksleri tanıyabilir. Bağışıklık sinaps (IS) antijen sunumu 8,9 sırasında antijen yüklü APC ve lenfosit arasındaki ara yüzeyde oluşur. Bazı bakteriler fagositozu hayatta ve APC &#39;içinde sistematik olarak yaymak olabilir. Bu görüşe göre, enfekte ZPT bakteriyel rezervuar veya bakteriyel yayılmasını kolaylaştıran 10 &quot;Truva atları&quot; olarak hizmet vermektedir. APC &#39;ve BS oluşumu sırasında gerçekleşecek lenfositler arasındaki yakın temas, aynı zamanda membranların, genetik materyalin ve eksozom parçası alışverişi için bir platform olarak işlev ve T hücreleri enfekte bazı virüsler için kaçırdılar olabilir; bu işlem 11-13 transinfection olarak adlandırılır. Bazı patojen bakterilerin (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica ve Shigella flexneri) in vivo T lenfositleri istila ve davranışlarını 14-16 değiştirmek edebiliyoruz. SahibizSon zamanlarda T lenfositleri de antijen sunumu 16 sırasında önceden enfekte dendritik hücreler (DC) dan transinfection bakterilerin yakalamak mümkün olduğunu anlattı. T hücresi doğrudan enfeksiyonlara daha (1,000-4,000x) derece daha etkili transinfection bakteri yakalama. Transinfection daha gösteren T hücreleri yakalama patojen olmayan patojen bakteriler T hücreleri tarafından tahrik edilen bir işlemdir. Çarpıcı, hücreler hızla yakalanan bakterileri öldüren ve profesyonel fagositler 16 daha çok fazla verimli yaptım T (TİT) transinfected. Immünoloji bir dogmayı kırmak Bu sonuçlar, adaptif bağışıklık hücreleri doğuştan gelen bağışıklık sözde münhasır olan işlevleri yerine göstermektedir. Buna ek olarak, meme ucu hücreleri pro-enflamatuar sitokinlerin büyük miktarlarda salgılarlar ve in vivo bakteriyel enfeksiyonlara karşı koruma gösterdi. Burada bakteriyel transinfection sürecini incelemek için kullanılan farklı protokoller sunmakFare modeli. Bu model, bakteri bulaşmış kemik ile spesifik olarak etkileşime I-Ab 17 bağlamında OVA (OVAp) peptit 323-339 için TCR spesifik taşıyan transgenik farelerin OTII, CD4 + T hücrelerinin kullanımına dayanmaktadır iliği stabil bağışıklık sinaps meydana OVAp yüklü DH&#39;ler türetilmiş (BMDCs) 18,19. T hücre transinfection görüntülendi ve floresan mikroskobu kullanarak izlenebilir. Buna ek olarak, akış sitometrisi, yeşil floresan proteini (GFP) 16,20 ifade bakteriler tarafından yayılan floresan yararlanarak tarafından enfekte edilen hücreleri tespit edilmesi için de kullanılabilir. Ayrıca, T hücresi transinfection daha hassas bir yaklaşım, etkinlikleri sayıda ölçümünü sağlar gentamisin sağkalım analizi ile tayin edilebilir. Gentamisin ökaryotik hücreleri içine giremeyeceği bir antibiyotiktir. Bu nedenle, bu antibiyotiği kullanarak antibiyotik ilave fr hayatta hücre içi bakteri farklılaşmasını veriyor21 öldürüldüğü om dışı olanlar.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>r-GMCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>SIGMA</td><td>L2630-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Na Piruvat</td><td>Termo Bilimsel</td><td>SH3023901</td><td></td></tr><tr><td>2-ME</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>OVAp OTII (323&ndash; 339)</td><td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci 70uM</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 30 uM Şırınga Filcons Steril</td><td>BD</td><td>340598</td><td></td></tr><tr><td>AutoMacs Classic</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-088-887</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Normon</td><td>624601.6</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Costar</td><td>3415</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Pronadisa</td><td>1231</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Pronadisa</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit% 16</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>IgM Biot</td><td>ImmunoStep</td><td>Klonu RMM-1</td><td></td></tr><tr><td>B220 Biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td></td></tr><tr><td>CD19 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553784</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II Biot (I-A/IE)BD</td><td> Biyolojik bilimler</td><td>553622</td><td></td></tr><tr><td>CD11b biot</td><td>Immunostep</td><td>11BB-01mg</td><td></td></tr><tr><td>CD11c biot</td><td>Immunostep</td><td>11CB3-01mg</td><td></td></tr><tr><td>DX5 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553856</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td></td></tr><tr><td>CD16 / CD32</td><td>ImmunoStep</td><td>M16PU-05MG</td><td></td></tr><tr><td>anti Salmonella</td><td>ABD Serotec</td><td>8209-4006</td><td></td></tr><tr><td>CD11cPE</td><td>BD Biyolojik</td><td>Bilimler 553802</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Tonbo Biyolojik Bilimler</td><td>20-0041-U100</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 APC</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>553129</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II (I-A / IE) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553623</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647 Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) Antikor, yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td></td></tr><tr><td>CMAC (7-amino-4-klorometilkumarin)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Mikro Boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

t hücreleri dendritik hücreler gelen transinfection tarafından bakteriler yakalama

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Son zamanlarda, tarif edilenin aksine, adaptif bağışıklık hücrelerinin paradigması olan CD4+ T hücrelerinin, enfekte dendritik hücrelerden (DC'ler) bakterileri transenfeksiyon adı verilen bir süreçle yakaladığını gösterdik. Burada, antijen sunumu sırasında meydana gelen transenfeksiyon sürecinin analizini açıklıyoruz. Bu işlem, bir ovoalbümin peptidi (OVAp) için spesifik bir T hücresi reseptörü (TCR) taşıyan transgenik OTII farelerinden alınan CD4+ T hücreleri kullanılarak ortaya çıkarıldı, bu nedenle bu spesifik OVAp ile yüklenmiş enfekte dendritik hücrelerle stabil bağışıklık kompleksleri oluşturabilir. DC-T hücre iletimi sırasında yeşil floresan protein (GFP) eksprese eden bakterilerin dinamikleri, canlı hücre görüntüleme ile izlenebilir ve bakteriyel transenfeksiyonun nicelleştirilmesi akış sitometrisi ile gerçekleştirilebilir. Ek olarak, transenfeksiyon, hücre içi bakterileri öldüren, ancak hücre içi bakterileri öldüren, geçirgen olmayan bir aminoglikozit antibiyotik olan gentamisin kullanımına dayanan daha hassas bir yöntemle ölçülebilir. Bu klasik yöntem daha önce mikrobiyolojide bakteriyel enfeksiyonların etkinliğini incelemek için kullanılmıştır. Burada, birincil hücrelerin izolasyonundan transenfeksiyonun nicelleştirilmesine kadar tüm sürecin protokolünü açıklıyoruz.

Akış sitometri ve gentamisin yaşam tahlil Şekil 1 hücreleri elde etmek prosedürü özetler:. Bu yazıda enfekte kemik iliği kaynaklı-DH&#39;ler ve nasıl iki farklı yaklaşım yoluyla bakteri transinfection ölçmek için fare T hücre bakteriyel transinfection nasıl gerçekleştirileceği açıklanan. DCler, 9 gün boyunca GM-CSF ile kemik iliği hücrelerinin inkübe etmek suretiyle oluşturulur. Daha sonra DCler, OVA (OVAp) belirli bir peptid ile daha sonra bunları yüklemek için kendi za...

Burada bir protokol, önceden enfekte edilmiş dendritik hücreler (DC) transinfection ile antijen sunumu sırasında ortaya çıkan, CD4 + T hücreleri tarafından bakteriyel yakalama ölçmek için sunulmuştur. Birincil hücreler, DC, DC / T hücre konjuge oluşumu enfeksiyon ve bakteri T hücre transfeksiyon ölçüm izolasyon: Biz gerekli adımları gerçekleştirmek için nasıl gösterir.

T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Bu prosedürün genel amacı, bir fare hücre modeli kullanarak bakteriyel CD4+T hücresi transenfeksiyonunu nicelendirmektir. İn vivo koşullarda, Listeria monocytogenes ve Salmonella enteritidis gibi bazı patojenik bakteriler T lenfositlerini enfekte edebilmekte ve davranışlarını değiştirebilmektedir. Ancak, in vitro koşullarda T hücrelerini enfekte etmek kolay değildir.Bu gözleme dayanarak, viral enfeksiyonlarda olduğu gibi, T hücrelerinin antijen sunumu sırasında enfekte dendritik hücrelerden bakterileri yakalayıp yakalayamayacağını araştırdık. T hücrelerinin bakterileri yakaladığını ve ardından onları öldürdüğünü bulduk. Aslında, T hücrelerinin bunu profesyonel fagositlerden daha verimli bir şekilde yaptığını tespit ettik.Bu sonuçlar, adaptif bağışıklık hücrelerinin, doğuştan gelen bağışıklığa özgü olduğu varsayılan fonksiyonları yerine getirebileceğini göstererek immünolojinin temel bir ilkesiyle çelişmektedir. Bugün, bir fare modelinde bakteri transenfeksiyon sürecini incelemek için kullanılan protokolü sunuyoruz. Esteban Veiga ve ben; iki lisansüstü öğrenci olan Guillermo Ramirez-Santiago ve Raquelle Garcia-Ferreras ile teknisyen Monica Torres-Torresano ile birlikte bu prosedürü uygulamalı olarak göstereceğiz.Bu videoda açıklanan tüm prosedürlerin, yalnızca steril besiyeri, aletler, pipet uçları ve kültür kapları kullanılarak çeker ocak altında gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın. Doku kültürü işlemi uygulanmamış steril 15 santimetrelik bir Petri kabına, tek bir fareden elde edilen kemik iliği türevli dendritik hücrelerin üzerine bir miligram/mililitre lipopolisakkaritten bir mikrolitre ekleyin. Majör histokompatibilite kompleksi II veya MHC II ekspresyonunu artırmak için hücreleri 24 saat inkübe edin.İnkübasyonun ardından, MHC II ekspresyonunu ve diferansiyasyonu doğrulamak için akış sitometrisi gerçekleştirin. Burada gösterildiği gibi, MHC II ekspresyonu doğrulandıktan sonra hücreleri steril 50 mililitre polipropilen tüpe aktarın. Beş milimolar EDTA içeren 10 mililitre PBS ekleyin ve ardından hücreleri 600 x g'de santrifüjleyin.Santrifüj işlemi tamamlandığında, hücreleri %10 FBS içeren RPMI içerisinde yeniden süspande ederek ve ardından tekrar santrifüj ederek yıkama işlemini gerçekleştirin. Yıkama işleminden sonra, her 5 × 10⁶ dendritik hücre için bir mililitre %10 FBS'li RPMI ekleyin ve hücreleri yeniden süspande etmek için pipetle yukarı-aşağı çekme işlemi yapın. Ardından, yeniden süspande edilen dendritik hücreleri eşit hacimlerde iki tüpe ayırın.Bir tüpe, mililitre başına 10 mikrogram OT-II OVAp ekleyin. Diğer tübü işlem görmemiş halde bırakın. Bu tüp, antijen yüklemesi için negatif kontrol görevi görecektir.Dendritik hücrelerin MHC II moleküllerini OVA peptidi ile yüklemek için tüpleri en az bir saat inkübe edin. Bu sırada, Salmonella enteritidis hücrelerini üç kez PBS çözeltisi ile yıkayarak enfeksiyon için hazırlayın. LB besiyerini ve salgılanan toksinleri uzaklaştırmak için her yıkama arasında 1800 x g hızında santrifüj yapın.Ardından, bakterileri RPMI içinde yeniden süspande edin. İnkübasyonun ardından, her bir dendritik hücre tüpünü 10'luk bir enfeksiyon çokluğu, veya MOI, ile enfekte edin ve ardından hücreleri bir saat boyunca inkübe edin. Hücreler enfekte edildikten sonra, onları üç kez PBS ile ve ardından bir kez %10 FBS'li RPMI ile yıkayın.Çözünür OVAp içindeki hücre dışı bakterilerin çoğunu uzaklaştırmak için yıkamalar arasında 450 x g'de santrifüjleyin. Son santrifüjden sonra, hücreleri %10 FBS içeren RPMI içinde mililitre başına 20 x 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspande edin. 24 kuyucuklu bir kültür plakasına, beş kuyucuğun her birine 0,5 mililitre hacimde iki milyon CD4+T hücresi ekleyin.Ardından, fiziksel teması kontrol etmek için, üç mikrometre gözenek boyutuna sahip polikarbonat trans-well bariyerlerini üçüncü ve dördüncü kuyucuklara yerleştirin. Birinci kuyucuğa, 0.1 mililitre enfekte overloaded dendritik hücre ekleyin. İkinci kuyucuğa, 0.1 mililitre enfekte non-loaded dendritik hücre ekleyin.Enfekte edilmiş aşırı yüklü dendritik hücrelerin 0,1 mililitresini bir kuyuya, enfekte edilmiş yüklü olmayan dendritik hücrelerin 0,1 mililitresini ise diğer kuyuya ekleyin. Son olarak, negatif kontrol olarak, beşinci kuyudaki CD4+T hücrelerini doğrudan 10 MOI ile enfekte edin. Ardından, kuyudaki toplam hacmi RPMI ile 0,6 mililitreye tamamlayın.İmmün sinapsların oluşması için plakayı 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her bir kuyucuğa ortamın mililitresi başına 100 micrograms Gentamicin ekleyin ve bir saat boyunca inkübe edin. Gentamicin, ökaryotik hücrelere nüfuz edemeyen bir aminoglikozid antibiyotiğidir.Bu nedenle, bu adımda aminoglikozid hücre dışı bakterileri öldürecek ancak hücre içi bakterileri öldürmeyecektir. İnkübasyonun ardından, yapışmayan hücreleri 15 mililitrelik tüplere toplayın ve 10 mililitre PBS BSA EDTA tamponunda yeniden süspanse edin. Dendritik hücrelerin çoğunun yapışık kaldığı plastik kültür plağını atın.Ardından, hücrelerin ayrışmasını sağlamak için tüpleri hafifçe vorteksleyin. Tüpleri 600 x g'de santrifüjleyin. Daha sonra, herhangi bir tüpten 500 microliters hücre süpernatantı aspire edin ve yeni bir tüpe pipetleyin.Bu, Gentamisin uygulamasının etkili olduğunu göstermek için kontrol olarak kullanılacaktır. Tüm örnekleri buz üzerine yerleştirin. Bu aşamada altı tüp bulunmaktadır: dört tüp test örneği ve iki kontrol.Dendritik hücrelerin çoğu plaka ile birlikte uzaklaştırılmış olsa da, trans-well bariyerleri tarafından ayrıştırılmayan örnekler hâlâ bazı hücreler içerebilir. Kontaminasyonu azaltmak için, trans-well bariyerleri ile ayrıştırılmayan örneklerdeki CD4+T hücrelerini yeniden izole etmek amacıyla manyetik hücre izolasyonu veya hücre ayıklama kullanın. Nihai izolat, %2'den daha az dendritik hücre içermelidir.Numunelerin geri kalanını buz üzerinde tutun. CD4+T hücreleri saflaştırıldıktan sonra, bakteri sınıfı enfeksiyonu için saklama aşamasına geçilir. Bu işlem, koloni sayımı yapılarak veya akış sitometrisi ile gerçekleştirilebilir.Burada, koloni sayımının nasıl yapılacağını göstereceğiz. Transenfekte CD4+T hücrelerini iki kez PBS ile yıkayın. Yıkama işlemleri arasında 600 x g hızında santrifüjleyin.Ardından hücreleri sayın ve 2 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonda PBS içinde yeniden süspande edin. 500 µL T hücresine, hücreleri lizlemek için 500 µL %0,1 Triton X-100 ekleyin. Bu işlem, hücre içi bakterileri T hücrelerinden serbest bırakır.Lizelenmiş hücrelerin her bir örneği için üç seri dilüsyon hazırlayın. Ardından, bir LB agar plağını dört çeyreğe bölün ve seyreltilmemiş süspansiyon da dahil olmak üzere her bir dilüsyondan 50 µL'yi plağın her bir bölümüne yayın. Ayrı bir LB agar plağına, Gentamicin etkinliği için kontrol olarak saklanan hücre süpernatantını yayın.Ardından, başka bir plak üzerine, ek kontrol olarak doğrudan enfekte edilmiş T hücrelerini yayın. Gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, plağın her bir bölümündeki kolonileri sayın ve her bir örnek için koloni oluşturucu birim sayısını hesaplayın.Düşük düzeyli dendritik hücre kontaminasyonu ( %2'den az olarak tanımlanır) meydana gelirse, düşük dendritik hücre kontaminasyonuna karşılık gelen koloni oluşturucu birimleri çıkarın. T hücresi transenfeksiyonu Salmonella enteritidis kullanılarak gerçekleştirildi ve bu videoda açıklandığı üzere Gentamisin sağkalım testi ile nicelendirildi. Solda gösterildiği gibi, doğrudan enfekte edilen T hücreleri plaklandığında koloni büyümesi gözlemlenmedi; bu durum, T hücrelerinin doğrudan bakteriyel enfeksiyonlara karşı refrakter olduğunu göstermektedir.Sağda gösterildiği gibi, transenfeksiyon deneylerinden elde edilen süpernatan ekildiğinde koloni gözlemlenmemiştir; bu durum Gentamicin'in düzgün çalıştığını göstermektedir. Trans-well bariyerleri varlığında gerçekleştirilen transenfeksiyon deneylerinin sonuçları burada gösterilmiştir. Hem OVA yüklü hem de yüklenmemiş örneklerin seyreltilmemiş süspansiyonlarında yalnızca üç koloni gözlemlenmiştir.Buna karşılık, T hücrelerinin enfekte dendritik hücrelerle doğrudan teması olduğunda çok sayıda koloni görülür. Ayrıca, OVAp yüklü dendritik hücreler T hücreleri ile inkübe edildiğinde, bakteri alımı yaklaşık beş kat artmıştır. Hep birlikte, bu veriler, enfekte dendritik hücrelerin T hücreleri ile doğrudan temasının bakteriyel alımı kolaylaştırdığını ve hücreler arası transenfeksiyonun antijen tanıma sırasında arttığını göstermektedir.Bu videodan sonra, deniz T hücreleri kullanılarak transenfeksiyonun nasıl nicelleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Gentamisin sağkalımı ile transenfeksiyonu nicelleştirmenin avantajı, yüksek hassasiyetidir. Tek bir enfekte bakteriyi bile tespit edebilmekteyiz.Bu prosedürün saflaştırma adımının kritik olduğunu unutmamak önemlidir. Koloni sayımları transenfeksiyon oranını belirlemek için kullanılacaksa saflık derecesi çok yüksek olmalıdır. Akış sitometrisi ile yapılan nicelleştirmede bu kısıtlama yoktur, çünkü dendritik hücreleri ve T hücrelerini kolayca ayırt edebilirsiniz; ancak buradaki kısıtlama, GFP eksprese eden bakterilerin, enfekte hücreleri dış floresan arka plana karşı tespit edebilecek kadar parlak olması gerekliliğidir.Patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmayın.

t-cells-capture-bacteria-by-transinfection-from-dendritic-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Kaynak: Cruz-Adalia, A., ve diğerleri. T Hücreleri, Dendritik Hücrelerden Transenfeksiyon Yoluyla Bakterileri Yakalar. J. Vis. Uzm. (2016).Bu video, antijene özgü T hücresi-dendritik hücre etkileşimleri yoluyla bakteriyel transenfeksiyonu göstermektedir. Ovalbümin peptidi sunan bakteri ile enfekte dendritik hücreler, doğrudan veya bir zarla ayrılmış T hücreleri ile inkübe edilir. Doğrudan temas, immünolojik sinaps oluşumuna izin vererek bakteri transferini sağlarken, zar etkileşimi engeller.

İmmünolojik Sinaps Oluşumu Yoluyla T Hücrelerinin İn Vitro Bakteriyel Transenfeksiyonu

Bu videoda, immünomodülatör bir farmakolojik ajan kullanarak dendritik hücreleri (DC'ler) tolerojenik DC'lere (TolDC'ler) dönüştürme yöntemi gösterilmektedir. Bu dönüşüm, CD4 + T hücreleri üzerindeki immünosüpresif etkileri yoluyla TolDC fonksiyonunun değerlendirilmesiyle doğrulanır.

İmmünomodülatör Farmakolojik Bir Ajanın Dendritik Hücreler ve CD4+ T Hücreleri Arasındaki Etkileşim Üzerine Etkisi

Burada, retroviral transdüksiyon ve tetrasiklin yokluğunda bir lentiviral vektör (IV) bileşenleri ifade edebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için concatemeric transfeksiyon kullanın. Bu AG GFP kodlar ve dendritik hücreler üzerinde reseptörü için spesifik olan bir glikoprotein, SVGmu ile pseudotyped edilir.

Bir Tetrasiklin düzenlenmiş Hücre Hattı Özellikle dendritik hücreler Hedef Yüksek titre Lentiviral vektörler üretir

Hücre içermeyen HİV-1 parçacıklarına farklı olarak, enfekte olmuş CD4 + T hücrelerinin etkili bir plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) ile algılanır. Bu yazıda tip I IFN serbest bırakılması ile değerlendirilen periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ya da izole edilmiş bir PDC pDC'lerde ile doğuştan gelen algılamayı değerlendirmek için, HIV-1 ile enfekte edilmiş T hücreleri ile birlikte-kültür, bir yöntem tarif eder.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

Burada, basit bir manuel protein çökeltme adımı ve çevrimiçi kolon ekstraksiyonu kullanarak kurutulmuş kan lekelerinde immünosupresan takrolimusun miktarını belirlemek için yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (HPLC-MS/MS) testini açıklıyoruz.

LC-MS / MS kullanarak Kurutulmuş Kan Spotlar Immünosupresan Tacrolimus Niceleme

Bu protokolde bağırsak mikrobiyota antijenine özgü T hücreli benimseyen transfer kolit modeli tanımlanmıştır. CD4+ T hücreleri CBir1 TCR transgenik farelerden izole edilmiştir. Bunlar, alıcı Rag1/- farelere aktarılan ve bağırsak iltihabına yol açan immünodominant bağırsak mikrobiyota antijeni CBir1 flagellin için özeldir.

CBir1 TCR Transgenik CD4+ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

Farmakolojik ajanların naif monosit türevli dendritik hücrelerden in vitro olarak tolerojenik dendritik hücreler üretme kapasitesini değerlendirmek ve otolog düzenleyici T hücresi üretimi ile potansiyellerini doğrulamak için bir prosedür tanımladık.

İnsan CD14+ Monositlerinden Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi için İmmünomodülatör Ajanları Test Etmek İçin Basit ve Etkili Bir Yöntem

Bu protokol, fare kanseri hücrelerinin, transkripsiyon faktörleri PU.1, IRF8 ve BATF3'ün zorunlu ekspresyonu yoluyla tümör mikroçevresi içinde tip 1 dendritik benzeri hücrelere in vivo olarak yeniden programlanmasını tanımlar.

Tümör Hücrelerinin Tip 1 Konvansiyonel Dendritik Hücre Benzeri Hücrelere İzlenebilir İn Vivo Yeniden Programlanması

Bu makale bakteriyofaj lambda, enfeksiyon bir floresan etiketli versiyonu hazırlamak için prosedürü...

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

Öğrenin, fare hücre modelinde dendritik hücrelerden CD4+ T hücrelerine bakteri transenfeksiyonunu nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, T hücrelerinin bakteri yakalama ve öldürme mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama

Daha fazla video keşfet