Name: Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Öğrenin, fare ilköğretim hepatositlerinde yağ asidi oksidasyonu ve lipogenezin radyoaktif substratlarla nasıl ölçüldüğünü. Bu yöntem metabolizma bozukluklarının tedavisine katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Susan Gray ve Umadevi Chalasani'ye hepatosit izolasyon protokolünün teknik yönleriyle ilgili yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIDDK hibesi 5R01DK089185 (M.P. Cooper'a) ve UMMS'deki DERC Pilot ve Fizibilite Programı (M.P. Cooper'a) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri yerel ve federal düzenlemelere uygun ve kurumsal IACUC ve radyasyon güvenliği yönetiminin onayı ile yapılmalıdır. 1. Hazırlık <ol><li> Birkaç gün önce tahlil için, Karaciğer Digest Medium (LDM) 500 ml şişe çözülme ve 50 ml konik tüpler içinde ~ 35 ml alikotları dondurursam. Kadar gerekli -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Bir gün önce tahlil için, otoklav ile temiz diseksiyon araçları önceden sterilize edin. </li><li> Analiz gününde, kollajen ile 24 oyuklu kültür plakaları gerekli miktarda muamele. <ol><li> PBS ile 50 kısım, 3 mg / ml fare kuyruk kolajeni 1 kısım karıştırın. Bir 24-yuvalı plakanın her oyuğuna yaklaşık 500 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca (RT) enkübe edilir. Kollajen çıkarın ve plaka kaput kuru hava için izin verir. En az bir ek tekrarlayın. Not: Kollajen kaplama reklamda bir haftaya kadar yapılabilirvance ve plakalar plastik sargı mühürlü 4 ° C&#39;de saklandı. </li></ol></li><li> 37 ° C&#39;ye kadar çözülme LDM ve sıcak ve 1 N KOH kullanılarak 7.4&#39;e pH ayarlamak: deney için LDM hazırlayın. Bir çevrimli 42 ° C su banyosunda 0.2 mikron şırınga filtresi ve yer kullanarak Filtre. </li><li> Su banyosu çevrimli 42 ° C&#39;ye kadar Karaciğer Perfüzyon Orta Sıcak 25 mi. </li><li> Polivinilpirolidon çözeltisi ile kaplanmış% 90 kolloidal silika hazırlayın: polivinilpirrolidon ile kaplanmış koloidal silika 9 ml 10x DPBS 1 ml ilave edilir. 0.1 N HCI kullanılarak pH 7.4&#39;e ayarlayın. Steril 0.2 um şırınga filtresi ile filtre. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> 37 ° C sıcak bir orta kaplama. </li></ol> İlköğretim Fare Hepatositlerin 2. izolasyonu <ol><li> Peristaltik pompa, boru ve diseksiyon tablo ayarlama: steril su, 10 ml, ardından damıtılmış su içinde 5 mi,% 70 etanol ile yıkama ile boru sterilize edin. Doldurmak için Karaciğer Perfüzyon Ortamında boru ve koşmak pompayı yerleştirinborunun tüm uzunluğu. </li><li> Kurumsal onaylı yöntem ile fare Kurban. </li><li> Karın boşluğuna açık parçalara ayır:% 70 etanol ile liberal fare karın püskürtün. Künt uç makas kullanarak, dermis yoluyla karın uzunluğunu orta hat kesi yapmak ve yanal yansıtır. Iç organları maruz periton benzer bir kesi yapmak. <ol><li> Yavaşça bağırsak yerinden, künt aleti kullanarak karın damarlanma karın inferior vena kava (IVC) bulun ve renal ven distal damar altına bir dikiş, koyun ortaya çıkarmak için </li></ol></li><li> Distal sütür için, dikiş düzeyde ötesine ilerleyen, IVC içine bir iğne ve kateter yerleştirin. Hala yerinde iğne ile yerde tutmak için kateter etrafında dikiş kravat. Dikkatlice iğneyi çıkartın. Eğer kateter yoluyla akışı ile, doğru bir şekilde kan yapılır. </li><li> Bir pipet kullanarak, sağlanması, perfüzyon ortamına kateter kalan alanı doldurmakBu hava mevcut. Büyük bir özenle, kateter tüp takmak. </li><li> Akciğer boşluğuna açık parçalara ayır: hafifçe diyaframa maruz üstün karaciğer lobları yansıtmaktadır. Dikkatle sonra keskin uçlu makas ile diyafram delinme safra kesesi ve plevra damarsal önlemek için özen, plevra boşluğu maruz yanal kesi yapmak. Hepatik ven sadece proksimal torasik inferior vena kava etrafında bir bulldog kelepçe yerleştirin. </li><li> Portal ven kesin ve 3 pompa açmak - / dk 4 ml. Perfüzyon ortamı, yaklaşık 20 ml ile 5 dakika boyunca karaciğer Perfüzyon Ortamı ile karaciğer serpmek. Not: Karaciğer hemen tan / gri kırmızı değişmelidir. Karaciğer bölümleri kırmızı kalırsa, bu büyük olasılıkla kötü perfüzyon gösterir ve başarılı izolasyon olasılığı büyük ölçüde azalır. Perfüzyon sırasında dışarı çalışmaz ortamı sağlamak için dikkatli olun ve hiçbir kabarcıklar tüp girmek söyledi. </li><li> 5 dakika inkübasyondan sonra, stopPompa ve Karaciğer Digest Orta boru aktarın. (Orta tükenene kadar) 15 dakika - pompayı yeniden başlatın ve başka bir 10 için karaciğer serpmek. </li><li> Perfüzyon sonunda pompayı durdurun. Karaciğer pembemsi renge sahip ve biraz genişlemiş görünmelidir. Dikkatli diseksiyon ile karaciğer tüketim. Safra kesesi çıkarın ve 10 cm doku kültürü çanak karaciğer aktarmak. </li><li> Bir biyogüvenlik kabini, karaciğere Kaplama Orta 10 ml (Tablo 1) ekleyin. Yavaşça hepatositler kaldırmak ya forseps veya neşter kullanılarak karaciğer kazıyın. 50 ml&#39;lik konik tüp 100 mikron hücre süzgeç ve transfer kullanarak süspansiyon Filtre. 50 ml konik tüp ek bir 10 Kaplama Orta ml ve havuzlu plaka yıkayın. </li><li> 350 xg, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri Pelet. </li><li> % 90 koloidal silika, 10 mi po ile kaplanmış Kültür ortamı basınçla Kaplama Orta 10 ml tekrar süspansiyon pelet ekleyinlyvinylpyrrolidone. Adım 2.11 gibi yavaşça ve santrifüj karıştırın. Canlı hücreler, alt pelet ise santrifüjlemeden sonra, ölü hücreleri bir tabakası, karışımın üzerinde yüzen olacaktır. </li><li> Aspire ölü hücreler ve orta. Kaplama Medium, 2.11 gibi santrifüj 20 ml 2 kez yıkayın. </li><li> Kaplama Orta 10 ml süspanse hücreleri. Bir hemasitometre ile hücre sayımı ve kollajen ile tedavi edilmiş 24 oyuklu kültür tabaklarında 9 x 10 4 hücre / çukur yerleştirin. 2 saat boyunca 37 ° C&#39;lik bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde inkübe edin. Her plaka, yağ asidi oksidasyon deneyi TD lipogenesis tahlilinde biri için kullanılabilir. </li><li> İsteğe bağlı olarak, 37 ° C &#39;de, muhafaza edici ortam (Tablo 1) ve kültür kuyularının değiştirin. Deney sonuçları etkilemeden 3 gün - Hücreler 2 kültürlenebilir. </li></ol> 3. Yağ Asidi Oksidasyonu Deneyi Uyarı: radyoaktivite kullanılması tehlikeli olabilir. Tüm satın alma, depolama, elleçleme, ve diRadyoaktif maddenin sposal kurumsal, eyalet ve federal düzenlemeler ve kurallara uygun olarak yapılmalıdır. <ol><li> 16 - 20 saat önce tahlil için, ılık PBS ile hücreler 2 kez yıkayın. 20 nM glukagon ile serumsuz serum açlık Ortamı (Tablo 1) hücreleri değiştirme ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Not: fetal sığır serumu metabolik hormonların bilinmeyen bir konsantrasyon (örneğin insülin, glukagon) içerdiğinden, serum bu tahlilde üzerinde sahip olabileceği herhangi karıştırıcı etkileri ortadan kaldırmak için hücreleri açlıktan. Hücreler&gt; 24 saat serum Açlık Ortamda yaşayabilir. Glukagon işleme hepatositlerde yağlı asit oksidasyonunu teşvik etmek için kullanılır. </li><li> Tahlilinde sabahı, ön inkübasyon ortamı, hazırlanması: 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;ye kadar, bir 100 mM çözelti ve ısı yapmak için, aşırı saf su içinde sodyum-palmitat, uygun bir miktarda yeniden süspanse edin. Bu arada, gerekli miktarda (24-iyi levha başına 0.5 mi) hazırlanması25 mM HEPES,% 1 BSA fraksiyonu V, ve 20 nM glukagon ile DMEM. 37 ° C&#39;ye ısıtın. <ol><li> Çözündürülmüş sonra, ortama 250 uM nihai konsantrasyona kadar palmitat ekleyin. Orta-Kuluçka öncesi ve 2 saat 37 ° C&#39;de inkübe hepatositlerin değiştirin. Daha sonra kullanılmak üzere 37 ° C &#39;de, bazı ön inkübasyon ortamı, ayırın. </li></ol></li><li> İnkübasyon sırasında, nitrojen gazı altında buharlaştırma ile 14 C-palmitat, uygun bir miktarda (0,5 uCi / oyuk) kurutun. <ol><li> Örneğin, bir 24-çukurlu plaka içinde 24 örnekleri ölçmek için 1,5 ml&#39;lik bir tüpe 0.1 uCi / ml 14 C-palmitat 120 ul transfer. Yavaş yavaş bir duman başlığı içinde 3-5 cm uzaklıktan çözelti üzerinden bir nitrojen gazı püskürtülerek solvent etanol buharlaştırılır. Tüpün alt kuru 14C-Palmitat bırakarak, 40 dakika - çözücü içinde yaklaşık 30 buharlaşır gerekir. </li></ol></li><li> Yaklaşık 15 dakika süreyle inkübe edildikten sona ermeden önce, 14 tekrar süspansiyon0,1 N NaOH içerisinde C = Palmitat (12.5 ul / uCi). 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;de inkübe edin. Sıcak ön inkübasyon ortamı, üç hacim ekleyin ve aşağı yukarı pipetleme karıştırılır. </li><li> Seyreltilmiş 14 C-palmitat 25 ul her bir başak. Hafifçe plaka sallanmasıyla karıştırın ve 90 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Bu deney, bir plakadır. </li><li> İnkübasyon sırasında, Filtre Kağıdı Plate (Şekil 1) hazırlar. <ol><li> Steril 24 plaka kapağı çıkarın. Kuyucuğun alt filtre kağıdı, bir 2 cm x 2 cm parçası yerleştirin. 4 &quot;x 7&quot; parafilm bir parça ile plaka Yerleşimi. </li><li> Böyle bir mikropipet ucu kutusu gibi, büyük dikdörtgen bir nesne kullanarak, iyi açılışlarında parafilm perfore ve plaka geri kalanı üzerinde bir mühür oluşturmak için kuyular üzerinde parafilm ovalayın. Şimdi kuyuları kapsayan parafilm delikli çevreleri çıkarın. Plaka şimdi sıkı sıra o hariç tüm alanlarda parafilm ile kaplanmış olmalıdırpenings. </li></ol></li><li> 10 dakika süreyle inkübe edildikten sona ermeden önce, bir filtre kağıdı tüm sıvı absorbe emin olarak, filtre kağıdı bir levhanın her çukuruna 3 N NaOH 200 ul ilave edin. <ol><li> Donmaya karşı isteğe bağlı olarak önceden bir taze 24-yuvalı plakaya orta aktarın. Bir kez PBS ile yıkandıktan sonra, 0.1 N HCI kalan hücreler lize edildi ve bir BCA aracıyla protein içeriğini hesaplar. </li></ol></li><li> İnkübasyonun sonunda, sıvı nitrojen içinde Deney Plakası ek dondurularak. Tamamen geçmeden önce dondurulur her iyi sağlamak için dikkatli olun. </li><li> Deney plakası, her sıra için% 70 perklorik asit, 100 ul ekle. Hemen Filtre Kağıt Plate ile kaplayın. 2 st için oda sıcaklığında 80 rpm&#39;de yörüngesel hızda bir orbital çalkalayıcı ve kaya plakaları yerleştirin. </li><li> İnkübasyondan sonra, örnekler işlem: <ol><li> Bir sintilasyon 4 ml sıvı sintilasyon sıvısına filtre kağıdı kareler transfer CO 2 fraksiyonu ölçmek içinŞişe ve ölçü 14 C sinyali. </li><li> Asit çözünebilir malzeme ölçen 1.5 ml mikrofüj tüpe orta 400 ul aktarma. 10 dakika süreyle maksimum hızda santrifüjleyin. Kısaca 1 kloroform-metanol (h / h) ve girdap: 2 500 ul Elde edilen üstte yüzere, 100 ul ekle. <ol><li> Yine karışımına su 250 ul ekleyin ve vorteks. 3,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj örnekleri. Transfer sintilasyon şişesine 4 ml sıvı sintilasyon sıvısı üst fazın 200 ul 14 C sinyali ölçer. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. lipogenez Deneyi <ol><li> Akşam önce tahlil başlamadan, ılık PBS ile hücreler 2 kez yıkayın. 100 nM insülin Serum Açlık Orta hepatositler değiştirin. 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. Not: fetal sığır serumu bir metabolik hormonların bilinmeyen konsantrasyonu (örneğin insülin içerdiğinden, glukagon), Serum Bu testte üzerinde sahip olabileceği herhangi karıştırıcı etkileri ortadan kaldırmak için hücreleri açlıktan. Hücreler&gt; 24 saat serum Açlık Ortamda yaşayabilir. İnsülin lipogenez uyarmak için bu deneyde kullanılır. </li><li> 100 nM insülin, 10 uM soğuk asetat ve 0.5 uCi 3H-asetat başına iyi Serum Açlık Orta: lipogenezi Orta olun. Lipogenez Ortama hücreleri değiştirmek ve 2 saat süre ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. Çıkar bileşiklerin, test edilecek içerir. </li><li> İnkübasyon süresinden sonra, hücreler PBS ile 2 kez yıkayın. 0.1 N HCI içinde 120 ul kazınarak Hücreleri,. Rezerv 10 protein tayini için ul (BCA tahlili ile değerlendirilmesi), ve transfer 1,5 ml mikrofüj tüpüne 100 ul. </li><li> 2 500 ul ilave edilerek özü lipidler: 1 kloroform-metanol (h / h). Vorteks kısa ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Su, girdap 250 ul ekleyin ve ek 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Santrifüj örnekleri 3000 x g&#39;de oda sıcaklığında 10 dakika. ÖzenleBir sintilasyon şişesine 4 ml sıvı sintilasyon sıvısına alt faz transferi ve 3 H aktivitesini ölçmek. </li></ol>

<ol><li>Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+and+etiology+of+elevated+aminotransferase+levels+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).</li>
<li>Lazo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+nonalcoholic+Fatty+liver+disease+in+the+United+States%3A+the+third+national+health+and+nutrition+examination+survey%2C+1988-1994%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+epidemiology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994.</a> American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).</li>
<li>Angulo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic fatty liver disease.</a> The New England journal of medicine. 346, 1221-1231 (2002).</li>
<li>Adams, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+a+population-based+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study.</a> Gastroenterology. 129, 113-121 (2005).</li>
<li>Feldstein, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+apoptosis+and+fas+expression+are+prominent+features+of+human+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).</li>
<li>Day, C. P., James, O. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steatohepatitis%3A+a+tale+of+two+%27hits%27%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Steatohepatitis: a tale of two 'hits'.</a> Gastroenterology. 114, 842-845 (1998).</li>
<li>Donnelly, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+fatty+acids+stored+in+liver+and+secreted+via+lipoproteins+in+patients+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease.</a> The Journal of clinical investigation. 115, 1343-1351 (2005).</li>
<li>Lambert, J. E., Ramos-Roman, M. A., Browning, J. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+de+novo+lipogenesis+is+a+distinct+characteristic+of+individuals+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Increased de novo lipogenesis is a distinct characteristic of individuals with nonalcoholic fatty liver disease.</a> Gastroenterology. 146, 726-735 (2014).</li>
<li>Parks, E. J., Hellerstein, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+patient-oriented+research.+Recent+advances+in+liver+triacylglycerol+and+fatty+acid+metabolism+using+stable+isotope+labeling+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques.</a> Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).</li>
<li>Befroy, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+assessment+of+hepatic+mitochondrial+oxidative+and+anaplerotic+fluxes+in+humans+using+dynamic+13C+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy.</a> Nature medicine. 20, 98-102 (2014).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+journal%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malaria journal. 6, 169(2007).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Perfüzyon kurban gelen zaman ideal bir perfüzyon ve karaciğer kollajenaz sindirimi için en az 3 dakika olmalıdır. Perfüzyon Orta ile perfüzyon başlatılır sonra, karaciğer hemen kırmızı soluk ila görünümünü değiştirmek gerekir. LDM inkübasyonu yaklaşık 10 dakika sonra, karaciğer, şişmiş ve pembe görünür. Perfüzyon yetersiz olması halinde, karaciğer, bu değişiklikler göstermezler olabilir ve bu, tipik olarak daha düşük bir hepatosit verimle sonuçlanır. Yıkama adımlarının ardından, izole edilmi...

Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı, Batılılaşmış kültürlerde karaciğer hastalığının önde gelen nedenlerinden biridir1,2. Karaciğer içinde lipid birikimi, henüz bilinmeyen mekanizmalar yoluyla hücre ölümü, fibroz ve karaciğer yetmezliği ile ilişkilidir3-6. Yağlı karaciğer hastalığında, hepatosit aracılı β-yağ asidi oksidasyonu ve de novo lipogenez, net lipid birikiminin önemli belirleyicileridir7,8. Bu nedenle, bu makale hepatosit izolasyonuna odaklanacak, ardından β-yağ asidi oksidasyonu ve de novo lipogenezin miktar tayini yapılacaktır.
Hepatosit lipid metabolizmasını sorgulamak için çok sayıda metodoloji geliştirilmiştir. Kararlı izotoplar9,10 kullanarak in vivo yağ metabolizmasını ölçmek mümkün olsa da, bu yöntemler maliyetlidir ve çok sayıda hayvan gerektirir. Ek olarak, eksojen kimyasalların etkisini araştırma yeteneği, in vivo deneylerin doğası gereği sınırlıdır. Buna karşılık, primer hepatositlerin fare karaciğerinden izolasyonu,11'i takip etmek için uygun bir yol sağlar. Ayrıca, kültürde hepatositlerin incelenmesi, araştırmacıların in vivo deneylerin zorluklarını aşarken, çeşitli kimyasalların lipit işleme üzerindeki etkilerini incelemelerine olanak tanır. Son olarak, izole edilmiş hepatositler, tek bir hayvanın karaciğerinden türetildikleri için değişen genetikten kaynaklanan herhangi bir karışıklığı önler.
Burada hepatositleri izole ve kültürlüyoruz ve radyoaktif işaretli palmitat kullanarak β-yağ asidi oksidasyonunu ve de novo lipogenezi ölçüyoruz. Aşağıda ayrıntıları verilen protokol basit, etkili ve tekrarlanabilirdir.

<table><tbody><tr><td>Karaciğer Perfüzyonu Orta Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>Karaciğer Sindirim Orta Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>17703034</td><td>Aliquot ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td></td><td>PBS Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10X DPBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>26140079&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kolajen</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A1048301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirolidon GE</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Pirüvat</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Albümin (BSA) ile kaplanmış kolloidal silika, Fraksiyon V</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>103703</td><td></td></tr><tr><td>24 Kuyulu Kültür Kabı</td><td>Corning Falcon</td><td>353047&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tygon S3 Boru&nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06460-34</td><td></td></tr><tr><td>Erkek Leur Kilidi - 200 Barb Konnektör</td><td>Cole Parmer</td><td>45518-00</td><td></td></tr><tr><td>24 G x 3/4" Kateter</td><td>SurFlo</td><td>SROX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>Perma-El İpek</td><td>Sütür Ethicon</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci</td><td>Corning Falcon</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 3013HD Devridaim Su</td><td>Banyosu Fisher</td><td>13-874-3</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex C/L Peristaltik Pompa</td><td>MasterFlex</td><td>HV-77122-24</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokelepçe</td><td>Roboz</td><td>RS-7438</td><td>Otoklavda ön sterilizasyon</td></tr><tr><td>5" Düz, Künt-Künt Ameliyat Makası</td><td>Roboz</td><td>RS-6810</td><td>Otoklavda ön sterilize</td></tr><tr><td>24 mm Bıçak Düz, Keskin Uçlu Mikrodiseksiyon Makası</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Otoklavda ön sterilizasyon</td></tr><tr><td>4" 0.8 mm Uç Mikrodiseksiyon Forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-5130</td><td>Otoklavda ön sterilizasyon</td></tr><tr><td>4" 0.8 mm Uç Tam Eğri Mikrodiseksiyon Forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td>Otoklavda ön sterilizasyon</td></tr><tr><td>60 ml Şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüpler</td><td>Corning Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Testi</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik Kabini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 İnkübatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000, 200, 20 & mu; l Pipet ve uçlar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare İlköğretim hepatositlerde yağ asidi oksidasyon ve lipogenez belirlenmesi

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Karaciğerde lipid metabolizması karmaşıktır. Lipitin lipoproteinler yoluyla içe ve dışa aktarılmasına ek olarak, hepatositler lipidi yağ asidi oksidasyonu yoluyla oksitleyebilir veya alternatif olarak de novo lipogenez yoluyla yeni lipid sentezleyebilir. Bu yolların net toplamı, bazı hastalık durumlarında yağlı karaciğer hastalığına yol açan bir dizi faktör tarafından belirlenir. Aşırı karaciğer lipid birikimi tüm vücut insülin direnci ve koroner kalp hastalığı ile ilişkilidir. Hepatositlerde lipid metabolizmasını incelemek için kullanılan araçlar, bazı metabolik bozukluklarda hepatik lipid metabolizmasının rolünü anlamak için yararlıdır.
Karaciğerde hepatositler, sırasıyla β yağ oksidasyonu ve de novo lipogenez yoluyla yağ asitlerinin parçalanmasını ve sentezini düzenler. Bu yollardaki metabolizmanın ölçülmesi, hepatik lipid kullanımı hakkında bilgi sağlar. Primer hepatositlerin kullanıldığı in vitro kantifikasyondan farklı olarak, in vivo ölçümler yapmak teknik olarak zor ve kaynak yoğundur. Bu nedenle, kültürlenmiş fare hepatositlerinde β-yağ asidi oksidasyonu ve de novo lipogenezin ölçülmesi, hepatosit lipid kullanımını değerlendirmek için basit bir yöntem sağlar. 
Burada birincil fare hepatositlerinin izolasyonu için bir yöntem açıklıyoruz ve radyoaktif işaretli substratlar kullanarak β-yağ asidi oksidasyonu ve de novo lipogenezin miktar tayinini gösteriyoruz.

3 x 10 7 toplam hücre - hepatosıt izolasyonlar genellikle 1 ile sonuçlanır. Gece boyunca inkübasyondan sonra, hücreler (Şekil 2), binükleer olacak birçoğu altıgen görünür. Sağlıklı hücreler, hücre ölümü göstergesidir granülasyon veya kabarcıkların, yoksun olmalıdır. Genel olarak, yağ asidi oksidasyon deneyi, test bileşiği başına üç ila dört kez tekrarlanmış çalıştırılır. CO2 numune için sayımlar asit çözünür malzeme elde edilenler yaklaşık beşte biri ol...

De novo lipogenez ve β-yağ asidi oksidasyon hepatosit kilit metabolik, yağlı karaciğer hastalığı da dahil olmak üzere birçok metabolik bozukluklar, içinde tedirgin olan yollar oluşturmaktadır. Burada fare primer hepatositlerin izolasyonu göstermek ve β-yağ asidi oksidasyon ve lipogenez ölçümü açıklar.

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Bu prosedürün genel amacı, primer fare hepatositlerinde yağ asidi metabolizmasını değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle bir fare karaciğerinin sindirim ortamı ile perfüze edilmesi, karaciğerin çıkarılması ve ardından hepatositlerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hepatositlerin kolajen kaplı plaklarda kültüre edilmesidir.Ardından, hepatositler test edilecek deneysel müdahalelerle işleme tabi tutulur. Son adım, hücrelerin radyoaktif olarak işaretlenmiş bir substrat varlığında inkübe edilmesidir. Nihayetinde, çeşitli farmakolojik veya genetik müdahalelerin primer hepatositlerde yağ asidi oksidasyonu veya lipogenez üzerindeki etkilerini göstermek için sıvı sintilasyon analizi kullanılır.Bu yöntem, belirli farmakolojik ve genetik müdahalelerin hepatosit biyolojisini nasıl etkilediği dahil olmak üzere, metabolizma ve diyabet alanındaki birçok temel sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin görsel demonstrasyonu iki nedenle kritiktir. Birincisi, hepatosit sağlığını etkileyen spesifik perfüzyon koşullarını elde etmek zordur ve ikincisi, salınan karbon dioksitin nicelleştirilmesidir.Gazların davranışı sezgisel değildir. Bu prosedürü, laboratuvarımdan lisansüst

determination-fatty-acid-oxidation-lipogenesis-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, hepatik steatozun in vivo ve in vitro modellerini oluşturmak ve steatotik fenotipleri ve ilgili fizyolojik parametreleri analiz etmek için optimize edilmiş yöntemler açıklanmaktadır.

Optimize Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Karaciğer Steatoz

Burada, sağlıklı ve fonksiyonel birincil fare tetkikine yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Hepatik doğmakta olan protein sentezi tarafından radyoaktif olmayan etiketleme substrat algılamak için yönergeler protein sentezi karaciğer homeostazı enerji metabolizması bağlamında temel mekanizmaları anlamanıza yardımcı olmak için sağlanmıştır.

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

Primer hepatositler, karaciğer yanıtını ve metabolizmasını in vitro olarak incelemek için değerli bir araçtır. Ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak, fare primer hepatosit izolasyonu için geliştirilmiş bir zaman ve emek verimli protokol geliştirilmiştir.

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

Bu makale, farelerde lipid metabolizmasını değerlendirmek için üç kolay ve erişilebilir test sağlar.

Farelerde Tüm Vücut Lipid Taşıma Kapasitesinin Değerlendirilmesi

Bu protokol, steatozu ve hepatositlerin lipitlere aşırı maruz kalmasıyla ortaya çıkardığı moleküler, biyokimyasal, hücresel değişiklikleri incelemek için bir araç olması amaçlanmıştır.

Deneysel Steatoz İn VitroModeli : Lipid Aşırı Yük Şartlandırılmış Ortamda Hepatosit Hücre Kültürü

Yağ asidi β-oksidasyonu, hepatositler de dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde enerji üretmekten sorumlu önemli bir metabolik yoldur. Burada, 14C etiketli palmitik asit kullanarak taze izole edilmiş primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi

Adipositlerde trigliserit lipoliz, serbest yağ asitlerinin ve gliserolün serbest bırakılmasıyla sonuçlanan önemli bir metabolik süreçtir. Burada, adipositlerde bazal ve uyarılmış lipolizi ve farelerden ex vivo yağ dokusunu ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Lipoliz Oranının Ex Vivo Murin Yağ Dokusu ve İn Vitro Diferansiye Primer Preadipositlerin Ölçülmesi

Bu makale, metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı için bir model olarak oleik asit kaynaklı HepG2 hücrelerinin kullanımını açıklamaktadır.

Metabolik Disfonksiyonla İlişkili Steatotik Karaciğer Hastalığında Yağ Birikiminin İn Vitro Modellenmesi

Cryolysis, üre solubilziation, HILIC fraksiyonasyon ve fosforile peptidlerin IMAC zenginleştirme kullanarak kantitatif fosforilasyon prosedürü açıklaması.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

Yumurtalık kanseri Ortotopik hayvan modellerinde daha iyi insan hastalığı çoğaltmak ve bu nedenle kanser progresyonu ve tedaviye tümör yanıt anlayışımızı geliştirmek. Bir fare modelinde lusiferaz ifade over tümör hücrelerinin bir İntrabursal enjeksiyon alır. Tedavi ağızdan sonda ile yönetilmektedir. Tümör büyüme...

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Öğrenin, fare ilköğretim hepatositlerinde yağ asidi oksidasyonu ve lipogenezin radyoaktif substratlarla nasıl ölçüldüğünü. Bu yöntem metabolizma bozukluklarının tedavisine katkı sağlar.

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet