Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, birincil fare hepatositlerinde yağ asidi metabolizmasını değerlendirmektir. Bu, önce perfüzasyon, sindirimi olan bir fare karaciğeri, orta, çıkarılması ve daha sonra hepatositlerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hepatositlerin kollajen kaplı plakalar üzerinde kültürlenmesidir.

Daha sonra, hepatositler test edilecek deneysel müdahalelerle tedavi edilir. Son adım, hücreleri radyo etiketli bir substrat varlığında inkübe etmektir. Sonuç olarak, sıvı sintilasyon analizi, çeşitli farmakolojik veya genetik müdahalelerin primer hepatositlerde yağ asidi oksidasyonu veya lipogenez üzerindeki etkilerini göstermek için kullanılır.

Bu yöntem, spesifik farmakolojik ve genetik müdahalelerin hepatosit biyolojisini nasıl etkilediği de dahil olmak üzere metabolizma ve diyabet alanındaki birçok önemli sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi iki nedenden dolayı kritiktir. Birincisi, hepatosit sağlığını etkileyen spesifik perfüzyon koşullarının elde edilmesi zordur ve ikincisi, salınan karbondioksitin miktarının belirlenmesi zordur.

Gaz sezgisel değildir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Tom Akey olacak. Steril borunun bir ucunu önceden ısıtılmış karaciğer perfüzyonuna, ortama ve diğer ucunu bir atık kabına yerleştirerek peristaltik pompayı kurun.

Pompayı, borunun tüm uzunluğu orta ile dolana kadar çalıştırın. İlgilenilen bir farenin feda edilmesinin ardından, farenin karnına bolca %70 etanol püskürtün. Ardından, dermisten, karın uzunluğundan orta hat kesisi yapmak ve yanal olarak yansıtmak için künt uçlu makas kullanın.

İç organları ortaya çıkarmak için peritonda benzer bir kesi yapın. Künt bir alet kullanarak, bağırsakları nazikçe yerinden çıkarın. Abdominal vaskülatürü ortaya çıkarmak için, abdominal inferior vena kava'yı bulun ve böbrek damarının distalinde, sütürün distalinde kan damarının altına bir dikiş yerleştirin.

İnferior vena kava içine bir iğne ve kateter yerleştirin ve sütürün ötesine ilerletin. İğne hala yerindeyken, yerinde tutmak için dikişi kateterin etrafına bağlayın ve ardından iğneyi dikkatlice çıkarın. Doğru yapılırsa, kan bir pipet kullanılarak kateterden akacaktır.

Kateterde kalan alanı perfüzyon ortamı ile doldurun ve hava olmadığından emin olun. Sonra büyük bir özenle, boruyu katetere takın. Ardından, diyaframı keskin uçlu makasla dikkatlice delin ve plevral boşluğu ortaya çıkarmak için yanal bir kesi yapın.

Safra kesesi ve plevral vaskülatürden kaçınmaya özen göstererek, hepatik venin hemen proksimalinde torasik inferior vena kava'nın etrafına bir bulldog kelepçesi yerleştirin. Ardından portal damarı kesin ve pompayı dakikada üç ila dört mililitre olarak açın. Yaklaşık 20 mililitre perfüzyon ortamı kullanarak karaciğeri karaciğer perfüzyon ortamı ile beş dakika boyunca perfüze edin.

Bu süre zarfında, karaciğerin kırmızıdan gri ten rengine ani renk değişimini gözlemleyin. Karaciğerin bazı kısımları kırmızı kalırsa, bu kötü perfüzyonu gösterir ve başarılı izolasyon olasılığı büyük ölçüde azalır. Beş dakikalık perfüzyonun ardından, pompayı durdurun ve hortumu karaciğer sindirim ortamına aktarın.

Pompayı yeniden başlatın ve karaciğeri 10 ila 15 dakika daha perfüze edin. Ortam tükenene kadar dakikada üç ila dört mililitrede. Perfüzyonun sonunda pompayı durdurun.

Karaciğer pembemsi bir renk tonuna sahip olmalı ve biraz genişlemiş görünmelidir. Bu noktada, dikkatli bir diseksiyon ile karaciğeri eksize edin. 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına aktarın ve safra kesesini çıkarın.

Daha sonra, karaciğere 10 mililitre kaplama ortamı ekleyin ve bir neşter kullanarak karaciğeri nazikçe kazımaya başlayın. Hepatositleri çıkarmak için, süspansiyonu 100 mikronluk bir hücre süzgeci ile süzün ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Plakayı ilave 10 mililitre kaplama ortamı ile yıkayın ve sıvıyı 50 mililitrelik konik tüpe çekin.

Daha sonra hücreleri dört santigrat derecede peletleyin, 350 Gs'de beş dakika santrifüjleyin, ortamı aspire edin ve hücre peletini 10 mililitre kaplama ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, hafifçe karıştırılmış polivinil peron ile kaplanmış 10 mililitre% 90 kolloidal silika ekleyin ve ardından hücreleri daha önce olduğu gibi peletleyin. Santrifüjlemeden sonra, karışımın üstünde yüzen ölü hücre tabakasını aspire edin.

Daha sonra canlı peletlenmiş hücreleri 20 mililitre kaplama ile iki kez yıkayın. Orta resüs. Son hücre peletini 10 mililitre kaplama ortamında askıya alın ve hücreleri bir hemo sitometre kullanarak sayın, 90.000 hücreyi kollajen kaplı 24 kuyuya yerleştirin Kuyu kültürü kapları, plakaları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte iki saat boyunca inkübe eder, teste başlamadan 16 ila 20 saat önce.

Hücreleri ılık PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri serum içermeyen serum açlığına değiştirin. 20 nanomol glukagon içeren orta. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede ve tahlil sabahı% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Ön inkübasyon ortamını hazırlayın ve ardından serum açlığını değiştirin. Ön inkübasyon ortamı için ortam. Bu karışımdaki hücreleri inkübasyon sırasında iki saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

İnkübasyonun bitiminden yaklaşık 15 dakika önce etanol çözücüsünü nitrojen altında buharlaştırarak C 14 palmitat oyuğu başına 0.5 mikro küriyi kurutun, C 14 palmitatı 0.1'de mikro curie başına 12.5 mikrolitrede yeniden süspanse edin. Normal sodyum hidroksit, karışımı 70 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Ardından üç hacim ılık ön inkübasyon, orta ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Plakayı hafifçe sallayarak her bir kuyucuğu 25 mikrolitre seyreltilmiş C 14 palmitat karışımı ile doldurun ve 37 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin. Bu tahlil plakasıdır İnkübasyon sırasında, kapağı steril bir 24 oyuklu plakadan çıkarın ve her bir kuyucuğun dibine iki santimetreye iki santimetrelik bir filtre kağıdı parçası yerleştirin. Ardından, mikro pipetleyici uç kutusu gibi büyük bir dikdörtgen nesne kullanarak plakayı dört inç x yedi inç ölçülerinde bir parça param ile kaplayın.

Kuyu açıklıklarında paraformu delmek için paraformu kuyucuklara sürün ve plakanın geri kalanı üzerinde bir sızdırmazlık oluşturun. Ardından delikli parfüm halkalarını çıkarın. Şimdi inkübasyonun bitiminden 10 dakika önce kuyuları kaplayarak, filtre kağıdı plakasının her bir oyuğuna 200 mikrolitre üç normal sodyum hidroksit ekleyin ve filtre kağıdının tüm sıvıyı emdiğinden emin olun.

İnkübasyonun sonunda, tahlil plakasını sıvı nitrojen içinde dondurun. Daha sonra, tahlil plakasının her bir oyuğuna kalori asidi başına% 70 100 mikrolitre ekleyin. Hemen bir filtre kağıdı plakası ile örtün ve plakaları bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.

Plakaları iki saat boyunca oda sıcaklığında 80 RPM yörünge hızında sallayın. Daha sonra, filtre kağıdı karelerini sintilasyon şişelerindeki dört mililitre sıvı sintilasyon sıvısına aktararak karbondioksit fraksiyonunu ölçün ve asitte çözünür malzemeyi ölçmek için bir sintilasyon sayacında C 14 sinyalini ölçün. 400 mikrolitre ortamı 10 dakika boyunca maksimum hızda 1.5 mililitrelik bir mikro füj tüpü santrifüjüne aktarın ve daha sonra elde edilen süpernatantın 100 mikrolitresini iki ila bir kloroform ve metanol karışımının 500 mikrolitresine ekleyin.

Karışımı kısa bir süre vorteksleyin ve ardından karışıma 250 mikrolitre su ekleyin ve girdap yapın. Daha sonra, üst fazın 200 mikrolitresini bir sintilasyon şişesindeki dört mililitre sıvı sintilasyon sıvısına aktarın ve hücrelerin serum açlığını takiben C 14 sinyalini ölçün. Hücreleri lipogenez ortamına dönüştürün.

Test edilecek herhangi bir ilgilenilen bileşiği ekleyin ve daha sonra hücreleri inkübasyon süresinden sonra iki saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. 120 mikrolitre 0.1 normal hidroklorik asit ekleyerek hücreleri parçalamadan önce hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Her birine, lizatı serbest bırakmak için kuyuları iyice kazıyın ve ardından 100 mikrolitre lizatı 1.5 mililitrelik bir mikro füj tüpüne pipetleyin.

Daha sonra, her tüpe iki ila bir kloroform ve metanol karışımından 500 mikrolitre ekleyin. Kısa bir süre girdap yapın ve ardından oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. 250 mikrolitre su girdabında inkübasyondan sonra ve daha sonra numuneyi oda sıcaklığında beş dakika daha inkübe edin.

Daha sonra numuneleri 3000 Gs'de 10 dakika santrifüjleyin.Ayrılan sıvının alt fazını bir sintilasyon şişesindeki dört mililitre sıvı sintilasyon sıvısına dikkatlice aktarın ve bir sintilasyon sayacı kullanarak trityum aktivitesini ölçün. Bu prosedür tipik olarak fare başına 10 ila 30 milyon hepatosit izolasyonu ile sonuçlanır. Gece boyunca inkübasyondan sonra, sağlıklı hücreler altıgen görünür ve bunların çoğu çekirdeklenir.

Sağlıksız kültürler genellikle hücre ölümünün göstergesi olan granülasyonlar veya kabarcıklar içerir. F-C-C-P-A hücresel solunum promotörü ve bir solunum inhibitörü olan oligo misin ilavesinin tam oksidasyonu ölçmek için bir araç kontrolü ile karşılaştırıldığı bir yağ asidi oksidasyon testinin sonuçları burada gösterilmiştir. Karbondioksitin asitte çözünen malzemeye oranı hesaplanır.

FCCP gibi hücresel solunumu destekleyen maddeler, bu oranı karbondioksite doğru kaydıracak ve TC yoluyla daha fazla oksidasyona işaret edecektir. Solunum zincirinin bir döngü inhibitörleri, ölçüldüğünde genel olarak oksidasyonu azaltacaktır. FCCP gibi yağ asidi oksidasyonunu artıran veya oligo misin gibi bir TP sentezini azaltan lipo aktivitesi bileşikleri, araç kontrolleriyle karşılaştırıldığında kültürlenmiş hepatositlerde lipo aktivitesini azaltacaktır. Bu prosedürü denerken, hayvan kurban edildikten sonra bolluğun tamamen ve zamanında gerçekleşmesini sağlamak önemlidir.

Ek olarak, yağ asidi oksidasyon deneyi sırasında, ortamın tamamen donması, tekrarlanabilir karbondioksit gazı ölçümleri için kritik öneme sahiptir. Bu videoyu izledikten sonra, primer hepatositlerin nasıl izole edileceğini ve bu hücrelerin in vitro olarak yağ asidi oksidasyonunu ve lipogenezi analiz etmek için nasıl kullanılacağını iyi anlamalısınız.