Name: Beyindeki granü hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatılması, L-lösin metil ester (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Öğrenin, L-lösin metil ester kullanarak serebellar granül hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatma yöntemini. Bu protokol, nöroinflamasyon ve nörodejeneratif hastalıklarda mikroglia-nöron etkileşimlerini araştırmak için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Aims2Cure, Birleşik Krallık ve UCL Etki Ödülü Doktora öğrencisi JMP'ye ve MRC Kapasite Geliştirme Doktora öğrencisi tarafından desteklenmiştir. JMP'ye Demans alanında öğrenci.

Burada tarif Bütün deneyler Birleşik Krallık Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) 1986 Yasası uyarınca yapıldı. Araçların, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık <ol><li> İki paslanmaz çelik laboratuar kesme makasları ve iki paslanmaz çelik laboratuar forseps hazırlayın. Bir kültür kukuleta O tüm aletleri ve yer Otoklav / N sterilizasyon ultraviyole ışık (UV) ışık altında. </li><li> Minimum temel ortam (MEM), kültür ortamı (500 ml yapmak% 10 Fetal Sığır Serumu [FBS], 20 mM KCI, 25 mM NaHCO 3, 30 mM D-glukoz, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 6 ug / ml ampisilin) ​​ve filtre sterilize edin. Ay için 4 ° C&#39;de depolayın. </li><li> 14 mm, 1 numaralı kalınlık lamelleri içeren 24 kuyu kültür tabak hazırlayın. Daha önce tarif edildiği gibi 3, 100 mg / L, poli-D-lisin (PDL) lamelleri ve kat otoklava. UV ışığı O / N sterilize edin. </li></ol> CGC Kültür Çözümleri 2. Hazırlık <ol><li> Tedavi otoklavlanmış, UV ışığı, steril dH &#39;Çözelti A&#39; (100 mi) Hazırlama glikoz, 250 mg, sığır serumu albümin [BSA], 300 mg, fosfat tamponlu salin [PBS] (Ca + 2 ve 955 mg 2 O Mg) + ücretsiz ve% 3.8 1 ml MgSO 4 · 7H- 2 O. </li><li> Çözelti A 9 ml seyreltilmiş / ml tripsin 5 mg 1 ml içeren &quot;çözelti, B &#39;(10 mi) Hazırlama </li><li> &#39;Çözelti C&#39; 1000 birim DNAaz, soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 0.5 mg, çözelti A ile 10 ml olacak şekilde seyreltildi% 3.8 MgSO 4 · 7H 2 O 100 ul, ihtiva eden (10 mi) Hazırlama </li><li> Çözelti A ile 20 ml olacak şekilde seyreltildi çözelti C 3.2 ml, içeren &quot;çözelti, D &#39;(20 mi) Hazırlama </li><li> · 7H 2 O EBSS, 25 mM NaHCO 3, 3 mM MgSO 4 BSA / Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) çözeltisi hazırlayın ve% 4 BSA, pH 7.4, daha önce tarif edilen 3. </li><li> , 150 mM LME bir son konsantrasyon elde etmek için MEM kültür ortamı 5 ml saf LME ekleyerek LME Hazırlama bir tezgah üstü pH metre kullanılarak pH 7.4&#39;e çözelti döner ve filtre, bir 28 mm, polieter sülfon (PES) 0.2 mikron bir şırınga kullanılarak sterilize Filtre. </li></ol> 3. CGCs Kültürleme <ol><li> Daha önce 3 açıklandığı gibi 4-7 gün eski sıçan yavrularından cerebella toplayın. Buz üzerinde 5 ml solüsyon A içeren Petri kabındaki hemen yerleştirin. </li><li> Petri kabı kapağı cerebella ve yer dokusundan fazla çözüm kapalı dökün. </li><li> En az üç farklı yönlerde iyi Alevli jilet ile ince doku doğranır. </li><li> 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de su banyosu içerisinde çözeltisi (kaybolur, sınırlı doku sağlamak için solüsyonu ile Petri kabı durulama) B ve yere doğranmış doku ekleyin. Min yavaşça her çift sallayın. </li><li> Tripsin, sarsıntısından yüzde nötralize etmek için tüp D çözeltisi (20 mi) ilave5 dakika boyunca 65 xg&#39;de rifuge. </li><li> Süpernatantı dökün. </li><li> Süspansiyon mümkün olduğu kadar homojen hale gelinceye kadar, çapı azaldıkça üç alevli bir cam pipet ile iyice Çözelti C trituratının 4 ml (yaklaşık 10 kat her) içinde süspanse edin. </li><li> Yavaş yavaş ve hafifçe BSA / EBSS&#39;ye üstünde Bu homojenat birkaç damla ekleyin. O BSA / EBSS&#39;ye aracılığıyla batmaya başlarsa, daha çiğnemek ve / veya homojenat BSA / EBSS&#39;ye üstünde bir tabaka halinde oturmak gerekir biraz daha çözüm C. ekleyin. Sallamayın. 5 dakika boyunca 100 xg&#39;de Spin. </li><li> Süpernatantı ve MEM orta 1 ml tekrar süspansiyon pelet (yumuşak) sökün. </li><li> MEM ortamı içinde 500 ul 800,000 hücre / Lamel bir hemositometre ve plaka kullanarak hücreleri sayın. % 6 CO2 ile 37 ° C &#39;de, bir kuluçka makinesi içinde yer. </li><li> Ortamı aşağıdaki gün (hazırlık sonrası 24-36 saat) değiştirin. Hücre döngüsü önleyicisi arabinofuranozil sitidin (AraC) 10 uM içeren MEM ortam maddesi içeren bir çözelti yapmak. <ol><li> Her biri içinLamel, sırt hücreleri ve kontör eski orta 250 ul ekleyin, taze 24 plaka eski orta 250 ul korumak kalanını aspire normal MEM orta 250 ul ekleyin ve sonra, hücreler yıkamak için bu aspire Araç-içeren ortama, 250 ul. Not: Hücreler, in vitro (DIV), 6 gün arasında kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 4. Seçici mikrogliada İncelten (6 DIV de yapılır) <ol><li> 150 mM LME bir son konsantrasyon elde etmek için MEM ortamı ayrı bir kısım, 5 ml saf LME ekleyin. </li><li> PH 7.4 çözüm dönün ve filtre 28 mm polieter sülfon (PES) 0.2 mikron şırınga filtresi kullanılarak sterilize edin. </li><li> Kontrol kültürleri için normal bir MEM ortam maddesi ile birlikte 10 dakika boyunca 37 C &#39;de bir su banyosunda MEM ortamı ve yerine 50 mM (2 x LME) bir konsantrasyona kadar seyreltilir. </li><li> Yarısını (250 ul), CGC kültürleri MEM Ortamı çıkarın ve 37 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Sağlıgı hücrelerya da kontrol kültürleri için LME olmayan, önceden ısıtılmış MEM ortam maddesi (250 ul) ile 25 mM arasında iyi olarak konsantrasyonu veren 1: örneğin, 2 x LME (250 ul) ihtiva eden MEM ortam maddesi, 1 seyreltilmiştir. </li><li> 1 saat boyunca% 6 CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> Iki kez, taze, önceden ısıtılmış MEM ortamı içinde yıkayın hücreleri LME içeren medya kaldırmak ve daha sonra kalan kültür ortamı ve ilgili çukurlara taze, önceden ısıtılmış MEM ortamının eşit bir hacmini değiştirmek için kullanılır. </li><li> (37 ° C&#39;de% 6 CO2 ile nemlendirilmiş) inkübatör kültürler dönün ve başka tedavi öncesi 24 saat dinlenmeye bırakın. </li></ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable%2C+yet+not+extraordinary%2C+human+brain+as+a+scaled-up+primate+brain+and+its+associated+cost%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost.</a> PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).</li>
<li>Evans, G. J., &Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+neurotransmitter+release+by+dihydropyridine-sensitive+calcium+channels+involves+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neuro%22%5BJournal%5D)">Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation.</a> Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).</li>
<li>Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways+mobilized+in+microglia+and+neurones+as+a+consequence+of+chromogranin+A-induced+microglial+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation.</a> J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).</li>
<li>Contestabile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cells+as+a+model+to+study+mechanisms+of+neuronal+apoptosis+or+survival+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro.</a> Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).</li>
<li>Kramer, D., Minichiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+of+primary+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell culture of primary cerebellar granule cells.</a> Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).</li>
<li>Facci, L., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+rat+cerebellar+granule+neurons+and+application+to+identify+neuroprotective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents.</a> Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).</li>
<li>Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+of+the+accessory+cell+necessary+for+mitogen-stimulated+T+and+B+cell+responses+in+human+peripheral+blood%3A+delineation+by+its+sensitivity+to+the+lysosomotropic+agent%2C+L-leucine+methyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester.</a> J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).</li>
<li>Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+glia+release+factors+with+opposing+actions+upon+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival.</a> J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).</li>
<li>Guillemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtention+and+characterization+of+primary+astrocyte+and+microglial+cultures+from+adult+monkey+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains.</a> J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).</li>
<li>Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+expression+in+cultures+enriched+for+mature+oligodendrocytes+is+due+to+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia.</a> J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).</li>
<li>Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+p53+activation+is+detrimental+to+neuronal+sysnapses+during+activaton-induced+inflammation%3A+implications+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration.</a> Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).</li>
<li>Frade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+induces+release+of+glutathione+from+cultured+rats+astrocytes+%E2%80%93+a+possible+neuroprotective+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism.</a> J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).</li>
<li>Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+improved+procedure+for+the+removal+of+microglia+from+confluent+monolayers+of+primary+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).</li>
<li>Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+release+activators+of+neuronal+proliferation+mediated+by+activation+of+mitogen-activated+protein+kinase%2C+phosphatidylinositol-3-kinase%2FAkt+and+delta-Notch+signalling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades.</a> J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).</li>
<li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures%3A+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).</li>
<li>Kumamaru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+clodronate+selectively+eliminates+microglia+from+primary+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures.</a> J Neuroinflamm. 9, 116(2012).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

En önemli adımlar CGC gelen mikroglia başarılı bir şekilde seçici olarak ortadan kaldırılmasını sağlamak için ve / veya karışık kültürler: 1) steril ve sağlıklı CGC kültür muhafaza edilmesini; 2) Filtre LME içeren ortamı sterilize ve pH 7.4 çözüm dönen; 3) muhafaza CGC medyayı tutmak ve 37 ° C&#39;de medya LME içeren Isı çarpmasını önlemek için C °; ve 4) hücreler inkübatör dışında tutulur süresini azaltmak için hızlı çalışıyor. Daha önce laboratuarımızda optimize bir konsantras...

İnsan beyni tahmini 85000000000 nöron ve glial 1 de dahil olmak üzere 85000000000 bir başka nöronal-olmayan hücreleri ihtiva eder. Olarak İngilizce&#39;ye tercüme &#39;glia&#39; dolayısıyla Yunan etimolojisi - sinirbilimciler nöronal hücre popülasyonu üzerinde ağırlıklı olarak odaklanmıştır son 100 yıl daha fazla parçası için, glial hücreler inanan nöronlar için yapısal destek sağladı pasif destek hücreleri biraz daha fazla olması &#39;tutkal&#39;. Son zamanlarda, ancak nöronal-glial etkileşimleri nörobiyoloji, nörofizyoloji ve birçok nörodejeneratif hastalıkların oluşumu ve ilerlemesinde temel yönlerine çok daha temel olabileceğini giderek daha belirgin hale gelmiştir. Serebellar granül hücreleri (CGCs), insan beyninde en bol homojen nöronal nüfus, beyincik hakim ve hücresel bileşenlerin% 90&#39;ından fazlasını oluşturuyor. Sonuç olarak, bu hücreler, t için bir model sistem olarak in vitro kapsamlı olarak kullanılmaktadırO nöronal gelişim, işlev ve patoloji 2-6 çalışma. Bununla birlikte, CGC kültürleri halen en önemli oranlarda mikroglia ve glia içerir. Sonuç olarak, varsayım olarak farklı hücre tedavilere doğrudan nöronal yanıt veren CGC veriler, aslında ortaya çıkabilecek - kısmen veya toplam - kültürde glia komşu dolaylı, ikincil karşılık gelen. Bu değerlendirme için, seçici olarak, L-lösin metil ester (LME) yardımı ile CGC nöronal kültürlerde mikrogliyal ortadan kaldırmıştır. LME orijinal seçici makrofajlar 7 yok etmek için kullanılan bir lysomotropic madde olduğu için ve aynı zamanda seçici olarak nöral, astrosit ve karışık glial kültürler 8,9,10 gelen mikroglia tüketmek için kullanılmıştır. LME o lizozomal bozulması ve sonraki apoptoz 13,14 sebep olup, makrofajlar ve mikroglia tarafından içselleştirilir. Makrofajlar ve mikroglia onları particula olmaya neden lizozomlarda karakteristik zenginLME tedavisine maruz kalma üzerine rly hassas. Bu protokol GCG&#39;ye ve diğer nöronal / glial kültür sistemleri kullanılarak deneylerde mikroglia katkısını araştırmak için güçlü, henüz basit ve kolay bir yol sağlar.

<table><tbody><tr><td>Forseps&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td>Kavisli uç, beyinciğin çıkarılmasını kolaylaştırır&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikro diseksiyon makası</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146</td><td>Düz, keskin nokta kemirgen P4-7 diseksiyonunu kolaylaştırır&nbsp;</td></tr><tr><td>L-lösin metil ester hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7517-19-3</td><td></td></tr><tr><td>EBSS çözeltisi&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7510-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27964-99-4</td><td>Kullanımdan 1 gün önce ceket lameller&nbsp;</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Soya fasulyesi tripsin inhibitörü ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6414</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-ED1 antikoru&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab31630</td><td></td></tr></tbody></table>

beyindeki granü hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatılması, l-lösin metil ester

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

MSS'nin yerleşik immünokompetan hücreleri olan mikroglia, nöronal fonksiyonu modüle etmede ve kontrol etmede ve ayrıca doğuştan gelen bağışıklığa aracılık etmede çok yönlü roller oynar. Birincil kemirgen hücre kültürü modelleri, nöronal-glial etkileşimler hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde geliştirmiştir, ancak son zamanlarda karışık kültürlerden mikroglia'yı spesifik olarak ortadan kaldırmak için yöntemler kullanılmıştır. Burada açıklanan böyle bir teknik, makrofajlar ve mikroglia tarafından içselleştirilen ve burada lizozomal bozulmaya ve ardından apoptoza neden olan bir lizomotropik ajan olan L-lösin metil esterin kullanılmasıdır13,14. L-lösin metil ester kullanılarak yapılan deneyler, mikroglia'nın çeşitli kültür koşulları altında çevredeki hücresel ortama katkısını belirleme gücüne sahiptir. Laboratuvarımızda optimize edilmiş bir protokol kullanarak, P5 kemirgen serebellar granül hücre kültüründen mikroglia'nın nasıl ortadan kaldırılacağını açıklıyoruz. Bu yaklaşım, mikroglia'nın deneysel veriler üzerindeki göreceli etkisinin değerlendirilmesine ve ayrıca mikroglia'nın inme, Alzheimer veya Parkinson hastalığı gibi nörolojik durumların kültür modellerinde nöroprotektif veya nörotoksik bir rol oynayıp oynamadığını belirlemeye olanak tanır.

seçici CGC ve / veya karışık kültürlerden mikroglia ortadan kaldırmak için bu tekniğin yeteneği doğru tespit etmek ve bunların çevredeki hücrelerden mikroglia ayırt etmek araştırmacının sonraki yeteneğine dayanır. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, bu, örneğin isolectin-B4 gibi bir mikroglial spesifik hücre makinesi kullanılarak elde edilebilir. Şekil 2&#39;de de gösterildiği gibi, astrosit ve nöronal yoğunluk ve morfolojisi gözlenebilir bir değişiklik, her ana tedavi grubu ile ilgili o...

Microglia, çeşitli hücre dışı otonom mekanizmalarla kültürdeki nöronları ve diğer gliaları etkileyebilir. Burada, primer nöronal kültürlerden mikroglia'yı seçici olarak tüketmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, mikroglial-nöronal etkileşimlerin rolünü aydınlatma potansiyeline sahiptir ve nöroinflamasyonun ayırt edici bir özellik olduğu nörodejeneratif durumlar için çıkarımlar vardır.

Beyindeki granü hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatılması, L-lösin metil ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Bu prosedürün genel amacı, sella granül hücre kültürlerinden mikroglial hücreleri seçici olarak uzaklaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle bir cgc popülasyonunun kültüre edilmesi ve %6 karbondioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatörde saklanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, MEM ortamında 150 millimolar LME nihai konsantrasyonu sağlayacak şekilde bir LME çözeltisi hazırlamaktır.CGC kültürlerindeki MEM ortamının sonraki yarısı uzaklaştırılıp inkübatörde tutulur; ardından CGC kültürleri, MEM ortamı içeren eşit hacimde LME ile değiştirilir ve 37 °C sıcaklıkta, %6 karbondioksit içeren inkübatöre bir saat boyunca yerleştirilir. Son adım, CGC kültürlerinin önceden ısıtılmış taze MEM ortamı ile iki kez yıkanmasıdır.Kültür ortamını eşit hacimde taze besiyeri ile değiştirin ve ardından hücreleri, daha fazla işlem uygulamadan önce 24 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Son aşamada, serebellar granüler hücre kültürlerinden mikroglial hücrelerin spesifik olarak eksiltildiğini göstermek için immünokimya ve floresan mikroskopi kullanılır. Bu yöntem, mikrogliaların çeşitli koşullar altında nöronlar üzerinde ne gibi etkileri olduğu ve bu etkilerin Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif bozuklukların anlaşılması açısından ne anlam taşıdığı gibi nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Genel olarak, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, primer kültürlerle çalışmanın doğruluk ve hız gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Bu prosedüre, dört ila yedi günlük sıçan yavrularından cerebellaları toplayarak başlayın. Bunları derhal, buz üzerinde beş milliliters çözüm A içeren bir Petri kabına yerleştirin.Ardından, serebellumlardan fazla çözeltiyi uzaklaştırın ve dokuyu Petri kabı kapağına yerleştirin. Sonrasında, dokuyu kaliteli bir jiletle en az üç farklı yönde ince ince kıyın. Takiben, kıyılmış dokuyu çözelti B'ye ekleyin. 37 °C'deki bir su banyosuna beş dakika boyunca yerleştirin ve birkaç dakikada bir nazikçe çalkalayın.Ardından, tripsini nötralize etmek için tüpe 20 milliliters çözelti D ekleyin ve santrifüjde 60 5G hızında beş dakika boyunca çalkalayın. Sonrasında, S süpernatanını dökün ve dört milliliters çözelti CT içinde yeniden süspanse edin. Süspansiyon mümkün olduğunca homojen hale gelene kadar, çapı giderek azalan alevle sterilize edilmiş üç cam pipetin her biriyle örneği 10 kez tritüre edin.Ardından, bu homojenattan birkaç damlayı yavaşça ve nazikçe B-S-A-E-B-S-S üzerine ekleyin; eğer homojenat B-S-A-E-B-S-S üzerinden çökmeye başlarsa, daha fazla titre edin ve biraz daha çözelti C ekleyin. Homojenat, B-S-A-E-B-S-S üzerinde bir tabaka halinde durmalıdır. Çalkalamadan, 100 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Daha sonra süpernatantı uzaklaştırın ve pelletini yeniden süspande edin.Bir mililitre MEM ortamı içerisinde, hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın ve her lam üzerine 800,000 hücre olacak şekilde ekin. Ardından 500 microliters MEM ortamı ekleyin ve bunları 37 degrees Celsius sıcaklıkta ve %6 carbon dioxide içeren bir inkübatöre yerleştirin. Daha sonra, 10 micromolar hücre döngüsü inhibitörü RC içeren bir MEM ortamı çözeltisi hazırlayın. Her lam için, yeni bir 24 kuyucuklu plakada eski ortamdan 250 microliters tutun ve geri kalanını aspire edin.Hücreleri yıkamak için 250 µL normal MEM besiyeri ekleyin. Ardından, hücrelerin üzerine 250 µL eski besiyeri ekleyin ve üzerine 250 µL RSE içeren besiyeri ilave ederek tamamlayın. Bu prosedürde, 150 mM LME nihai konsantrasyonu elde etmek için beş mL MEM besiyerine saf LME ekleyin.Asit bazlı solüsyon kullanarak çözeltiyi pH 7.4 değerine geri getirin. Ardından, 0,2 mikrometre gözenekli 28 milimetrelik PES şırınga filtresi kullanarak steril filtreleyin. Sonrasında, LME solüsyonunu MEM besiyerinde 50 milimolar konsantrasyona seyreltin.Ardından, kontrol kültürleri için kullanılan normal MEM ortamı ile birlikte 37 °C'deki su banyosunda 10 dakika bekletin. 10 dakika sonra, her bir CGC kültüründen 250 µL MEM ortamı alın. Daha sonra ortamları 37 °C'de muhafaza edin.Ardından, hücreleri iki kat LME içeren MEM ortamı ile veya LME içermeyen önceden ısıtılmış MEM ortamı ile muamele edin. Kontrol kültürleri için hücreleri 37 °C'de, %6 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde bir saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, LME içeren ortamı uzaklaştırmak için hücreleri taze, önceden ısıtılmış MEM ortamı ile iki kez yıkayın. Daha sonra, mevcut kültür ortamını eşit miktarda taze, önceden ısıtılmış MEM ortamı ile değiştirin.Son olarak, kültürleri herhangi bir ek işlemden önce 37 derece Celsius'ta %6 nemlendirilmiş karbondioksitte 24 saat boyunca inkübe edin. Bu şekil, CGC kültürleri üzerinde 25 ila 75 milimolar LME ile bir saatlik işlem ve ardından yıkama sonrası gerçekleştirilen deneylerden elde edilen temsili görüntüleri göstermektedir. Toplam hücre sayısının ve apoptotik morfoloji sergileyen hücrelerin nicelendirilmesi için DPI ile, mikroglial tanımlama ve nicelendirme için ise ISO lectin B four ile immünokimya uygulanmıştır. Bu grafik, apoptotik morfoloji sergileyen hücrelerin nicelendirmesini göstermektedir; burada yer alanlar, 25 milimolar LME ile bir saat boyunca işlem gören CGC kültürleri üzerinde gerçekleştirilen deneylerden elde edilen temsili görüntülerdir.Nöronal yoğunluktaki değişimlerin belirlenmesi için DAPI ve anti beta three tubulin, astrositik yoğunluk ve morfolojideki değişimlerin belirlenmesi için ise anti GFAP kullanılarak immünokimya gerçekleştirilmiştir. Negatif kontrol görüntüleri, primer antikorların eklenmediği CGC kültürlerini temsil etmektedir. Bu teknik, yeterince deneyim kazanıldıktan sonra, doğru şekilde uygulandığında yaklaşık iki saatte tamamlanabilir.

selective-depletion-microglia-from-cerebellar-granule-cell-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Video, yetişkin bir fare beyninin korteksinden mikroglia'yı izole etmek için bir tekniği göstermektedir. İlk olarak, korteks, mikroglia'yı koruyarak nöronları ve diğer glial hücreleri uzaklaştırmak için segmentasyon ve homojenizasyona uğrar. Bunu takiben, hücre süspansiyonu, anti-miyelin manyetik mikro boncuklara ve bir manyetik alana maruz bırakılır, bu da mikroglia ve miyeloid hücreleri miyelin kalıntılarından ve miyelin içeren hücrelerden etkili bir şekilde ayırır.

Mikroglia'nın Yetişkin Bir Fare Beyninin Korteksinden İzolasyonu

Bu video, birincil fare serebellar granül nöronlarını izole etme ve kültürleme tekniğini göstermektedir. Hücreler, çoğalan glial hücreleri ortadan kaldırmak ve saf bir serebellar granül nöron kültürü üretmek için bir antimetabolit ile muamele edilir.

Fare Primer Serebellar Granül Nöronlarının İzolasyonu ve Kültürü

Bu video, birincil sıçan nöronal kültüründen mikroglia'nın seçici olarak çıkarılması için bir tekniği göstermektedir. Serebellar granül nöronları, çoğalan glial hücreleri ortadan kaldırmak için bir antimetabolit ile tedavi edilir. Ek olarak, kültürden mikroglia'yı tüketmek için lizozom hedefleme ajanları ile tedavi edilirler.

Sıçan Serebellar Granül Nöron Kültüründen Mikroglia'nın Seçici Olarak Çıkarılması

Bu video, manyetik hücre sıralama kullanarak fare beyinlerindeki demiyelinizan lezyonlardan mikroglial hücrelerin çıkarılması için bir protokolü göstermektedir. Protokol, mikroglial hücreler içeren lezyonlu beyin dokusunun diseksiyonunu, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için dokunun spesifik enzimlerle tedavi edilmesini ve mikroglial hücreleri izole etmek için mikroglial reseptöre özgü manyetik boncukların kullanılmasını içerir.

Manyetik Aktif Hücre Sıralaması Kullanılarak Fare Beyni Demiyelinizan Lezyonlarından Mikroglia'nın İzole Edilmesi

Bu video, fare birincil serebellar granül nöronlarında reaktif oksijen türleri (ROS) kullanılarak bir nöronal yaralanma modelinin oluşturulmasını özetlemektedir. Yüksek konsantrasyonlarda hidrojen peroksit ekleyerek oksidatif stresi indükleme sürecini detaylandırır. ROS maruziyeti DNA ipliği kırılmalarına ve genomik instabiliteye neden olur. Ek olarak, hücresel proteinlerin oksidasyonu işlevlerini bozarken, lipid peroksidasyonu membran bütünlüğünü tehlikeye atar. Bu kaskad, sitokrom c...

Fare Serebellar Granül Nöronlarında Reaktif Oksijen Türlerinin Neden Olduğu Nöronal Ölümün Modellenmesi

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Bu protokol, nörobilim ve nörofarmakoloji araştırmalarında in vitro bir model olarak kullanılan birincil nöronal kültür olan kültürlenmiş serebellar granül nöronlarında Fluorescein diasetat (FDA) ve Propidyum İyodür (PI) çift boyasını kullanarak nöronal canlılığı nasıl doğru bir şekilde ölçtüğümü açıklamaktadır.

Serebellar Granül Nöron Kültüründe Floresan Diasetat-Propidyum İyodür Çift Boyama Kullanarak Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi

Bu iletişim kuralı yalıtma ve birincil fare serebral granül neurons (CGNs) 6-7 gün eski pups, CGNs kaybı için verimli iletim ve kazanç işlevi çalışmalar, kültür ve nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı modelleme için basit bir yöntem açıklar, düşük potasyum indüklenen hücre ölümü, DNA hasarı ve oksidatif stres aynı kültür modelini kullanarak.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Burada, kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı kullanarak, demiyelinizan hastalıkların hayvan modellerinde birincil mikrogliayı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Öğrenin, L-lösin metil ester kullanarak serebellar granül hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatma yöntemini. Bu protokol, nöroinflamasyon ve nörodejeneratif hastalıklarda mikroglia-nöron etkileşimlerini araştırmak için değerli bir araçtır.

Beyindeki granü hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatılması, L-lösin metil ester

Daha fazla video keşfet