Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma Drosophila Embriyolar

Bu prosedürün genel amacı, drosophila embriyolarında translasyon yapan RNA'yı hücre tipine özgü bir şekilde izole etmektir. Bu, ilk olarak transgenik bir sinek hattından embriyoların toplanmasıyla gerçekleştirilir ve hedeflenen hücre tipinde, bu durumda kambur kas hücrelerinde GFP etiketli bir ribozomal alt birimin spesifik ekspresyonuna izin verir. İkinci adım, etiketli ve etiketsiz ribozomların bir karışımını içeren bir polizom preparatı elde etmek için bir lizat oluşturmaktır.

Daha sonra, lizattaki protein konsantrasyonu tahmin edilir ve ilgilenilen hücre tipinden ribozom RNA komplekslerini yakalamak için GFP antikorlarına bağlı boncuklarla afinite saflaştırması gerçekleştirilir. Son adım triol, RNA, ekstraksiyon ve saflaştırmaya ayrılmıştır. Sonuç olarak, kalite ve özgüllük değerlendirmeleri sırasıyla bir biyoanalizör ve R-T-Q-P-C-R ile gerçekleştirilir.

RNA daha sonra RNA dizilimi veya mikrodiziler ile küresel kantitatif analiz için kullanılabilir. Mevcut yöntemimizin bu tekniğinin temel avantajı, VX sıralama gibi, hücre ayrışması için bir labo adım gerektirmemesidir. Tezgah üzerinde yapılabilir.

Hızlıdır ve çok küçük hücre popülasyonunda çevrilmiş RNA'nın doğrudan tanımlanmasına izin verir, bu da hücre özelliklerinin kazanılmasının anlaşılması için bir ölçü avantajıdır. Bu yöntem Josephine embriyosundaki miyogenez hakkında bilgi verebilse bile, bitki, zebra, balık veya fare gibi diğer doku veya modern organizmalara da uygulanabilir ve patoloji durumunda tedavinin protein sentezi üzerindeki etkisini takiben yardımcı olabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Benjamin Berta olacak Mühendislikten sonra, hem protokolün yazılı kısmındaki talimatlara göre hem transgenik hatlar hem de tuzak çift çapraz transgenik hattı oluşturmak için çaprazlama, önce kafes başına yaklaşık 40 gram genç sinek içeren sekiz büyük silindirik popülasyon kafesi hazırlayarak hattı güçlendirin, bu da kafes başına yaklaşık 180.000 sineğe karşılık gelir.

11 santimetre çapında, katılaşmış agar ve üzüm suyu karışımı içeren, yüzeyinin üçte biri taze yapılmış maya ezmesi ile kaplanmış petri kapları hazırlayın ve sineklerin bu tabaklara bir saat boyunca yumurta bırakmasına izin verin. Sineklerin patateslerini tamamen boşaltmalarını sağlamak için bu işlemi iki set taze üzüm suyu tabağı üzerinde tekrarlayın. Haçtan istenen çift transgenik embriyolar dördüncü plakaya yerleştirilecektir.

İstenilen embriyoları içeren plakaları kafeslerden çıkarın ve oda sıcaklığında istenen gelişim aşamasına kadar inkübe etmelerine izin verin. Burada 13 saatlik bir inkübasyon kullanılır. Ardından, plaka içeriğini bir fırça kullanarak yaklaşık 50 mililitre su ile yeniden süspanse edin.

Sıvıyı 700, 355 ve 112 mikron çapında üç elekten geçirerek embriyoları ölü sineklerden ayırın. Toplanan embriyoları en küçük çaplı elekte iyonize su ile durulayın. Embriyoları iyonize suda% 4.5 ağartıcı içinde iki dakika bekletin ve ardından iyonize su ile 30 ila 60 saniye boyunca iyice durulayın.

Embriyoları mililitre başına 20 ila 100 mikrogram arasında PBS% 0.01 T'de inkübe edin. Çalkalama ile oda sıcaklığında beş ila 10 dakika boyunca siklo heide. Embriyoları selüloz emici tabakalar üzerinde kuruttuktan sonra, bunları mikro santrifüj tüplerine aktarın, daha sonra tüpleri tartın ve flaşlayın, embriyoları sıvı nitrojene batırarak dondurun.

Bu aşamada, kurutulmuş embriyolar eksi 80 santigrat derecede birkaç ay saklanabilir. Kurutulmuş embriyoların 1.5 gramını önceden soğutulmuş 15 mililitrelik tüplere aktarın, dört mililitre polizom ekstraksiyonu içerir, tamponlayın ve homojenize edin. Steril 10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak.

Daha sonra homojenize embriyoları iki ön soğutma, iki mililitrelik tüplere yayın ve embriyoları çok yönlü hızlı hızlı bir boncuk öğütücüde öğütün. Her döngü arasında 15 saniyelik bir duraklama ile 5.000 RPM'de 10 saniye boyunca iki kez çalışacak şekilde ayarlayın. 2000 G'de 10 dakikalık santrifüjlemeden sonra, lizatı buz üzerinde önceden soğutulmuş taze bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

S süpernatantına %0.1'lik bir nihai konsantrasyona %10 olmayan P 40 ekleyin ve tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın. 30 milimolar nihai konsantrasyona 300 mikromolar DHPC ekleyin ve tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın. Karışımı buz üzerinde beş dakika inkübe edin, inkübasyon sırasında birkaç kez ters çevirerek karıştırın.

Buzda inkübasyonun ardından. Post mitokondriyal supinatı, 20.000 G'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleme ile hazırlayın.Bradford Yöntemi ile protein konsantrasyonunu ölçtükten ve mililitre başına 60 ila 80 miligram arasında bir protein konsantrasyonu elde ettikten sonra, SNAT'ı taze bir önceden soğutulmuş mikro santrifüj tüpüne aktarın ve hemen ön absorpsiyon adımına geçin. Manyetik boncukları hafif çalkalama ile yeniden süspanse edin ve ardından her mililitre lizat için 30 mikrolitre boncuk bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Mıknatıs üzerindeki boncukları toplayın, snat'ı pipetleyin ve boncukları ve 500 mikrolitre polizom ekstraksiyon tamponunu yeniden süspanse edin. Ardından, mıknatısın üzerindeki boncukları toplayın. Yine, embriyonik, lizat ekleyin ve bir döndürücü üzerinde dört santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Boncukları çıkarın ve sırtüstü ajanı immüno-saflaştırma adımına kadar buzun üzerine yerleştirin. Numuneyi immüno-saflaştırmak için immüno-saflaştırmadan sonra toplanan numune ile karşılaştırmak için global RNA numunesi olarak 100 mikrolitre supinat ayırarak, GFP antikoruna bağlı 90 mikrolitre bloke boncuk içeren RNA içermeyen bir tüpe bir mililitre önceden emilmiş lizat ekleyin. Numuneyi dört santigrat derecede iki saat veya gece boyunca inkübe edin, inkübasyonu takiben bir tüp döndürücüde uçtan uca yumuşak bir şekilde karıştırın.

Önce kalan boncukları bir mini santrifüjde döndürerek boncukları yıkayın. Daha sonra bir mıknatıs üzerinde toplayın, 500 mikrolitre yıkamada yeniden süspanse edin, tamponlayın ve tekrar tekrar inkübe edin. Soğuk odada 10 dakika karıştırmayı sonlandırın ve tekrar boncukları mıknatısın üzerinde toplayın.

Boncukları yeni bir ön kalkan R RNA içermeyen tüpe aktarın ve iki kez daha yıkayın. Son olarak, boncukları mıknatıs üzerinde topladıktan sonra, boncuklara bir mililitre TRIOL ekleyerek ve üreticinin talimatlarına göre ekstraksiyon yaparak RNA ekstraksiyonuna devam edin. Bunu, üreticinin talimatlarına göre bir RNEZ mikro kiti kullanarak RNA temizliği ile takip edin.

Sıkışan RNA'nın özgüllüğünü test etmek için, standart prosedürlere göre üç nanogram immüno-saflaştırılmış ve giriş RNA'sı üzerinde ters transkripsiyon yapın. Daha sonra QPCR için elde edilen CDNA'yı gene özgü primer setleri ile kullanın. Evre 16 embriyonun bu konfokal görüntüsü, RPL 10 A-E-G-F-P ekspresyonunu gösterir, özellikle her bir HEMI segmentindeki altı kambur kas hücresinde, RPL 10 A-E-G-F-P'nin genel kas belirteci beta üç tübülin ile kolokalizasyonu gözlenir.

Sıkışan RNA, kalite kontrol amacıyla bir biyoanalizör üzerinde çalıştırıldı. Bir sekiz s ve iki sekiz s ribozomal RNA'nın mükemmel bütünlüğüne dikkat edin. Bu şekil, evre 16 embriyolarının üç biyolojik kopyası üzerinde bir RT QPCR analizinin sonuçlarını göstermektedir ve tuzak izole mRNA'nın yüksek özgüllüğünü göstermektedir.

FO değişimi, girdiye kıyasla hesaplandı ve RPL 32 gen metamfetaminine karşı normalize edildi. Tüm kas soylarında bulunan iki transkript, girdiye kıyasla 2.3 kat zenginleştirilmiş iken, daha kısıtlı kambur transkriptler, prospero ve socks eksprese eden 5.6 kat zenginleştirilmiş nöral hücrelerdir ve genler, gelişiminden sonra sırasıyla 2.2 kat ve 5.5 kat tükenir. Bu teknik, özellikle gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların, doof embriyolarının farklılaşması sırasında kendi kendine yardım taahhüdünü ve hücre özelliklerinin kazanılmasını keşfetmelerinin yolunu açtı.