Nanoparçacık Toksisite Testi için Kupffer hücre izolasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, nanopartikül toksisitesini incelemek için yüksek sayıdaki hücreler için fare kabını izole etmek ve saflaştırmaktır. Bu, fare karaciğerlerinin bir H-B-S-S-E-G-T-A çözeltisi ve karaciğer dokusunu nazikçe sindirmek için bir çözelti olan bir kollajen ile perfüze edilmesiyle elde edilir. Daha sonra karaciğer hücreleri, hücreler için saflaştırılmış bir kap kültürü elde etmek için yoğunluk, santrifüjleme ve seçici yapışma ile saflaştırılır.

Daha sonra hücreler için kabın saflığını ve F asidik özelliklerini doğrulamak için akış sitometrisi analizi yapılır. İşlevselleştirilmiş karbon nano tüp toksisitesinin hücreler için kapta ölçülebileceğini gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu modelin nanopartikül toksisite testine uygulanabileceğini destekleyen modifiye edilmiş LDS'ye dayanmaktadır.

Bugün size göstermeyi amaçladığımız yöntem, yakın zamanda geliştirilen ilaç taşıyıcılarının toksisitesini değerlendirmek gibi nano toksikoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, bu oldukça önemlidir, çünkü kullanılan ölümsüzleştirilmiş hücre dizilerinin çoğu, türetildikleri dokulardan önemli ölçüde farklı özellikler gösterir. Bu yöntemin görsel bir gösterimi çok önemlidir. Yöntem başarılı bir şekilde gerçekleştirilirse, daha sonra bu toksisite için bir dizi nanopartikülü taramak için bir model olarak kullanılabilecek yüksek bir verim ve saflıkta ke hücresi elde edilmesine neden olacaktır.

Ekteki metin protokolüyle birlikte bulunan malzeme ve reaktifler tablosunda listelenen tüm reaktifleri taze olarak hazırladıktan sonra, E-G-T-A-H-B-S-S solüsyonunu ve kollajenaz solüsyonunu 40 santigrat derecede 30 dakika ısıtın, pompa esnek borusunu durulamak için% 70 etanol kullanın. Daha sonra 40 mililitre E-G-T-A-H-B-S-S çözeltisini su banyosuna batırılmış bir santrifüj tüpüne dökün ve pompa esnek borusunu durulamak için ön ısıtmalı E-G-T-A-H-B-S-S'yi kullanın. Bir CD'yi ötenazi yaptıktan sonra, metin protokolüne göre, karın kıllarını tıraş edin ve karın yüzeyini dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın.

Anesteziyi ayak parmağınızı sıkıştırarak onaylayın. Karın boşluğunu kesin ve bağırsağı karnın soluna lateral olarak hareket ettirerek portal ven ve inferior vena kava'yı ortaya çıkarın. Pompayı E-G-T-A-H-B-S-S solüsyonu ile dakikada bir ila üç mililitre hızında başlatın ve 23 gauge kelebek iğne ile portal veni kanüle edin, portal venin kanüllü kısmını kelepçeleyin ve ardından açılan fare karnının yüzeyindeki sinüs forsepslerini çevirin.

Karaciğer, perfüzyonun ilk 30 saniyesi içinde soluklaşmalı, karaciğerde aşırı basınç oluşmasını önlemek için inferior vena kavanın alt kısmını hızla kesmeli ve perfüzyonun ilk dakikasında akış hızını kademeli olarak dakikada yedi mililitreye çıkarmalıdır. Santrifüj tüpünde beş mililitreden daha az E-G-T-A-H-B-S-S çözeltisi kaldığında. Bir çözelti için 40 ila 50 mililitre kollajen ekleyin, ardından akış hızını 30 saniye boyunca kademeli olarak dakikada 10 mililitreye yükseltin.

İnferior vena kavaya 10 ila 32. aralıklarla periyodik olarak basınç uygulamak için cımbız kullanarak karaciğeri şişirin. Bu, hücre ayrışmasını iyileştirecek ve kollajenaz ile perfüzyon süresini azaltacaktır. Santrifüj tüpü içinde 10 mililitreden daha az kollajenaz çözeltisi kaldığında, tüpe 40 ila 50 mililitre daha ön ısıtılmış kollajenaz çözeltisi ekleyin.

Daha sonra 70 ila 80 mililitre perfüze edildikten sonra, yüzeye hafif basınç uygulamak için forseps kullanın. Bir depresyon işareti, karaciğer hücrelerinin ayrıştığını gösterir. Karaciğeri karın boşluğundan tek parça olarak çıkarın ve hücre izolasyonu için 20 ila 30 mililitre fincan içeren bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Orta.

Karaciğer hücrelerini üç saate kadar buzda tutun ve hücreler için kabı arındırmak için saflaştırma için üç karaciğeri bir araya getirin. Perfüze edilmiş bir karaciğeri, hücre izolasyonu için 15 mililitre fincan, makas veya cımbızla orta olan bir Petri kabına yerleştirin. Parıldayan kapsülü yırtın ve tüm karaciğer hücrelerini ortama bırakın.

Çözeltiyi 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden bir santrifüj tüpüne süzün. Daha sonra hücre süspansiyonunu 50 GS'de dört santigrat derecede iki dakika santrifüjleyin. Parankimal hücreler peletin içinde olacak ve parankimal olmayan hücreler süpernatantın içinde olacaktır.

Süpernatanı temiz bir santrifüj tüpünde toplayın ve iki dakika boyunca 50 gs'de santrifüjleyin. Toplam dört transfer ve döndürme için tekrarlayın. Sonraki santrifüj.

15 dakika boyunca 1, 350 GS'de süpernat. Parankimal olmayan hücreleri peletlemek için, süpernatı atın ve peleti hücre izolasyon ortamı için 10 mililitre fincan içinde yeniden süspanse edin, parankimal olmayan hücre çözeltisini daha önce metin protokolüne göre hazırlanan süreksiz 25% 50 izotonik gradyana ekleyin ve 850 GS'de 15 dakika boyunca hızlanma veya kırılma olmadan santrifüjleyin. 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, %25 SIP fraksiyonu içinde bulanık görünen hücre fraksiyonu için zenginleştirilmiş kabın yaklaşık 12 mililitresini %25 50 SIP arayüzüne yakın aspire edin.

Hücreleri, hücre izolasyonu için 35 ila 40 mililitre fincan içeren bir santrifüj tüpüne aktarın, orta ve nazikçe karıştırın, ardından hücreleri pelet yapmak için 1, 350 GS ve dört santigrat derecede santrifüjleyin, süper adlandırılanları atın ve hücreleri bir hemo sitometre ile yeniden süspanse etmek için beş ila 10 mililitre ön ısıtma ortamı kullanın. Hücreleri sayın ve canlılık plakasını ölçmek için trian mavisi boyama kullanın. Saflaştırılmış parankimal olmayan hücreler, 24 oyuklu plakalarda, oyuk başına beş kez 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda bir yoğunlukta.

Hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 30 dakika inkübe edin. Ardından ortamı yavaşça çıkarın. Hücreleri yıkamak için ön ısıtma HBSS'yi kullanın ve hücre kültürü ortamı için taze ön ısıtma kabı başına 500 mikrolitre ile değiştirin.

Nanopartikül parçacıkları ile işlemden önce hücrelerin yapışmasını sağlamak için hücreleri en az dört saat boyunca 37 santigrat dereceye geri getirin. C'nin hücreler için saflığını ve fagositik aktivitesini karakterize ettikten ve metin protokolünde belirtildiği gibi işlevselleştirilmiş, karbon nanotüpler veya fct'ler ile inkübe ettikten sonra, süpernatanı atın ve lizis tamponu kuyusu başına 200 mikrolitre ekleyin. 37 santigrat dereceyi 30 ila 60 dakika inkübe edin, kuvvetli pipetleme yapın ve mikro santrifüj tüplerindeki hücreler için yalan söyleyen kabı toplayın.

Daha sonra, hücre kalıntıları üzerindeki hücreler tarafından alınan fcn ts'yi çıkarmak için 10 dakika boyunca 20.000 GS'de santrifüjleyin. Süpernatanı mikro santrifüj tüplerine toplayın ve eksi 20 santigrat derece saklayın. Alternatif olarak, 50 mikrolitreyi 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve laktat dehidrojenaz kitinden eşit hacimde substrat karışım çözeltisi ekleyin.

50 mikrolitre lizis tamponu ve 50 mikrolitre substrat karışım çözeltisi içeren üç adet boş kuyu ekleyin. Daha sonra plakayı örtün ve 50 mikrolitre durdurma çözeltisi eklemeden önce oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Son olarak, bir mikroplaka okuyucuda 490 nanometredeki absorbansı okuyun ve hücre canlılığı yüzdesini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın.

Bu şekil, saflaştırılmış parankimal olmayan hücrelerin sayısının, fare ve trian başına sekiz ila 14 çarpı 10 ila altı hücre arasında değiştiğini göstermektedir. Mavi boyama yaklaşık% 95 hücre canlılığı gösterdi. Hücreler için yapışık kap, inkübasyondan sonraki 30 dakika içinde yuvarlak bir şekil aldı ve dört saat sonra hücreler yayıldı ve burada görüldüğü gibi kümeler oluşmaya başladı.

Hücreler, akış sitometrisi ile %95'in üzerinde ölçülen hücre saflığını göstermek için F four 80 antikoru ile boyandı. Ek olarak, kültürde 12 saat sonra, düşük sitometri analizi, hücrelerin% 85'inin bir mikrometre floresan boncuk alma yetenekleri ile PHA asidik aktiviteye sahip olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, bu sayı, hücrelerin sadece% 40'ının burada gösterildiği kültürde 72 saatte düştü.

24 ve 72 saat boyunca işlevselleştirilmiş karbon nanotüplerle inkübe edilen hücreler için fincan, saf hücrelere kıyasla benzer morfolojilere sahipti. Buna karşılık, pozitif kontrol olarak kullanılan% 10 DMSO ile inkübe edilen hücreler için kap, 24 ve 72 saat boyunca% 10 DMSO ile tedavi edilen hücreler için modifiye LDH tahlil kabının analizini takiben nekrotik bir morfoloji sergiledi, karşılaştırıldığında yüksek toksisite gösterdi, fcts, hücreler 72 saat boyunca mililitre başına 50 mikrograma maruz kaldıklarında hücre canlılığında hafif ama önemli bir azalmaya neden oldu. Bu yöntemi takiben, diğer hücre bazlı SC ve tüm nanopartikül türleri, izole edilmiş ke hücreleri kullanılarak test edilebilir.

Bu, hayvanların kullanımını en aza indirirken güvenilir verilerin toplanmasını sağlar. Bu tekniğin, nanoteknoloji psikolojisi alanındaki araştırmacıların, giderek daha fazla geliştirilmekte olan birçok umut verici nano taşıyıcının güvenliğini taramalarına yardımcı olabileceğini umuyoruz.