Name: Nanoparçacık Toksisite Testi için Kupffer hücre izolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin fare karaciğerinden Kupffer hücre izolasyonu ve yoğunluk santrifüjasyonu ile nanoparçacık toksisite testi. Bu yöntem yüksek saflıkta hücre sağlar ve karbon nanotüp toksisitesini değerlendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma AB FP7-ITN Marie-Curie Ağı programı RADDEL tarafından desteklenmiştir. MB ve KAJ, Kupffer hücre izolasyonunun optimizasyonu konusundaki yardım ve önerileri için Joe Varguese ve Rui Serra Maia'ya teşekkür eder.

Tüm hayvan deneyleri ilgili tüm kurallar, yönetmelikler ve düzenleyici kurumlar ile uyum içinde idam edildi. protokol UK Home ofis düzenleme rehberlik ve onayı altında gerçekleştirildi gösterdi ediliyor 1. Perfüzyon ve Hücre Toplama (Şekil 1) <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> Şekil 1:. Karaciğer Perfüzyon fare anestezi sonrasında, sindirim kanalı yanal erişilebilir portal ven (PV) yapmak için karın sol taşınır. PV hemen karaciğer içinde herhangi bir aşırı basıncı önlemek için rüptüre EGTA / HBSS çözüm yavaş bir akış hızı (1-3 ml / dak) ve alt veina kava (IVC) &#39;dir kullanılarak kanüle edilmiştir. Perfüzyon ilk dakika içinde, akış hızı kademeli / min oranıyla, 7 ml artar. Tam sindirim elde edilene kadar kolagenaz çözelti daha sonra 10 ml / dakika ile perfüze edilmiştir. <ol><li> Prepataze malzeme tabloda açıklanan tüm reaktifleri yeniden. </li><li> EGTA (etilen glikol tetra-asetik asit) / HBSS (Hank Dengeli Tuz Çözeltisi) solüsyonu (fare başına 50 mi) ve 40 ° C&#39;de 30 dakika boyunca kolagenaz çözelti (fare başına 100 mi) ısıtın. </li><li> İlk% 70 etanol ile pompa esnek boruyu durulayın. Su banyosuna daldırılmış bir santrifüj tüpüne EGTA / HBSS Çözüm 40 ml dökün ve önceden ısıtılmış EGTA / HBSS Çözümü ile pompa esnek boruyu durulayın. </li><li> Güvenilir solunum depresyonu ve ölmeden önce bilinç oluşturmak için bir barbitürat kullanarak Terminal anestezi uygulayın. Bir dişi ya da erkek CD 1 fare (35-45 g) içine 1 mg / kg, ip de fenobarbiton enjekte edilir. Ayak kısma anestezi onaylayın. </li><li> Karın tüyleri tıraş edin ve% 70 etanol çözeltisi kullanılarak karın yüzeyi sterilize edin. </li><li> Karın boşluğunda kesti ve karın sol yanal bağırsak hareket ettirerek portal ven ve inferior vena kava maruz kalmaktadır. </li><li> Start EGTA / HBSS Çözüm ile 1-3 ml / dk&#39;lık bir hızda pompası ve 23 gr bir kelebek iğne kullanılarak portal ven kanüle (kanatlar kesilmiş). 23 G iğne ile kanüle portal ven bölümünü Kelepçe ve daha sonra açılan fare karın yüzeyinde serrefine forseps çevirin. Karaciğer hızla EGTA / HBSS Çözüm perfüzyon ilk 30 sn içinde soluk gerekir. </li><li> Hızla karaciğerde aşırı basınç bina önlemek için inferior vena kava alt kısmını insizyon ve sonra perfüzyon ilk dakika içinde, 7 ml / dk kademeli akış oranını artırmak. Hayvan nedeniyle kaval Damara vena ikincil kanama ölür. </li><li> EGTA / HBSS Çözüm az 5 ml santrifüj tüpüne kalan zaman, kollajenaz Çözüm (40-50 ml) ile doldurmak. 30 saniye içinde, 10 ml / dk akış hızıyla kademeli olarak artırır. </li><li> 5-10 sn aralıklarla, cımbız kullanarak, inferior vena kava basınç uygulayarak karaciğer kabarma olun. This (sindirim sırasında 5-10 kez) periyodik olarak yapılabilir. Bu adım, karaciğer hücre ayrışmasını geliştirmek ve kollajenaz ile perfüzyon süresini azaltacaktır. </li><li> Kollajenaz çözelti en az 10 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içinde kalmaya devam ederse, bir santrifüj tüpü içine önceden ısıtılmış kollajenaz çözelti 40-50 mi dökün. </li><li> Perfüzyon 10-15 dakika ve perfüze kolagenaz çözelti, yaklaşık 70-80 ml sonra, forseps ile karaciğer yüzeyinde küçük bir basınç uygulamak. Basınç Bir baskı karaciğer hücreleri ayrışmış olduğunu gösterir. </li><li> Tek parça olarak karın boşluğunda karaciğer çıkarın ve Kupffer hücreleri izolasyon ortamında 20-30 ml ihtiva eden bir santrifüj tüpüne koyun. Karaciğer hücre canlılığını etkileyen bilmek 3 saatlik bir süre için buz üzerinde ya da 4 ° C &#39;de, karaciğer hücreleri tutun. </li><li> Buz üzerinde perfüze karaciğer tutarken, gerekirse birkaç hayvanlar üzerinde perfüzyon işlemi tekrarlayın. Havuz arıtma için üç karaciğerler bir ve evre 3 ile devam edin. </li></ol> Santrifüj için Yoğunluk Gradyan 2. Hazırlama (Şekil 2) <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> Şekil 2:. Yoğunluk gradyanı hazırlanması Bütün prosedürler steril koşullar altında gerçekleştirilir. SIP, 10 1.7 ml x PBS ile kaplanmış silika partikül solüsyonunun 15.3 ml karıştırılmasıyla hazırlanır. SIP 5 ml 20 ml% 25 SIP çözelti yapmak için PBS, 15 ml ile karıştırılır. SIP 10 mi, 20 ml 50% SIP solüsyon yapmak için, 10 ml PBS ile karıştırılır. 50% SIP çözeltisi (20 mi) hareket ettirildiğinde, 25% SIP çözeltisi (20 mi) ihtiva eden bir santrifüj tüpü yavaşça serolojik 25 mi pipet kullanarak eklenir. <ol><li> Steril koşullar altında, aşağıdaki adımları (bölüm 2., 3. ve 5.) ile devam edin ve C buz üzerinde veya 4 ° hücreleri tutun. 10 1.7 ml x PBS ile kaplanmış silika parçacık çözeltisi 15.3 ml karıştırarak SIP (İzotonik kaplı silika Partiküllerinin Çözüm) hazırlayın. </li&gt; <li> , 25% SIP çözeltisi 20 ml yapmak PBS, 15 ml ile SIP 5 ml karıştırın. 10 ml PBS ile SIP 10 ml karışımı, 50% SIP çözeltisi 20 ml yapmak için. </li><li> 50% SIP çözeltisi 20 ml bir santrifüj tüpüne doldurun. 90 ° ye yakın bir açı ile santrifüj tüpü yatırın ve 50% SIP katmanı yüzeyine dokunmadan, 25 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak serolojik borunun yan duvara yavaş 25% SIP çözeltisi (20 mi) ilave edin. % 25 SIP çözümü eklerken, giderek tüpün açısını azaltır. Buz üzerinde kullanıma kadar yoğunluk gradiyenti tutun. </li></ol> 3. Kupffer hücre Arıtma (Şekil 3) <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> Şekil 3:. Yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme ve hücre yapışması Kupffer hücreleri &#39;nin Saflaştırılması Tüm işlemler, steril koşullar altında gerçekleştirilir. (A) Glisson en kapsülün delinmesinden sonra karaciğer hücreleri, bir 1 süzülür00 mikron süzgeç. Süspansiyon hepatositler (pelet) iptal ve non-parenkimal hücreli fraksiyonu (süpernatant) toplamak için x 50 g&#39;de santrifüje tabi tutulur. Bu aşama 3 kez tekrar edilir. Sigara parankimal hücreler, kesintili bir izotonik gradyanın üzerine ilave edildi ve 15 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüje tabi tutulur. 25% SIP yastığı toplanan Kupffer hücreleri hücre yapışma seçimi ile daha da saflaştırılır. (B) Hücreler, 24 oyuklu plakada kaplanmıştır ve 30 dakika boyunca CO2 37 ° C&#39;de inkübe edildi ve% 5 vardır. Yapışkan olmayan hücreler HBSS 500 ul ile bir kez yıkanır. Kupffer hücreleri f CNT hücrelere ilave edilebilir kaplama, sonra yapışmayan morfolojisi 4 saat gösterir. Ölçek çubuğu 25 mikron temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Kupffer hücre izolasyon ortamında 15 ml ile bir Petri kabı içinde tek bir perfüze karaciğer koyun. (Glisson en kapsülü yırtılabilirKaraciğerin zarı) makas kullanarak ve Kupffer hücre izolasyonu ortama tüm karaciğer hücreleri bırakın. 100 mikron hücre süzgeç bir santrifüj tüpüne toplanacak olsa çözüm Filtre. Ek perfüze karaciğerleri üzerinde perfüzyon işlemi tekrarlayın ve (üç fareden 45 ml kadar, bir fareden 15 ml), aynı santrifüj tüpüne hücreleri havuz. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 50 xg&#39;de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Pelet ve (Kupffer hücreleri dahil) olmayan parankimal hücreler süpernatanda olacak parankimal hücreler (hepatositler) olacaktır. </li><li> 2 dakika her biri için 50 xg&#39;de temiz bir santrifüj tüpüne ve santrifüj süpernatant toplayın. Bu adımı üç kez daha tekrarlayın. </li><li> 15 dakika 1.350 xg&#39;de Santrifüj olmayan parankimal pelet hücreleri. Süpernatantı atın ve Kupffer hücre izolasyonu Orta 10 ml pelletini. </li><li> 2.3 açıklandığı gibi süreksiz izotonik degrade 25/50% dışı parankimal hücre çözüm ekleyin. Senthızlanma veya ara vermeden 15 dakika 850 xg&#39;de rifuge. </li><li> 25/50% SIP arayüzüne yakın% 25 SIP fraksiyonu (Şekil 3) içinde bulanık görünen zenginleştirilmiş Kupffer hücre fraksiyonu yerelleştirilmesine. 10 ml serolojik pipet, aspirat zenginleştirilmiş Kupffer hücre fraksiyonunun yaklaşık 12 ml kullanma. Kupffer hücre izolasyon ortamında 35-40 ml ihtiva eden bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarın. Pelet hücreleri 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 1350 x g&#39;de yumuşak ve santrifüj karıştırın. </li><li> Önceden ısıtılmış Kupffer hücre kültür aracı maddesi, 5-10 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atın. Hücreler (hemositometre) Sayım ve tripan mavisi boyama kullanarak canlılığı ölçün. </li><li> / Oyuk 5 x 10 5 hücre yoğunluğunda 24 oyuklu plakalarda saflaştırılmış olmayan parankimal hücreler plaka. 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 (Şekil 3) hücreleri inkübe edin. 30 dakika sonra, yavaşça yıkanır, orta kaldırmak Hank Dengeli Tuz Solüsyonu (HBSS), daha sonra bir kez yerine önceden ısıtılmıştaze ve önceden ısıtılmış Kupffer hücre kültür ortamında 500 ul bu (oyuk başına). </li><li> Onlara yapışık morfolojisi elde etmek için izin vermek için, nanopartiküller ile tedaviden önce, 37 ° C&#39;de en az 4 saat% 5 CO2 için Kupffer hücreleri bırakın. </li></ol> 4. Karakterizasyonu <ol><li> Kupffer hücreleri Saflık <ol><li> Kupffer hücre canlılığını korumak için kullanılan taze PBS / BSA çözeltisi hazırlayın. PBS / BSA çözeltisi 500 ul ile bir kez hücreler yıkanır. PBS / BSA çözeltisi çıkarın ve yumuşak bir kazıma ile taze PBS / BSA çözeltisi 500 ul Kupffer hücreleri ayırmak. Hücreler 24-yuvalı plakalar içinde plakalanmıştır zaman devam etmek için ayrılma kolaylaştırmak için makas ile sıyırıcı bıçak uçlarını kısaltır. Tüpler flow sitometri içine hücreleri aktarın. </li><li> Bir hemositometre ve santrifüj 1,350 x g 1 x 10 5 hücre kullanarak Kupffer hücreleri saymak. (Saf) F4 / 80 antikorunun 30 ul içinde süspanse Kupffer hücreleri. İyice karıştırın ve 3 için oda sıcaklığında inkübe0 dak. Buz üzerinde lekesiz hücreleri (antikor ile kuluçkaya değil) tutun. </li><li> 5 dakika boyunca 1,350 g&#39;de, lekeli hücrelerde santrifüj PBS / BSA çözeltisi 2 ml ilave edilir ve elde edilen süpernatant atılır. PBS / BSA, 200 ul, boyanan hücreleri yeniden süspanse edin. </li><li> Flow sitometri analizi için kapı 10,000 boylarına (ileri dağılım) ve parçalı (yan dağılım) göre Kupffer hücreleri boyanmamış. FL-1 kanalında kapılanmış hücrelerin floresans analiz edin. </li><li> Lekesiz Kupffer hücrelerinin flow sitometri analizi için kullanılan aynı ayarları tutmak lekeli Kupffer hücreleri için prosedürü tekrarlayın. Seçip Kupffer hücre saflığını değerlendirmek için boyalı hücrelerin floresans ölçmek. </li></ol></li><li> Kupffer hücre Fagositik Etkinliği <ol><li> % 0.5 ile değiştirin (h / h) Kupffer hücre kültür ortamı içinde flüoresan boncuklar ve 37 ° C&#39;de 4 saat inkübe edilir ve% 5 CO2. </li><li> 1.350 xg, di non-içselleştirilmiş boncuk, santrifüj Kupffer hücreleri ortadan kaldırmak için500 ul PBS / BSA Çözüm supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri scard. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın. </li><li> Tüp sitometri akışı içine PBS / BSA çözeltisi ve transfer hücrelerinin 500 ul Pençe Kupffer hücreleri. </li><li> Santrifüj Kupffer hücreleri 1,350 xg&#39;de, PBS / BSA çözeltisi 200 ul supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atın. </li><li> Flow sitometri analizi için kapı 10,000 boylarına (ileri dağılım) ve parçalı (yan dağılım) göre Kupffer hücreleri boyanmamış. FL-2 kanal kapılı hücrelerin floresan analiz edin. </li></ol></li></ol> (CNT f) Kimyasal Fonksiyonlu Karbon Nanotüpler 5. Kuluçka <ol><li> Kullanımdan önce, 15 dakika süreyle sese tabi tutularak su içinde ön-CNT (1 mg / ml) &#39;in bir dağılımı hazırlanır. F-CNT içi 22 hazırlanır. </li><li> 2x konsantre edildi f- CNT hazırlanması Kupffer hücre kültür aracı maddesi içinde dispersiyon. Için ortam içinde dağılmış sonikasyon f CNT2 dk) aşama 5.3 geçmeden önce. </li><li> Her kuyu için, 2x f-CNT dağılım 250 ul eski medya 250 ul değiştirin. Tedavi edilmeyen kuyu (tatlı Kupffer hücre kültür ortamının koşullandırılmış ortamı + 250 ul 250 ul) ve% 10 DMSO ile muamele edilmiş kuyu sırasıyla negatif ve pozitif kontrol olarak kullanılır. </li><li> 24 veya 72 saat boyunca CO2 37 ° C&#39;de, Kupffer hücreleri inkübe ve% 5. </li></ol> Modifiye Laktat Dehidrojenaz (LDH) Testi ile Kupffer hücrelerinde f-CNT 6. Toksisite Değerlendirmesi <ol><li> Süpernatantı atın. </li><li> Lizis Tamponu (24 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu için) 200 ul ilave edin ve 30 dakika-1 saat süre ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 10 dakika Hücreler ve hücre artığı tarafından alınan f CNT pelet süreyle kuvvetli bir şekilde pipetleme yaptıktan sonra, 40,000 x g&#39;de mikrosantrifüj tüpleri ve santrifüj içine Kupffer hücreleri lize toplamak. </li><li> Süpernatantlar (ƒ-CNT ücretsiz) içine toplayınmikrosantrifüj tüpleri ve -20 ° C&#39;de mağaza ya) 6.5 adıma geçin. </li><li> 96 oyuklu bir plaka başına 50 ul ve her bir alt-tabaka karışımı çözeltisi (LDH kit) eşit hacmi ekleyin. Plaka örtün ve durdurma solüsyonu (LDH kiti) 50 ul ilave edilmeden önce 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Liziz tamponu 50 ul substrat karışımı çözeltisi 50 ul ve durdurma çözeltisi 50 ul ihtiva eden boş bir kuyu triplicates ekleyin. </li><li> Mikroplaka okuyucu içinde 490 nm&#39;deki absorbansı okumak ve (%) hücre sağ kalabilirliğinin hesaplanması için aşağıdaki formül kullanılır. </li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

<ol><li>Hoffmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+novel+kidney+biomarkers+in+preclinical+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies.</a> Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).</li>
<li>Nel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterial+Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+Use+of+a+Predictive+Toxicological+Approach+and+High-Throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening.</a> Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).</li>
<li>Bregoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+antimony+trioxide+nanoparticles+on+human+hematopoietic+progenitor+cells+and+comparison+to+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines.</a> Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).</li>
<li>Yamasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Aberrations+and+Cellular+Heterogeneity+in+SV40-Immortalized+Human+Corneal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells.</a> Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).</li>
<li>Motoyoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megalin+contributes+to+the+early+injury+of+proximal+tubule+cells+during+nonselective+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria.</a> Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).</li>
<li>Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+characteristics+and+expression+of+cell+adhesion+molecules+in+proximal+tubule-derived+cell+lines+commonly+used+for+in+vitro+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies.</a> Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).</li>
<li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+non-equivalence+of+murine+%28monocyte-%29+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).</li>
<li>Kermanizadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Kupffer+cells+in+the+hepatic+response+to+silver+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles.</a> Nanotoxicology. , (2013).</li>
<li>Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Primary+Liver+Macrophages+for+Studying+Quantum+Dot+Interactions+with+Biological+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems.</a> Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).</li>
<li>Wan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M2+Kupffer+Cells+Promote+M1+Kupffer+Cell+Apoptosis%3A+A+Protective+Mechanism+Against+Alcoholic+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).</li>
<li>Matsuoka, M., Tsukamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+hepatic+lipocyte+collagen+production+by+Kupffer+cell-derived+transforming+growth+factor+%CE%B2%3A+Implication+for+a+pathogenetic+role+in+alcoholic+liver+fibrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis.</a> Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).</li>
<li>Polakos, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer+Cell-Dependent+Hepatitis+Occurs+during+Influenza+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection.</a> The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).</li>
<li>Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+enzymes+released+by+liver+macrophages+may+promote+hepatic+injury+in+a+rat+model+of+hepatic+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage.</a> Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).</li>
<li>Knittel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+parenchymal+and+non-parenchymal+cells+of+rat+liver%3A+regulation+by+TNF-%CE%B1+and+TGF-%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1.</a> Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).</li>
<li>Branster, M. V., Morton, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Intact+Liver+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of Intact Liver Cells.</a> Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).</li>
<li>Smedsrød, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li>
<li>Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+endothelial+cells+of+adult+rat+liver+as+resolved+by+sedimentation+velocity+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry.</a> J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).</li>
<li>Miller, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+cells+from+livers+of+carcinogen-treated+rats+by+free-flow+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis.</a> Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).</li>
<li>Firme, C. P., Bandaru, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+issues+in+the+application+of+carbon+nanotubes+to+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems.</a> Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).</li>
<li>Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+assessment+of+carbon+nanotube+interaction+with+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+correcting+for+carbon+nanotube+interferences+with+a+commercial+LDH+cytotoxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay.</a> Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).</li>
<li>Wang, J. T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+Decorated+Multiwalled+Carbon+Nanotubes+as+Dual+MRI+and+SPECT+Contrast+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents.</a> Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).</li>
<li>Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+isolate+and+culture+mouse+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells.</a> Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).</li>
<li>Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+liver+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Isolation of liver Kupffer cells.</a> Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14(2003).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Aşağıdaki adımlar, yüksek verim ve Kupffer hücreleri yüksek canlılığı elde etmek için kritiktir. Aseptik koşullar bakteriyel ve fungal kirlenme riskini sınırlamak için kullanılır. Tüm araçlar kullanılmadan önce sterilize edilmesi gerekir. Reaktifler taze izolasyon prosedürü gerçekleştirmeden önce hazırlanmalıdır. kollajenaz IV seçimi, düşük triptik aktivite ile, çok önemlidir. Aynı ilgili farklı birçok farklı enzimatik aktiviteye sahip olan ve Kupffer hücre izolasyonu için en uygun toplu seç...

Nanotoksikoloji araştırması alanı, nanopartiküller biyolojik etkisini belirlemeyi amaçlamaktadır. In vivo araştırmalara dayalı Toksikolojik çalışmalar en doğru yöntemleri kalır. Ancak, bunların kullanımı maliyet, emek ve zaman gereksinimleri 1 ile sınırlıdır. Alternatifler, in vitro tahliller için basitlik ve vitro test platformları 2 yüksek verim yakalanma olasılığı kullanılmıştır gibi - yani test edilen koşullar sayısını uzanır. En nanotoxicological çalışmalar, ölümsüz hücre çizgileri ile in vitro deneyler kullanılarak gerçekleştirilir. Ancak, in vivo toksikolojik etkileri 3 bu deneysel bulguların ekstrapolasyonuna konusunda endişeler vardır. Gerçekten de, ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri özellikleri de elde edilmiştir dokular, örneğin, genetik dönüştürme 4, temel morfolojik özelliklerini bozulması önemli ölçüde farklı olabilir5, hücresel polarite 6 ve inflamatuar mediatörlerin 7 düzenlenmesi gibi fonksiyonel değişikliklerin kaybı. Kupffer hücrelerinin vücuttaki en bol bulunan makrofaj popülasyonu ve karaciğer sinüsoidlerinden duvarını kaplayan kan ile doğrudan temas halinde bulunmaktadır. Retiküloendotelyal sistem (RES) bir parçası olarak, bu makrofajlar nanopartiküller dolaşım ve bu nedenle yakalanması için sorumlu olan, nanopartikül toksisitesini incelemek için son derece uygun bir model teşkil etmektedir. In vivo 8 ve in vitro nanopartiküller maruz Kupffer hücreleri ile ilişkili inflamatuar tepkilerin 9 çalışmaları başka yayınlanmıştır. Kupffer hücreleri aynı zamanda alkolik karaciğer hastalığı 10, karaciğer fibrozis 11 veya viral hepatit 12 olarak karaciğer hastalıklarının patogenezinde yer almış. Bu izole Kupffer hücreleri, hücresel mekanizmalar inv açıklamak için yararlı bilgi sağlar olduğu bildirilmiştirKaraciğer bozulması 13,14 olved. Çeşitli yöntemler, izole edilmesi ve Kupffer hücrelerinin saflaştırılması için rapor edilmiştir. Hücre izolasyonu, mekanik ya da enzimatik ayrılma 15 kaynaklanabilir. Kollajenaz sindirimi yüksek Kupffer hücre verimi 16 giden ise, Kupffer hücreleri fonksiyonel bütünlüğü muhafaza avantajını gösterir. Karmaşıklığı ve maliyeti değişen pek çok deneysel yaklaşım, diğer karaciğer hücre popülasyonlarından Kupffer hücreleri ayırmak için kullanılmıştır. Örneğin, Kupffer hücre saflık immünoafinite 17, akış elektroforez 18, yapışmayı 16 tarafından ya da bunların büyüklüğü ve yoğunluğuna göre hücreleri seçin santrifüj teknikleri 16, ile elde edilebilmektedir. Bu yöntemlerin bir kombinasyonu nüfusun 16 saflığını geliştirmek için seçilebilir. Çoğunlukla uygulama ve mevcut ekipman bağlı olduğu Kupffer hücre izolasyonu için ideal yöntem hakkında görüş birliği yokturt. Bununla birlikte, nanopartikül toksisite testi durumunda, basitliği ve Kupffer hücreleri fonksiyonlarının korunması ile bağlantılı teknik yüksek verimi, bu uygulama için en uygun olduğu ortaya çıktı. Burada bildirilen, Kupffer hücre izolasyon yöntemi yoğunluk gradyanı üzerinde saflaştırma, ardından 2-aşamalı bir perfüzyon metoduna dayanır. yöntem Smedsrød ve arkadaşları tarafından geliştirilen özgün protokolden modifiye edildi. 16 sıçan karaciğer hücre izolasyonu için tasarlanmış. Çalışmaların çoğu rapor ve sıçan ciğeri Kupffer hücrelerinin izolasyonu nitelendirdi. Burada, yüksek verim ve saflıkta, fare karaciğerinden Kupffer hücreleri izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. farelerin kullanılması deney maliyetini düşürür ve çeşitli karaciğerinin işleme nanoparçacık toksisite testleri için Kupffer hücreleri büyük miktarlarda elde etmesini sağlar. Aşağıdaki protokol, Kupffer hücreleri (f işlevselleştirilmiş C-nanotüpler ile inkübe edildi </em&gt; CNT). CNTs özel fiziko-kimyasal özelliklere - tedavisi ve teşhis amaçları için vektörler olarak CNTs ilgi çekici adaylardır yapmış, çap oranı ve geniş yüzey alanı yüksek uzunluğa yani. Ancak, endişeleri CNTs 19 toksisitesi, ve in vitro testlerde yeni gelişme CNT biyolojik etkisinin anlaşılmasını artırmayı hedefliyor ilgili gündeme gelmiş. Kupffer hücre içinde toksisite, hücre zarının yapısal bütünlüğünün eksikliği ile bağlantılıdır. Bu yüzey maddesine hücreden sitoplazmik enzimin LDH kaybı ile ölçülür. Bu yöntemin prensibi, bu nedenle, herhangi bir serbest LDH çıkarın ve hücreleri 20 kalanları ölçmektir. Üstte kalan sıvı kısımdaki CNTs varlığının tayinin 21 müdahale, bu süpernatan içinde salınan LDH ölçülmesi tercih yapılır. Biz bu basit ve uygun maliyetli Kupffer hücre izolasyonu metho kullanımını öneriyoruzD fonksiyonel Kupffer hücreleri çok sayıda izole etmek. Bu, ilgili primer makrofaj modelinde, nanopartiküller bir dizi toksisite tarama sağlar.

<table><tbody><tr><td>Euthatal (pentobarbital sodyum)</td><td>Merial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1 fareleri</td><td>Charles River&nbsp; &nbsp;</td><td>-</td><td>Fare ağırlığı 35 ila 45 g arasında değişmelidir. Ağırlıkları hızla arttığı için erkek CD1 farelerinin kullanılmasını tavsiye ederiz (örn. 7 haftalık bir erkek CD1 faresinin ağırlığı 35 g'ı aşıyor). Ayrıca, yaşlı hayvanların teslimatını ayarlamak için hayvan tedarikçisiyle önceden iletişime geçmeniz tavsiye edilir. Alternatif olarak, hayvanlar istenen ağırlığa ulaşmak için evde olabilir.</td></tr><tr><td>HBSS (Ca2+ ve Mg2+ ücretsiz, bikarbonatlı)&nbsp; &nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp; &nbsp;</td><td>14175-053</td><td>HBSS olmalı&nbsp; Ca2+ ücretsiz.&nbsp;</td></tr><tr><td>Etilen Glikol Tetraasetik Asit (EGTA) tetrasodyum tuzu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp;</td><td>E8145&nbsp; &nbsp;</td><td>EDTA da kullanılabilir, ancak EGTA'nın Ca2+ selekte şelatlama avantajı vardır.</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp; &nbsp;</td><td>15630-056&nbsp;</td><td>100 ml&nbk;</td></tr><tr><td>Kollajenaz tip IV&nbsp;</td><td>Worthington&nbsp;</td><td>CSL-4&nbsp;</td><td>Farklı kollajenaz partilerinin test edilmesi veya en azından tedarikçiye ürünün karaciğer hücresi izolasyonu için uygun olması gerektiğini belirtmeniz tavsiye edilir&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Düşük glukoz DMEM&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp;</td><td>D5523&nbsp;</td><td>500 ml&nbk;</td></tr><tr><td>RPMI (sodyum piruvat ve Glutamax ile)&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp; &nbsp;</td><td>12633-012&nbsp;</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Penisilin / Steptomisin &</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp; &nbsp;</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu&nbsp;</td><td>İlk Bağlantı&nbsp; &nbsp;</td><td>60-00-850&nbsp;</td><td>500 ml&nbk;</td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8154&nbsp;</td><td>100 ml&nbk;</td></tr><tr><td>Kaplamalı silika parçacık çözeltisi (Percoll)</td><td>GE Healtcare&nbsp; &nbsp;</td><td>17-0891-02&nbsp;</td><td>Percoll&reg; çok kararlıdır ve birkaç yıl saklanabilir&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Sağan&nbsp; &nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp; &nbsp;</td><td>10010-023</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>10x Fosfat Tamponlu Salin&nbsp; &nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp; &nbsp;</td><td>70011-036</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit&nbsp;</td><td>Balıkçı&nbsp;</td><td>D/4120/PB08&nbsp;</td><td>500 ml&nbk;</td></tr><tr><td>LDH kiti (CytoTox 96)&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G1781&nbsp;</td><td>Işıktan koruyun&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM fenol içermeyen</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp; &nbsp;</td><td>31053-028&nbsp;</td><td>500 ml&nbk;</td></tr><tr><td>F4/80 antikoru (Alexa 488)</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA497A488</td><td>Seyreltmeyin, akış sitometrisi için temiz kullanılır</td></tr><tr><td>Floresan boncuklar</td><td>Sigma</td><td>L2778</td><td>Lateks boncuklar, amin modifiyeli polistiren, floresan kırmızısı. 1 ml</td></tr><tr><td>Malzeme Firmasının Adı</td><td>&nbsp;</td><td>Katalog numarası&nbsp;</td><td>Yorumlar / Açıklama&nbsp;</td></tr><tr><td>Kelebek kan alma seti (23 G/305 mm uzunluğunda boru)&nbsp; &nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>367288</tr><tr><td>Şırınga Filtreleri (0.22 & mu; m Mavi Jant)&nbsp;</td><td>Minisart&nbsp;</td><td>16534-K&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpleri (50 ml Mavi Kapak)&nbsp;</td><td>BD Biyobilimleri, Falcon&nbsp;</td><td>35 2070&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı (90 x 15 mm)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel&nbsp; &nbsp;</td><td>BSN 101VR20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 ve mu; M hücre süzgeci&nbsp; &nbsp;</td><td>BD&nbsp; &nbsp;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa&nbsp;</td><td>Watson Marlow&nbsp;</td><td>SciQ 300&nbsp; &nbsp;</td><td>Her kullanımdan önce ve sonra hortumu steril PBS ve% 70 etanol ile durulayın.</td></tr><tr><td>24 oyuklu plakalar</td><td>Corning&nbsp; &nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar&nbsp;</td><td>Corning&nbsp; &nbsp;</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Plaka okuyucu</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>Serrefine forseps</td><td>Hammacher GmbH&nbsp;</td><td>Ürün No. HSE 004-35 / Kat. Nr. 221-0051</td><td>Serrefin forsepsler, perfüzyon işlemi sırasında forsepsleri tutmaya gerek kalmadan 23 G iğne ile kanüle edilen damarın klemplenmesine izin verir. Erişim Adresi: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&nbsp;</td></tr><tr><td>Akış sitometri tüpleri</td><td>BD Biosciences, Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>352052</tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri (1.5 ml)</td><td>Elkay</td><td>&nbsp; 000-MICR-150</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>353086</td><td>24 oyuklu plakalardaki hücreleri kazımak için bıçak ekstremitelerini bir makasla kesin.</td></tr><tr><td>Reaktif Şirketinin Adı</td><td>&nbsp;</td><td>Katalog numarası&nbsp;</td><td>Yorumlar / Açıklama&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; EGTA (Etilen Glikol Tetraasetik Asit)/HBSS (Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi) Çözeltisi&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.5 mM EGTA ve 25 mM HEPES içeren HBSS. PH'ı 7.4'e ayarlayın. Her karaciğerin perfüze olması için 50 ml hazırlayın. &nbsp;</td></tr><tr><td>Kollajenaz Solüsyonu&nbsp;</td><td></td><td></td><td>100 UI/ml, 15 mM HEPES ve %1 Penisllin/Streptamisin'de (h/h) kollajenaz tip IV içeren DMEM düşük glikoz. PH'ı 7.4'e ayarlayın. Her karaciğerin perfüze olması için 100 ml hazırlayın. Kollajenaz eklendikten sonra, kullanmadan önce çözeltinin 30 dakika ısıtılması tavsiye edilir. Bu, kollajenaz aktivitesinin optimum olmasını sağlar.</td></tr><tr><td>Kupffer Hücre İzolasyon Ortamı&nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI içeren, %1 Esansiyel Olmayan Amino Asitler (h/h),%1 glutamax&reg; (h/h) ve %1 Penislin / Streptomisin (h/h). 1-3 karaciğer için en az 100 ml hazırlayın. &nbsp;</td></tr><tr><td>Kupffer Hücre Kültürü Besiyeri&nbsp;</td><td></td><td></td><td>%10 Fetal Sığır Serumu, %1 Esansiyel Olmayan Amino Asitler (h/h),%1 Glutamax&reg; içeren RPMI; (h/h) ve %1 Penislin / Streptamisin (h/h). 1-3 karaciğer için en az 100 ml hazırlayın. &nbsp;</td></tr><tr><td>SIP (izotonik kaplı silika parçacıkları çözeltisi)</td><td></td><td></td> <td>17 mL SIP elde etmek için 1.7 ml 10x Fosfat Tamponlu Salin&nbsp; ile 15.3 ml Percoll&reg; karıştırın.</td></tr><tr><td>%25 SIP solüsyonu&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5 ml SIP'yi 15 ml 1x Fosfat Tamponlu Salin ile karıştırın&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>%50 SIP çözümü&nbsp;</td><td></td><td></td><td>10 ml SIP'yi 10 ml 1x Fosfat Tamponlu Salin ile karıştırın&nbsp;</td></tr><tr><td>% 0.9 Triton X-100</td>PBS / BSA Çözeltisi<td></td> ile Lizis Tamponu <td></td><td></td> DMEM ortamı</tr><tr><td>% 1 Sığır Serum Albümini ile taze Fosfat Tamponlu Salin pH 7.4 hazırlayın.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nanoparçacık toksisite testi için kupffer hücre izolasyonu

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

In vitro çalışmalar nanotoxicological büyük çoğunluğu onların pratiklik için ölümsüzleştirdi hücre hatları kullandık. Bununla birlikte, ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri veya primer hücrelerde nanopartikül toksisite testi sonuçları in vitro deneyler için birincil hücrelerin kullanımını genişletmek için ihtiyaç ortaya farklılıklar göstermiştir. Bu protokol, fare karaciğer makrofaj izolasyonu, adı Kupffer hücreleri ve nanoparçacık toksisitesini incelemek için kullanımlarını tarif eder. Kupffer hücrelerinin vücuttaki en bol bulunan makrofaj popülasyonu ve nanopartiküller dolaşımdaki yakalama sorumlu retiküloendotelyal sistem (RES) bir parçasını oluşturmaktadır. Burada bildirilen, Kupffer hücre izolasyon yöntemi yoğunluk gradyanı üzerinde saflaştırma, ardından 2-aşamalı bir perfüzyon metoduna dayanır. kolajenaz sindirimi ve yoğunluk santrifüj göre yöntem olup, Smedsrød ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir protokolden uyarlanmıştır. sıçan karaciğer hücre, izolasyon için tasarlanmışn ve yüksek bir verim sağlar ve Kupffer hücreleri, yüksek saflıkta (&gt;% 95) (14 x 10 6 fare başına hücre kadar). Bu izolasyon yöntemi sofistike ya da pahalı ekipman gerektirmez ve bu nedenle karmaşıklığı ve hücre verimi arasında ideal bir uzlaşma temsil etmez. ağır farelerde (35-45 gr) kullanılması izolasyon yönteminin verimini artırır ama aynı zamanda son derece portal ven kanülasyonu prosedürü kolaylaştırır. CNT f işlevselleştirilmiş Karbon nanotüplerin toksisite modifiye LDH testi ile bu modelde ölçülmüştür. Bu yöntem, ön-CNT ile inkübasyondan sonra, Kupffer hücre zarı yapısal bütünlüğünün eksikliği ölçülerek hücre canlılığı değerlendirir. F CNT neden olduğu toksisite izole Kupffer hücreleri nanoparçacık toksisite testleri için faydalı olduğu öne bu tahlili kullanılarak sürekli olarak ölçülebilir. Nanotoksikoloji genel anlayış klinik çeviri daha verimli için nanoparçacık seçim yaparak, bu tür modellerden yarar olabilirkatsayısıdır.

saflaştırılmamış parankimal hücrelerin sayısı, tutarlı ve (17 izolasyon yapıldı) fare başına 6 ila 10 8 ila 14 x hücreler arasında değişmektedir. Her fare izolasyon 16-28 kuyu plaka için yeterli oldu. Tripan mavi boyama Hücre canlılığı hücre canlılığını ~% 95 gösterdi. Kupffer hücreleri eksik yapışkan morfoloji (Şekil 4A) ilgili, 37 ° C&#39;de inkübe edildikten sonra 30 dakika içinde yuvarlak bir şekli göstermektedir. 4 saat inkübasyon ve daha sonra, hücreler yayılmış ve hücre kümeleri meydan...

Kupffer hücreleri olarak adlandırılan karaciğer makrofajları, dolaşımdaki nanopartiküllerin yakalanmasından sorumludur. Burada Kupffer hücre izolasyonu için yüksek hücre saflığı ve verimine sahip bir yöntemi açıklıyoruz. Modifiye LDH testi, Kupffer hücrelerinde karbon nanotüplerin neden olduğu toksisiteyi ölçmek için burada kullanılır.

Nanoparçacık Toksisite Testi için Kupffer hücre izolasyonu

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, nanopartikül toksisitesini incelemek için yüksek sayıda fare Kupffer hücresini izole etmek ve saflaştırmaktır. Bu işlem, fare karaciğerlerinin bir H-B-S-S-E-G-T-A çözeltisi ve karaciğer dokusunu nazikçe sindirmek için bir kollajenaz çözeltisi ile perfüze edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, saflaştırılmış Kupffer hücre kültürü elde etmek için karaciğer hücreleri yoğunluk gradiyent santrifüjasyonu ve seçici adezyon yoluyla saflaştırılır.Ardından, hücreler için cup saflığını ve F asidik özelliklerini doğrulamak amacıyla akış sitometrisi analizi gerçekleştirilir. Fonksiyonelleştirilmiş karbon nanotüp toksisitesinin hücreler için cup içerisinde ölçülebileceğini gösteren sonuçlar elde edilir. Modifiye edilmiş L-D-H-S-A'ya dayanarak, bu modelin nanoparçacık toksisite testlerine uygulanabileceği desteklenmektedir.Bugün size göstermeyi amaçladığımız yöntem, yeni geliştirilen ilaç taşıyıcılarının toksisitesinin değerlendirilmesi gibi nanotoksikoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; bu oldukça önemlidir çünkü kullanılan ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının çoğu, türetildikleri dokulardan önemli ölçüde farklı özellikler gösterir. Bu yöntemin görsel bir gösterimi kritik öneme sahiptir. Yöntem başarıyla uygulandığında, toksisite taraması için bir dizi nanopartikülün test edilmesinde model olarak kullanılabilecek yüksek verimlilikte ve saflıkta ke hücreleri elde edilecektir.Eşlik eden metin protokolünde yer alan materyal ve reaktifler tablosunda listelenen tüm reaktifler taze olarak hazırlandıktan sonra, E-G-T-A-H-B-S-S çözeltisini ve kollagenaz çözeltisini 40 °C'de 30 dakika boyunca ısıtın, pompa esnek tüpünü durulamak için %70 etanol kullanın. Ardından, su banyosuna daldırılmış bir santrifüj tüpüne 40 mL E-G-T-A-H-B-S-S çözeltisi dökün ve pompa esnek tüpünü durulamak için önceden ısıtılmış E-G-T-A-H-B-S-S kullanın. Bir CD1 faresini ötanize ettikten sonra, metin protokolüne uygun olarak karın tüylerini tıraş edin ve karın yüzeyini dezenfekte etmek için %70 etanol kullanın.Anesteziyi, ayak parmaklarını sıkarak doğrulayın. Karın boşluğunu kesin ve bağırsakları karnın sol tarafına doğru yanlara kaydırarak portal ven ve inferior vena cava'yı açığa çıkarın. Pompayı E-G-T-A-H-B-S-S çözeltisi ile dakikada bir ila üç mililitre hızda çalıştırın; 23 gauge kelebek iğne ile portal veni kanüle edin, portal venin kanüle edilen kısmını klempleyin ve ardından sine pensini açılan fare karnının yüzeyine sabitleyin.Perfüzyonun ilk 30 saniyesi içinde karaciğer soluklaşmalıdır; karaciğerde aşırı basınç birikmesini önlemek için vena cava inferiorun alt kısmını hızla kesin ve perfüzyonun ilk dakikası boyunca akış hızını kademeli olarak dakika başına yedi mililitreye çıkarın. Santrifüj tüpünde 5 mililitreden daha az E-G-T-A-H-B-S-S çözeltisi kaldığında, 40 ila 50 mililitre kollajen A çözeltisi ekleyin, ardından akış hızını 30 saniye içinde kademeli olarak dakika başına 10 mililitreye yükseltin.Cımbız kullanarak inferior vena cava'ya 10 ila 32 saniyelik aralıklarla periyodik olarak baskı uygulayarak karaciğerin şişmesini sağlayın. Bu işlem, hücre disosiyasyonunu iyileştirecek ve kollajenaz ile perfüzyon süresini azaltacaktır. Santrifüj tüpünde 10 mL'den az kollajenaz çözeltisi kaldığında, tüpe 40 ila 50 mL ek ön ısıtılmış kollajenaz çözeltisi ekleyin.Ardından, 70 ila 80 mililitre perfüzyon yapıldığında, yüzeye hafifçe bastırmak için pens kullanın. Oluşan çöküntü izi, karaciğer hücrelerinin dissosiye olduğunu gösterir. Karaciğeri tek parça halinde karın boşluğundan çıkarın ve hücre izolasyonu için 20 ila 30 mililitre Medium içeren bir santrifüj tüpüne yerleştirin.Karaciğer hücrelerini üç saate kadar buz üzerinde tutun ve hücrelerin saflaştırılması için üç karaciğere kadar birleştirin. Perfüze edilmiş bir karaciğeri, makas veya cımbız yardımıyla 15 mililitre hücre izolasyon ortamı içeren bir Petri kabına yerleştirin. Glisson kapsülünü yırtın ve tüm karaciğer hücrelerini ortama salın.Çözeltiyi 100 µm hücre süzgecinden geçirerek bir santrifüj tüpüne filtreleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu 4 °C'de 50 g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Parankimal hücreler çökelek kısmında, parankimal olmayan hücreler ise süpernatantta yer alacaktır.Süpernatanı temiz bir santrifüj tüpüne toplayın ve iki dakika boyunca 50 gs hızında santrifüjleyin. Toplam dört transfer ve santrifüj işlemi için bunu tekrarlayın. Ardından santrifüjleyin.Süpernatant 1.350 g'de 15 dakika boyunca santrifüjlenir. Non-parenkimal hücreleri çöktürmek için süpernatant atılır ve pelet 10 mililitre Kupffer hücresi izolasyon ortamında yeniden süspande edilir; non-parenkimal hücre solüsyonu, metin protokolüne göre önceden hazırlanmış olan süreksiz %25-50 izotonik gradyana eklenir ve hızlanma veya frenleme olmadan 850 g'de 15 dakika santrifüjlenir. 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanılarak, %25 SIP fraksiyonu içinde, %25-50 SIP arayüzüne yakın bölgede bulanık görünen zenginleştirilmiş Kupffer hücresi fraksiyonundan yaklaşık 12 mililitre aspire edilir.Hücreleri, hücre izolasyonu için 35 ila 40 mL ortam içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve nazikçe karıştırın; ardından hücreleri çöktürmek için 1.350 ×g ve 4 °C'de santrifüjleyin, süpernatantı atın ve hücreleri yeniden süspande etmek için 5 ila 10 mL önceden ısıtılmış ortam kullanın. Hemositometre ile hücreleri sayın ve canlılığı ölçmek için tripan mavisi boyaması yapın. Saflaştırılmış non-parenkimal hücreleri, kuyuk başına 5 × 10⁵ hücre yoğunluğunda 24 kuyucuklu plaklara ekleyin.Hücreleri 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından besiyerini nazikçe uzaklaştırın. Hücreleri yıkamak için önceden ısıtılmış HBSS kullanın ve bunu kuyuk başına 500 µL taze önceden ısıtılmış hücre kültürü besiyeri ile değiştirin.Nanoparçacıklarla tedaviye başlamadan önce hücrelerin yapışmasına izin vermek için hücreleri en az dört saat boyunca 37 °C'ye geri döndürün. Metin protokolünde belirtildiği gibi C for hücrelerinin saflığı ve fagositoz aktivitesi karakterize edildikten ve fonksiyonelleştirilmiş karbon nanotüpler (fct'ler) ile inkübasyon tamamlandıktan sonra, süpernatantı atın ve her kuyucuğa 200 µL lizis tamponu ekleyin. 37 °C'de 30 ila 60 dakika inkübe edin, güçlü şekilde pipetleme yapın ve lizize olmuş C for hücrelerini mikro santrifüj tüplerine toplayın.Ardından, hücreler tarafından alınan fcn ts'leri hücre kalıntıları üzerinde çöktürmek için 20,000 GS'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı mikro santrifüj tüplerine toplayın ve -20 °C'de saklayın. Alternatif olarak, 50 µL'yi 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın ve laktat dehidrogenaz kitinden eşit hacimde substrat karışım çözeltisi ekleyin.50 µL lizis tamponu ve 50 µL substrat karışım çözeltisi içeren boş kuyucukların üçerli tekrarlarını ekleyin. Ardından plakayı kapatın ve 50 µL durdurma çözeltisi eklemeden önce oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Son olarak, absorbansı bir mikroplaka okuyucuda 490 nm'de okuyun ve hücre canlılık yüzdesini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın.Bu şekil, saflaştırılmış non-parenkimal hücre sayısının fare ve trian başına 8 ile 14 x 10⁶ hücre arasında değiştiğini göstermektedir. Mavi boyama yaklaşık %95 hücre canlılığı ortaya koymuştur. Adezyon kapasitesine sahip hücreler 30 dakikalık inkübasyon süresi içinde yuvarlak bir şekil almış ve dört saat sonra, burada görüldüğü üzere, hücreler yayılmaya ve kümeler oluşmaya başlamıştır.Hücre saflığını kanıtlamak için hücreler F4/80 antikoru ile boyanmış ve saflık akış sitometrisi ile %95'in üzerinde ölçülmüştür. Ayrıca, 12 saatlik kültürden sonra yapılan akış sitometrisi analizi, hücrelerin %85'inin bir mikrometrelik floresan boncukları alma yetenekleri sayesinde fagositik aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Ancak, kültürün 72. saatinde bu sayı düşmüş ve hücrelerin yalnızca %40'ının fagositik olduğu burada gösterilmiştir.Fonksiyonalize karbon nanotüpler ile 24 ve 72 saat boyunca inkübe edilen hücreler, saf hücrelerle karşılaştırıldığında benzer morfolojiler sergilemiştir. Buna karşılık, pozitif kontrol olarak kullanılan %10 DMSO ile inkübe edilen hücreler, modifiye LDH testi analizi sonucunda nekrotik bir morfoloji göstermiştir; 24 ve 72 saat boyunca %10 DMSO ile işlem gören hücreler karşılaştırmalı olarak yüksek toksisite sergilemiştir. FCT'ler, hücreler yalnızca 72 saat boyunca 50 µg/mL konsantrasyona maruz kaldığında hücre canlılığında hafif ancak anlamlı bir azalmaya neden olmuştur. Bu yöntem izlenerek, diğer hücre tabanlı SC'ler ve tüm nanopartikül türleri, izole KE hücreleri kullanılarak test edilebilir.Bu durum, hayvan kullanımını en aza indirirken güvenilir verilerin toplanmasını sağlar. Bu tekniğin, nanoteknoloji psikolojisi alanındaki araştırmacıların, giderek daha fazla geliştirilen pek çok gelecek vadeden nano taşıyıcının güvenliğini taramalarına yol açmasını umuyoruz.

kupffer-cell-isolation-for-nanoparticle-toxicity-testing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Makrofajlar sıçan karaciğer hücrelerinin primer kültür elde etmek için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, plastik tabaklar, seçici eklenti kültür matara ve arıtma sallayarak kültürün yayılması, makrofajlar kullanır. Bu teknik, karmaşık ekipman ve becerileri verimli olmadan karaciğer makrofajlar sağlar.

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Bu yazıda, akciğer doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ikamet ve polianhidrid nanopartiküller ile ko-kültür tepki olarak aktivasyon inceleyerek murin alveoler makrofaj, hasat için protokoller açıklanmaktadır.

Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme

Bu videoda, fare karaciğerinden Kupffer hücrelerinin veya karaciğer makrofajlarının izolasyonunu gösteriyoruz. Karaciğer bir sindirim çözeltisi ile perfüze edilir, ardından yoğunluk gradyan ayrımı yapılır. İzole edilmiş yapışık Kupffer hücreleri daha ileri analizler için kullanılabilir.

Fare Kupffer Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Bu video, seçici genişleme için insan karaciğer dokusundan doğal öldürücü hücreler veya NK hücreleri de dahil olmak üzere lenfositlerin izolasyonunu göstermektedir. Enzimatik ve mekanik sindirim, ardından yoğunluk gradyan ayrımı, NK hücreleri de dahil olmak üzere lenfosit izolasyonunu destekler. Toplanan lenfositler, NK hücrelerinin seçici genişlemesi için daha fazla kullanılabilir.

Seçici Genişleme için Karaciğer Dokusundan Doğal Öldürücü Hücre İzolasyonu

Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Üretim kanama suyu (PBW), bakır oksit nanopartikülleri (CuO-NP'ler) ile muamele edildi ve kültürlenmiş insan hücrelerinde hücresel toksisite değerlendirildi. Bu protokolün amacı, doğal çevresel numuneyi, CuO-NP işlemine bağlı toksisitedeki değişiklikleri değerlendiren bir hücre kültürü formatına entegre etmekti.

Uranyum dan Bakır Oksit Nanopartiküller tarafından İz Elementlerin çıkarılması<em&gt; In Situ</em&gt; Kurtarma Bleed Su ve Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi

İnsan hepatositlerini ve parankimal olmayan karaciğer hücrelerini aynı donörden izole etmek için bir teknik tanımlanmıştır. Farklı karaciğer hücresi tipleri, fonksiyonel karaciğer modelleri ve doku mühendisliği için temel oluşturur. Bu yeni yöntem, karaciğer hücrelerini yüksek verim ve canlılıkta izole etmeyi amaçlamaktadır.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Microglia (beynin bağışıklık hücreleri), nanopartiküllerin nörotoksisiteyi nasıl etkilediğini belirlemek için vekil bir biyosensör olarak kullanılır. Nörotoksisiteyi belirlemek için nanopartiküllere mikroglial yanıtı ve hipotalamik nöronların aktive edilmiş mikrogliadan süpernatana maruz kalmasını test etmek için tasarlanmış bir dizi deneyi tarif ediyoruz.

Nanoparçacık Neurotoksite Belirleyen Bir Vekil Biosensor olarak mikroglia

Bu prosedür, hem akut hem de uzun süreli, tekrarlanan doz rejimleri üzerinde nanomalzeme maruziyetleri ile ilişkili genotoksik tehlikelerin fizyolojik olarak daha ilgili bir değerlendirmesini sağlayabilen ileri 3D hepatik kültürlerin in vitro geliştirilmesi için kullanılmak üzere kurulmuştur.

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

Bu makale, üçlü negatif meme kanserinin singeneik bir murine modelinden primer kanser ilişkili fibroblastların izolasyonu ve kültürü ve tümör mikroçevrimini hedeflemek için tasarlanmış yeni nanopartiküllerin preklinik çalışması için uygulanması için bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır.

Hedeflenen Nanopartiküllerin Çalışması için Meme Kanserinin Singeneik Murine Modelinden Primer Kanserle İlişkili Fibroblastların İzolasyonu

Burada, kararlı durumdaki periferik kandan izole edilen mononükleer hücreleri kullanarak insan otolog karaciğer sferoidleri üretmek için genetik olmayan bir yöntem sunuyoruz.

Karaciğer Hastalığı Çalışmaları için Periferik Kandan İnsan Karaciğer Sferoidleri

Öğrenin fare karaciğerinden Kupffer hücre izolasyonu ve yoğunluk santrifüjasyonu ile nanoparçacık toksisite testi. Bu yöntem yüksek saflıkta hücre sağlar ve karbon nanotüp toksisitesini değerlendirmeye olanak tanır.

Nanoparçacık Toksisite Testi için Kupffer hücre izolasyonu

Daha fazla video keşfet