Name: Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Keşfedin koroid pleksus epitel hücrelerinin silier hareketini ex vivo analiz etme yöntemini. Fare embriyolarından doku izolasyonu ve DIC mikroskobisi kullanarak gelişim biyolojisinde silier motilite kontrolünü inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Özel Üniversiteler için bir Proje tarafından desteklenmiştir: Japonya Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (MEXT) (T.I.) eşleştirme fonu sübvansiyonu ve MEXT'TEN (S.T. ve K.N.) Bilimsel Araştırma Hibeleri (C).

protokoller ve Deney hayvanlarının kullanımı Yamanashi ve Waseda Üniversitesi Üniversitesi&#39;nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri tarafından onaylandı. Hayvan bakımı, kurumsal prensiplere uygun olarak gerçekleştirildi. 1. CPEC Hazırlık <ol><li> Aşağıdaki cihazlar ve malzemeleri hazırlayın: alttan aydınlatma iletilmesi tercihen bir stereo mikroskop; saatçi forseps bir çift (Dumont # 3 ya da # 4), alev sterilize düz işletim makas, alev sterilize; 20 ml buz gibi soğuk Leibovitz L-15 ihtiva eden ortam, iki steril 10 cm&#39;lik plastik tabaklar; 2 ml RT Leibovitz L-15 orta içeren 35 mm cam alt yemekler; % 70 etanol içeren 100 ml&#39;lik bir beher; yenidoğan fare yavrular. </li><li> Kısaca% 70 etanol içinde bir yenidoğan fare batırmak ve işletim makas kullanarak kafaları kesilmek suretiyle hızla euthanize. </li><li> Steril 10 cm di buz Leibovitz L-15 orta derhal baş koyunsh. </li><li> Beyin maruz kafatası açmak kesip, saatçi forseps çifti kullanarak calvaria cildi çıkarın ve ardından tüm beyni izole etmek için kranial sinirler kesilir. </li><li> Buz soğukluğunda Leibovitz L-15 ortamı içeren yeni bir çanak beyin aktarın ve beyin tam ortam içinde daldırılır emin, stereo bir mikroskop altında dikkate alınmalıdır. </li><li> Yukarı bakacak şekilde beynin dorsal yönünü ayarlayın ve koku ampuller (sağ-elli kişilik) 03:00 konumundaki ikamet böylece beyin yönlendirmek. Sol elinde forseps ile yavaşça beyin tutun. </li><li> İnce diseksiyon forseps (Dumont # 3 ya da # 4) sağ elinde kullanarak, beyin uzunlamasına fissür boyunca, serebral hemisfer bağlayan korpus kallosum ve parankiminde altında kesti. </li><li> Nazikçe yan taraflarına serebral hemisferlerin itin ve enine serebral fissür maruz kalmaktadır. </li><li> Th dışarı kısma hemisferlerin ayırınhemisfer ve talamus arasındaki e parankim. </li><li> Yavaşça lamina affixa ile hipokampus yan tarafına bağlı olduğu yanal ventriküler koroid pleksus çekin. </li><li> Taze Leibovitz L-15 orta içeren 35 mm cam alt çanak izole koroid pleksus aktarın ve ağırlığı (Malzeme Listesi) yavaşça yerine doku tutun kaplaması. </li></ol> CPEC Cilia 2. Canlı Görüntüleme <ol><li> 400 nm ve daha uzun 700 nm ve bu nötr yoğunluk (ND) filtreleri (% 25 ve% 6) daha kısa ışık ışık yolu eklenir engellemek için uygun ultraviyole (UV) ve anlaşıldığı (IR) kesim filtresi (ler) Onay ters mikroskop. </li><li> Kabaca gözle objektif lens odağını ayarlayın ve merkez ve odak Köhler aydınlatma uyacak, böylece daha sonra yoğuşturucuyu ayarlayın. Uygun bir diferansiyel girişim kontrast kaydedin (DIC) prizma, li bir DIC elemanı, hem de analiz ve polarize elemanlarght yolu DIC optik uymak. </li><li> Doku yüzeyinin yapısı en tanınabilir şekilde DIC prizma pozisyonu ile görüş kontrastını ayarlayın. Hedef hücrelerin her kirpikler hareketli iseniz, hareketli kirpikler net bir görünüm nedeniyle hareket gözle elde edilemez. </li><li> Video kamera ışık yolu değiştirin ve ışık gücünü artırmak için ND filtreleri kaldırabilirsiniz. </li><li> Görünümü ve odak alanını ayarlamak için mod odaklama kamerayı kullanın. Hangi video görüntüleri monitörde gerçek zamanlı olarak gösterilir, odaklama sırasında, hareketli kirpikler net bir görünüm mevcut değildir. </li><li> İstenilen süre (dakika saniye) 0,1 msn bir pozlama süresi ile 200 Hz kamerayı kullanın. Görüntü yığınının kazanılmasından sonra, tek kare net siliyer yapıları gösterecektir. Siliyer kenarları bulanık ise, kare hızını artırmak ya da daha kısa bir pozlama süresi kullanın. </li><li> Leibovitz içinde ötenazi sonra 25-60 dakika içinde CPEC kirpikler hareketini kaydedinL-15 ortamı. </li></ol> Silier Hareketinin Analizi 3. <ol><li> El ile bilgisayar monitöründe her cilium kalıplarını yenerek izleyebilirsiniz. Her cilium yörünge bilgisi için monte edilen fare işaretçisi, her karede Mark silier ucu pozisyonları. Ya daha fazla analiz için diğer daha genel uygulamalara aynı yazılımı veya ihracat kullanarak yörünge bilgileri analiz. Bu analiz, aşama verimi Tartışma tarif edilmektedir. </li><li> Gözle hareket iki mod, geri ve ileri-veya dönme içine yörüngeleri sınıflandırır. </li><li> Aşağıdaki formülü kullanarak siliyer dayak frekansı (CBF) hesaplayın: [CBF = (saniyedeki kare sayısı) / (Tek beat için kare ortalama sayısı)], bir siliyer ucu hareket şemasında elde edilebilir 14, (Şekil 3 ). Aynı hücrede başka kirpikler, her ciliu hareketi engelleyebilir, çünkü, birden fazla siliyer çırpma döngüsü için bu hesaplama tekrarlayınm, düzensizlik ile sonuçlanır. </li><li> Tek bir hücrenin içinde eksenleri yenerek ciliary açısal tekdüzelik analiz etmek, her yörünge (Şekil 4) için dayak açısı θ tanımlar. Geri ve ileri-yörüngeleri için, düz bir çizgi kirpikler ucu pozisyonlarını uygun ve satır x -Axis ile yapar açı olarak θ tanımlar. Rotasyonel yörüngeleri, bir elips pozisyonları uygun ve elipsin büyük eksen x -Axis ile yapar açı olarak θ tanımlar. Fitingin ayrıntıları Örnek Sonuçlar bölümünde tarif edilmektedir. </li><li> Her yörüngenin kantitatif açıklaması için, genelleştirilmiş boy oranı AR hesaplayın. Kısaca, göre yörünge döndürme - θ ve X boyunca dağılımının genişliğine arasındaki oran olarak AR tanımlar - ve y -axes (Şekil 4B). Detaylar Temsilcisi Sonuçlar bölümünde gösterilen ve yorumlama vardır, Önemi ve parametre sınırlama Tartışma açıklanmıştır. </li></ol> SEM 4. Numune Hazırlama Not: SEM kapsamlı bir şekilde CPECs üzerinde kirpikler durumunu değerlendirmek için önemli bir yöntemdir. SEM için örnekler hazırlamak için, standart bir prosedür daha önce 15 hafif değişiklikler kullanılmaktadır bildirdi. <ol><li> Beyin dokusu kesme önce, bir polietilen bir kap ile 5 ml&#39;lik bir cam şişe içinde fiksatif hazırlar. sabitleyici% 2 paraformaldehid, 0.1 M fosfat tampon maddesi, pH 7.4 içinde% 2.5 glutaraldehid (yarım Karnovsky çözeltisi 16) oluşur. </li><li> 1. adımda anlatıldığı gibi beyin doku parçalara ayır. </li><li> Kısaca, yeni bir tabağına Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile izole edilmiş doku yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir cam şişe içinde sabitleyici doku tamir. Tek kullanımlık transferi pipetler kullanın ve örnekleri ge koluntly. HBSS içinde durulama sonra, doku yapışkan hale gelir. <ol><li> Sabitleyici çözeltisi içine örnekleri aktarmak için yavaş bir damlacık olarak transfer pipeti doku ihtiva eden bir çözelti, az miktarda dışarı atılması ve sabitleştirici ekleyin. </li></ol></li><li> Tespit edildikten sonra, Fiksatif atmak ve fosfat tamponu ile üç kez doku durulayın. </li><li> Kalan aldehit yıkamak için% 10 sukroz çözeltisi doku daldırın. Aldehitlerin tamamen ortadan kaldırılmasını sağlamak 10 dakika boyunca çözelti içinde numune sokmak ve daha sonra, taze,% 10 sakaroz ile iki kez tekrarlayın. Bu adım, daha sonraki kademelerde, uygun post-fiksasyon elde etmek için önemlidir. </li><li> 30 dakika boyunca fosfat tamponu içinde% 1 ozmiyum tetroksit çözeltisi içinde doku daldırın ve sonrası sabitleme için buz üzerine yerleştirin. Numune rengine göre osmification derecesini Yargıç: aldehitler tamamen kaldırıldığında, örnek siyahtır. </li><li> Çift damıtılmış ile yoğun sonradan tespit doku örnekleri yıkayınd suyu birkaç kez. </li><li> Kademeli derişimlerde etanol içine daldırma ile örnekleri kurutmak, genellikle,% 65,% 75,% 85,% 95,% 99 ve% 100, 10 dakika her biri için. Yeni satın alınan şişe% 99.5 etanol içine moleküler elekler koyarak susuz etanol elde edilir. Susuz etanol ile üç kez dehidratasyon tekrarlayın. </li><li> 10 dakika boyunca, izoamil asetat, kritik nokta kurutma için bir ikame reaktifine susuz numuneler. İki kez bu adımı yineleyin. Bu reaktif hızla buharlaşır ve örnek yüzey gerilimi tarafından imha sonuçlanan kuru olabilir. Bu nedenle, tamamen kurumasını örnek yok. </li><li> Izoamil asetat nihai değişimi hemen sonra, çözücünün büyük bir kısmının çıkarılması, alüminyum folyo ile açık cam şişe kaydırmak ve kuru buz üzerinde şişe yerleştirin. Sıvı karbon dioksit, kritik nokta kurutma şişenin içine kolay akar, böylece bir iğne ya da ince forseps kullanılarak, şişenin ağzını kapsayan folyo çok delik açmak. Sonraki adıma geçinolabildiğince çabuk. </li><li> Bu adımda, kurutma odasına isoamil asetat taşınmasını en aza indirmek, ancak numune tamamen kritik nokta kurutmadan önce kurumaya izin vermeyin. Buna ek olarak, şişe üzerindeki don oluşumunu önlemek için gereğinden uzun bir süre boyunca kuru buz üzerinde örnek bırakmaz. </li><li> Çıkarmadan su dokusunda bulunan iken doku yüzey yapısı bozulmadan kalır sağlayan kritik nokta kurutucu içine doku örnekleri içeren folyo sarılı cam şişeleri aktarın. Kritik nokta kurutma işletim ile ilgili detaylı bilgiler üreticinin talimatlarına elde edilebilir. </li><li> Dikkatle mekanik zararı en aza indirmek için bir kürdan kullanarak örnekleri taşıyınız. Elde edilen kurutulmuş doku örnekleri kırılgandır. Bir iyon püskürtmeye kullanarak altın paladyum metal taslakları ve ceket örnekleri monte edin. </li></ol> SEM ile 5. Gözlem <ol><li> SEM ile gözlemleyin ve bir dijital kamera ile görüntüleri kaydedebilirsiniztaramalı elektron mikroskobu ile donatılmış. </li><li> Analiz için bir bilgisayara dijital görüntü verilerini aktarın. </li></ol>

<ol><li>Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+ciliary+motility+on+choroid+plexus+epithelial+cells+during+the+perinatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period.</a> Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).</li>
<li>Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+cilia+in+developmental+disorders+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The roles of cilia in developmental disorders and disease.</a> Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).</li>
<li>Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+cilia+go+bad%3A+cilia+defects+and+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).</li>
<li>Oh, E. C., Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+in+vertebrate+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia in vertebrate development and disease.</a> Development. 139 (3), 443-448 (2012).</li>
<li>Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+cilia+of+human+airway+epithelia+are+chemosensory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory.</a> Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).</li>
<li>Kiprilov, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+in+culture+possess+primary+cilia+with+hedgehog+signaling+machinery%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery).</a> The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).</li>
<li>Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+flow+and+the+generation+of+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal flow and the generation of left-right asymmetry.</a> Cell. 125 (1), 33-45 (2006).</li>
<li>Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+multiple+primary+cilia+reveals+a+novel+mode+of+ciliary+development+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals.</a> Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).</li>
<li>Takeda, S., Narita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+vertebrate+cilia%2C+towards+a+new+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).</li>
<li>Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+polyglutamylation+is+essential+for+airway+ciliary+function+through+the+regulation+of+beating+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).</li>
<li>Foster, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+ciliary%2Fflagellar+beating+of+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the ciliary/flagellar beating of Chlamydomonas.</a> Methods in Cell Biology. 91, 173-239 (2009).</li>
<li>Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+digital+imaging+of+ependymal+cilia+in+the+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain.</a> Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).</li>
<li>Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nodal+cilia+movement+and+measurement+of+nodal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow.</a> Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).</li>
<li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beat+pattern+is+associated+with+specific+ultrastructural+defects+in+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+and+kinesin+superfamily+protein+KIF3A%3A+new+insights+in+determination+of+laterality+and+mesoderm+induction+by+kif3A-%2F-+mice+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis.</a> The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).</li>
<li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolarity+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim. Bu yazıda izole koroid pleksus dokularda kirpikler hareketliliğini gözlemlemek için detaylı metodoloji raporlama amaçlamaktadır. Bilimsel yenilikler önceki çalışmalarda 1,8 olarak bildirilmiştir.

Bu yöntemin Perspektifler Burada açıklanan teknik daha önce yayınlanmış yöntemlere göre silya daha ayrıntılı bir analiz sağlamak olmamasına rağmen, bu tekniğin önemi kolayca siliyer hareketlilik ex vivo her türlü tarama uygulanabilir sistem ve maliyet etkinliği, sadeliği bulunur. Özellikle, TI Workbench gözlemlemek ve daha kolay siliyer hareketliliğini analiz araştırmacıları sağlayan basit ve kullanıcı dostu bir arayüz sağlar. Etkili otomatik izleme yöntemleri, video geliştirilmiş k...

Kirpikler, çoğu omurgalı hücresinin yüzeyindeki kıl benzeri çıkıntılardır ve siliyopatiler 2-4 olarak adlandırılan bir hastalık sınıfı nedeniyle tıp araştırmacıları tarafından dikkat çekmiştir. Organelin her yerde ekspresyonuna rağmen, motilite ve biyosensitasyon dahil olmak üzere çok çeşitli siliyer fonksiyonlar bildirilmiştir. Örneğin, mukoepitelyal yüzeydeki hareketli kirpikler, mukus5'i ve epitel kalıntılarını yolların çıkışına taşır, böylece epitel yüzeyini temizleyerek hastalığı önler. Ayrıca, erken gelişim dönemlerinde ve embriyonik aşamalarda, kirpikler kök hücrelerin6 çoğalmasını düzenler ve omurgalı gövdesinin7 sol-sağ asimetrisinin belirlenmesinde rol oynar. 
Koroid pleksus epitel hücreleri (CPEC'ler), beyindeki koroid pleksus dokusunun yüzeyini kaplayan nöroepitel hücrelerinin türevleridir ve beyin omurilik sıvısı (BOS) üretimi ile intrakraniyal ortamın homeostazının korunmasında önemli roller oynar. Daha önce, CPEC'lerin, özellikle kirpikler8 üzerinde yoğunlaşan G-proteinine bağlı reseptörler aracılığıyla BOS üretimini düzenleyen çoklu hareketsiz kirpiklere sahip olduğu gösterilmiştir. Bu kirpikler hareketsiz hareketsiz kirpikler olarak kabul edilmesine rağmen, bazı CPEC kirpiklerin yenidoğan döneminde geçici hareketlilik sergilediği keşfedilmiştir1. Bu bulgu oldukça önemliydi, çünkü hareketsiz kirpiklerin gelişimin başlangıcından itibaren mutlaka hareketsiz olmadığını ve muhtemelen belirli fizyolojik taleplere ve işlevlere yanıt olarak belirli zaman pencerelerinde geçici hareketlilik gösterebileceğini ortaya koydu9. CPEC kirpiklerin hareketli doğasını tam olarak tanımlamak için, CPEC kirpiklere özgü kinetik profillerin analizini kapsayan bir ex vivo gözlem sistemi geliştirmek gerekir. 
Motilite ile ilgili olarak, birkaç teknik rapor, trakeal epitel5,10'un motil kirpikleri, konvansiyonel motil kirpikler12 ve nodal kirpikler13 olarak adlandırılan hareketli tek hücreli kamçı11'in gözlemlerini tanımlamış olsa da, koroid pleksus gibi nispeten dalgalı yapılara uygulanabilen ayrıntılı analitik yöntemler şimdiye kadar iyi belgelenmemiştir. Ayrıca, pahalı yüksek hızlı kameraların vazgeçilmez olduğu CPEC'lerin siliyer hareketini analiz etmek için yüksek bir zaman çözünürlüğü gereklidir. Bu gerekliliği aşmak ve çeşitli hücre tiplerinin siliyer motilitesinin izlenmesini basitleştirmek için, düşük maliyetli, yüksek hızlı bir kamera tanıtılmış ve özellikle her bir siliumun hareket hızını ve modelini tanımlamak için hareketli kirpiklerin motilitesini kaydetmek için kolay erişilebilir ve kullanışlı bir yöntem geliştirilmiştir1. Ayrıca, motilitenin ayrıntılı analizini kolaylaştırmak için orijinal görüntü analiz yazılımı "TI Workbench" kullanılmıştır. Toplu olarak, bu yöntem, çok çeşitli silyum araştırmalarında benimsenebilecek bağıntılı taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile birlikte siliyer hareketi analiz etmek için yeni bir özlü strateji sağlar.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Gerekli reaktifler</td></tr><tr><td colspan="4">canlı hücre görüntüleme için</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Wako Kimyasalları</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 orta</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>SEM hazırlığı için</güçlü></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Wako Kimyasalları</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in dengeli tuz çözeltisi</td><td>Life Technologies</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehit&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehit&nbsp;</td><td>Nacalai tesque</td><td>17003-05</td><td></td></tr><tr><td>izoamil asetat</td><td>Nacalai tesque</td><td>02710-95</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler Elekler 4A 1/8&nbsp;</td>Susuz etanol fosfat tampon salin (PBS) <td>hazırlanması için</td> <td>Wako Chemicals</td><td>130-08655</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>fosfat tamponu, 0.1 M</td><td></td><td></td><td>100 ml yapmak için 19.0 ml 0.1&nbsp karıştırın; M NaH2PO4 ve 81.0 ml 0.1&nbsp; M Na2HPO4</sub</td></tr><tr><td>>monosodyum fosfat (dihidrat)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31718-15</td><td></td></tr><tr><td>disodyum fosfat (susuz)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31801-05</td><td></td></tr><tr><td>suclose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td></td></tr><tr><td>osmiyum tetroksit</td><td>Nisshin EM</td><td>300</td><td></td></tr><tr><td>kuru buz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Diseksiyon için alet ve malzemeler</td></tr><tr><td colspan="4">hem canlı görüntüleme hem de SEM hazırlığı için</td></tr><tr><td>stereo mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>düz kağıt havlu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Phi; 10 cm plastik tabak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ml beher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>düz çalıştırma makası</td><td>Sansyo</td><td>S-2B</td><td></td></tr><tr><td>saatçi forseps</td><td>Dumont</td><td>No.DU-3 veya -4, INOX</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">canlı hücre görüntüleme için</güçlü</td></tr><tr><td>>cam alt çanak</td><td>Matsunami Cam</td><td>D110300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>SEM hazırlığı için</güçlü></td></tr><tr><td>alüminyum folyo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml polietilen kapaklı cam şişe</td><td>Nichiden Rika-Glass</td><td>PS-5A</td><td></td></tr><tr><td>transfer pipeti</td><td>Samco Scientific</td><td>SM251-1S</td> numune <td>transferi için</td></tr><tr><td>kürdan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>altın-paladyum</td><td>Hitachi</td> <td>ile numune transferi iyon püskürtme için kürdanE-1030</td><td></td></tr><tr><td>kritik nokta kurutucu</td><td>Hitachi</td><td>HCP-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Mikroskobik ekipman ve malzemeler</td></tr><tr><td colspan="4">canlı hücre görüntüleme için</güçlü></td></tr><tr><td>ters mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>100 W cıva yumru muhafazası ve güç kaynağı</td><td>Olympus</td><td>U-ULH ve BH2-RFL-T3</td><td></td></tr><tr><td>100 W cıva lambası</td><td>Ushio</td><td>USH103D</td><td></td></tr><tr><td>DIC kondansatör, n.a. 0.55</td><td>Olympus</td><td>IX-LWUCD</td><td></td></tr><tr><td>elektrikli deklanşör</td><td>Vincent Associates</td><td>VS35S22M1R3-24 ve VMM-D1</td><td>manuel deklanşör kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Bant geçiren filtre (400-700&nbsp; nm, & Phi; 45&nbşk; mm)</td> <td>Koshin Kagaku</td><td>C10-110621-1</td><td></td></tr><tr><td>ND filtresi (&Phi; 45 mm)</td><td>Olympus</td><td>45ND6, 45ND25</td> %<td>25 ve %6 ND filtre kombinasyonu,</td></tr><tr><td>DIC elemanlı objektif lensi (suya daldırma)</td> kullanılır <td>Olympus</td><td>UApo 40XW/340, n.a., 1.15 ile IX-DPAO40</td><td></td></tr><tr><td>yüksek hızlı video kamera</td><td>Allied Vision Technologies</td><td>GE680</td><td>&#8805; 200 Hz kare hızı ve 1 msn pozlama süresi</td></tr><tr><td>görüntü elde etme / analiz yazılımı</td>, <td>yüksek kare hızlarında çekim yapabilen</td> <td>TI Workbench</td><td>yazılımı</td>.</tr><tr><td>Kamera kontrolü / analizi için PC</td><td>Apple</td><td>Mac Pro</td><td></td></tr><tr><td>titreşim izolasyon masası</td><td>Meiritsu Seiki</td><td>AD0806</td><td></td></tr><tr><td>doku ağırlığı</td><td>Warner Instruments</td><td>dilim ankraj kitleri</td><td>U şeklinde sıkılmış naylon ağ ile yapılabilir, ezilmiş & Phi; 0.5&nbsp; mm platin tel.</td></tr><tr><td>kapak camı (doku için alternatif ağırlık)</td>Sipariş <td>üzerine yapılan</td> <td>matsunami</td><td>Doku ağırlığı olarak bir kapak camı kullanılabilir.</td></tr><tr><td colspan="4">SEM/strong><</td></tr> için ters <tr><td>çevrilmiş mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>taramalı elektron mikroskobu</td><td>JEOL</td><td>JSM-6510</td><td></td></tr></tbody></table>

koroid pleksus epitel hücreleri silier hareketi gözlem<em&gt; ex vivo</em

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Koroid pleksus, beynin ventriküler duvarında bulunur ve ana işlevinin beyin omurilik sıvısı üretimi olduğuna inanılır. Koroid pleksus dokusunun yüzeyini kaplayan koroid pleksus epitel hücreleri (CPEC'ler) çok sayıda benzersiz kirpik barındırır, ancak bu kirpiklerin işlevlerinin çoğu araştırılmayı beklemektedir. CPEC kirpiklerin işlevini, özellikle motilitelerine atıfta bulunarak ortaya çıkarmak için, embriyonik, perinatal ve postnatal dönemlerde siliyer motiliteyi izlemek için bir ex vivo gözlem sistemi geliştirilmiştir. Koroid pleksus, beyin ventrikülünden diseke edildi ve diferansiyel girişim kontrast optikleri ile donatılmış video ile geliştirilmiş kontrast mikroskobu altında izlendi. Bu koşul altında, CPEC kirpiklerin hareketli profillerini birkaç saat boyunca ex vivo olarak analiz etmek için basit ve kantitatif bir yöntem geliştirilmiştir. Daha sonra, kirpiklerin morfolojik olgunluğu ile motilite arasındaki ilişkiyi aydınlatmak için tarama elektron mikroskobu ile gelişim sırasında kirpiklerin morfolojik değişiklikleri gözlendi. İlginç bir şekilde, bu yöntem, doğum sonrası gün (P) 2'de zirve yapan kirpiklerin sayısı ve uzunluğundaki değişiklikleri tanımlayabilirken, dayak sıklığı P10'da maksimuma ulaştı ve ardından P14'te ani bir durma izledi. Bu teknikler siliaların çeşitli dokulardaki fonksiyonlarının aydınlatılmasını sağlayacaktır. İlgili teknikler önceki bir raporda1 yayınlanmış olsa da, mevcut çalışma CPEC kirpiklerin ex vivo motilitesini ve morfolojisini gözlemlemek için ayrıntılı tekniklere odaklanmaktadır.

Iş akışının bir bakış cihazları görüntü dahil olmak üzere Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. CPECs Canlı hareket gözlemleri Film 1 Bir perinatal fare izole CPECs bir film gösterir ve Film 2 Film 1 görüntüleri genişletilmiş bir görünümünü gösterir. Bireysel siliyer ipuçları filmlerde kıyasla hareketsiz görüntülerde daha az net olduğunu belirtmek gerekir. 2 gösterileri Şekil Film 1 ve...

Bu çalışmada, ayrıntılı bir ışık mikroskobik tekniği, ultrastrüktürel analiz için bir elektron mikroskobik yöntemle birlikte CPEC kirpiklerin ex vivo hareketinin gerçek zamanlı gözlemi ve analizi için optimize edilmiştir.

Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, koroid pleksus epitel hücresi silyalarının ex vivo hareketini analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle koroid pleksus dokusunu izole etmek için bir fare embriyosundan veya yavrusundan beynin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Siliyer hareketler, diferansiyel girişim kontrastı veya DIC mikroskobu ile görselleştirilir ve ardından siliyer uç konumlarının manuel olarak takip edilmesi için siliyer uçların dijital bir filmi kaydedilir.Nihayetinde, Celia'nın yeniden oluşturulmuş uç hareketleri, hareketlerinin örüntülerine göre kategorize edilir ve nicelleştirilir. Bu yöntem, hücre biyolojisindeki "Celia mortalitesi gelişim sırasında nasıl kontrol edilir?" ve "hareketlilik örüntüsü zamanla nasıl değişir?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin uygulama alanı, patofizyolojik analiz ve teşhise kadar uzanmaktadır.Kinetik Suriye hakkındaki temel anlayışlarımız hala yetersiz olduğu için Suriye ile ilişkili hastalıklar söz konusudur. Dekapitasyondan hemen sonra, %70 etanol ile durulanmış neonatal fare başını, steril 10 santimetre çapındaki bir kapta buz gibi soğuk Leibovitz L 15 medyumuna yerleştirerek başlayın. Ardından, kafa derisini kafatasından ayırmak için bir çift saatçi pensi kullanın.Ardından, beyni açığa çıkarmak için kafatasını longitudinal sütür boyunca median kesiyle açın ve tüm organı toplamak için kranial sinirleri kesin. İzole edilen beyni, dorsal kısmı yukarı bakacak şekilde taze buzla soğutulmuş besiyeri ile dolu yeni bir kaba aktarın ve kabı bir stereo mikroskobun altına yerleştirin. Daha sonra dokuyu, olfaktör bulblar saat üç yönünde olacak şekilde yönlendirin ve beyni saatçi pensiyle nazikçe kavrayın.Diğer elinizle, serebral hemisferleri serebral gövdeye bağlayan serebral ponsları kesmek için ince diseksiyon pensi kullanın. Hemisferleri daha fazla ayırmak için Dion Cephalon'u sıkıştırarak çıkarın ve kesilen yüzey yukarı bakacak şekilde yerleştirin; ardından, hipokampusun lateral tarafına yapışık olan lateral ventriküler koroid pleksusu çıkarmak için lamina afia'yı çekin. Koroid pleksus izole edildiğinde, dokuyu taze besiyeri içeren 35 mm'lik cam tabanlı bir kaba aktarın ve dokuyu hafifçe yerinde tutmak için üzerine bir ağırlık yerleştirin; ötanazyadan sonraki 25 ila 60 dakika içinde, objektif lensin odağını gözle ayarlayarak koroid pleksus epitel hücresi Celia'nın canlı görüntülemesine başlayın.Kondanseri, merkez ve odaklama Köhler aydınlatmasına uygun olacak şekilde ayarlayın. Ardından, DIC optiğine uygun olması için ışık yoluna ilgili optik elemanları yerleştirin. Görüntülerin kontrastını, dokunun yüzey yapısının net bir şekilde fark edilebileceği bir konuma getirmek için DIC prizmasını hareket ettirin.Ardından ışık yolunu video kameraya yönlendirin ve ışık gücünü artırın. Nötr yoğunluk filtrelerini çıkararak bir gözlem alanı ayarlayın ve odaklama yapın; video kameranın zamansal çözünürlüğünü 200 hertz'e ve pozlama süresini istenen görüntüleme süresi için 0.1 milliseconds değerine ayarlayın. Daha sonra görüntüleri edinin; görüntü yığını elde edildikten sonra, her bir tek kare her bir silyumun vuruş modellerini manuel olarak takip etmek için silyumların net bir görüntüsünü sunacaktır.Her karede siliyer uçların konumunu işaretlemek için fare imlecini kullanın. Ardından, uygun yazılımı kullanarak yörünge verilerini analiz edin ve yörüngeleri gözle, ileri-geri veya rotasyonel olmak üzere iki hareket modundan birine sınıflandırın. Formülü kullanarak, birden fazla siliyer vuruş döngüsü için siliyer vuruş frekansını hesaplayın.Aynı hücre üzerindeki diğer siliyumlar her bir siliyumun hareketini etkileyebileceği için, bir sonraki adımda tek bir hücre içindeki siliyer çırpınma eksenlerinin açısal tekdüzeliği analiz edilir. İleri ve geri yörüngeler için, siliyum uçlarının konumları düz bir hatta oturtulur ve bu hattın X ekseniyle yaptığı açı theta olarak tanımlanır.Rotasyonel yörüngeler için, elipsin ana ekseninin x ekseniyle yaptığı açıyı theta olarak tanımlayarak konumları bir elipse uydurun. Son olarak, her bir yörüngenin kantitatif tanımı için, yörüngeleri theta kadar döndürerek görünüş oranlarını, x ve y eksenleri boyunca dağılım genişlikleri arasındaki oranlar olarak tanımlayın. Bu ilk klipte, yüksek hızlı video mikroskopisi ile görüntülenen, postnatal ikinci gün mouse yavrusundan alınan siliyalı koroid pleksus epitel hücrelerinin üstten görünümü gösterilmektedir; koroid pleksus dokusunun düzensiz yüzeyi, dokunun hem odak düzleminde hem de odak dışı düzlemlerde görünür olmasını sağlar.Bu ikinci klipte, önceki videodaki kutu içine alınmış alanın büyütülmüş bir görünümü sunularak, tek bir siliyumun sergilediği rotasyonel ve ileri-geri hareketlerin daha yakından gözlemlenmesi sağlanmıştır. Burada, birden fazla döngü boyunca video kayıtlarından yeniden oluşturulan temsili siliyum ucu hareket yörüngeleri, ucun x ve y koordinatlarının zaman seyirleri grafiklerde çizilmiş olarak sunulmuştur. Bu grafiklerdeki iki koordinat arasındaki faz kaymasını göstermek için, x ve y koordinatları normalize edilmiş ve üst üste bindirilmiştir.Hareketli CLIA'lar canlı görüntüleme ile kolayca tanınabilirken, hareketsiz CLIA'ları bu yöntemle belirlemek kolay değildir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, hareketliliklerinden bağımsız olarak clia'ların bütünsel görüntülerini elde etmek adına taramalı elektron mikroskobu vazgeçilmez olabilir. Bu prosedür uygulanırken, örneğin tazeliğinin korunması ve Syria'nın hareketliliğinin sürdürülmesi için disseksiyonun yeterince hızlı gerçekleştirilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, viral seriyle doku örneklerinin nasıl hazırlanacağını, ayrıca CX vivo mortalitesinin nasıl izleneceğini ve nicelleştirileceğini iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.

observation-ciliary-movement-choroid-plexus-epithelial-cells-ex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, oküler mikrovasküler anjiyogenezi incelemek için bir ex vivo koroid filizlenme modelinin geliştirilmesini göstermektedir. Test, koroidal mikrovasküler filizlenmeyi teşvik eden belirli koşullar altında sklera ve retina pigment epiteline bağlı koroid dokusunu içeren fare gözü eksplantlarının kültürlenmesini içerir.

Oküler mikrovasküler proliferasyonu ex vivo incelemek için koroid filizlenme testi

Bu video, fare koroid pleksuslarından bağışıklık hücrelerini izole etme prosedürünü göstermektedir. Bu prosedür, koroid pleksuslardaki bağışıklık hücrelerinin beyin sağlığını ve çeşitli nörolojik hastalıkları nasıl etkilediğini anlamak için nöroimmünoloji araştırmalarında kullanılır.

Fare Koroid Pleksuslarından İmmün Hücrelerin İzole Edilmesi

Source: Al Omran, A. J., et al. Fare beyninin lateral ventriküllerindeki ependimal kirpiklerin canlı görüntülenmesi. J. Vis. Exp. (2015). Bu video, ependimal vuruşunu gözlemlemek için diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu kullanan bir canlı görüntüleme tekniğini göstermektedir Sagital fare beyin bölümlerinde kirpikler. Ependimal kirpikler beyin omurilik sıvısını (BOS) iter ve aktiviteleri, besin açısından zengin bir ortamda tutulan beyin bölümlerinde kaydedilir ve iklim kontrollü bir...

Bir fare beyin bölümünde ependimal hücreli siliyer aktivitenin canlı görüntülenmesi

Kaynak: Van Wonterghem, E.,  et al. Fare Koroid Pleksusunun Mikrodiseksiyonu ve Tam Montajlı Taramalı Elektron Mikroskobu Görselleştirmesi. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak bir fare beyninden alınan koroid pleksus dokusunun hazırlanmasını ve görüntülenmesini göstermektedir. İşlem, numuneyi stabilize etmek ve görüntülemeye hazırlamak için doku fiksasyonu, dehidrasyon ve iletken bir platin tabaka ile kaplamayı içerir. SEM, mikrovilluslu epitel...

Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanılarak Bir Fare Beyin Koroid Pleksusunun Görselleştirilmesi

Yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullanılarak, fare beyin ventriküller içinde yer alan hareketli ependim kirpikler dayak bir ex vivo gözlem canlı görüntüleme ile gösterilmiştir. teknik, özel bir siliyer atan frekansının kayıt ve dayak açısı aynı zamanda bunların hücre içi kalsiyum salınım ilerleme hızı özellikleri sağlar.

Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Koroid pleksusun (CP) epitel hücreleri kan-beyin omurilik sıvısı bariyerini (BCSFB) oluşturur. BCSFB'nin in vitro modeli, insan koroid pleksus papilloma (HIBCPP) hücrelerini kullanır. Bu makale, bir hücre kültürü filtre ekleme sistemi kullanılarak HIBCPP hücrelerinin kültürlenmesini ve bazolateral enfeksiyonunu açıklamaktadır.

İnsan Kan BOS Bariyer A Koroid Pleksus Epitel Hücre bazlı Modeli bazolateral Side Bakteriyel Enfeksiyon Eğitim için

Bu iletişim kuralı, yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran retina pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının göstermek için hedeftir. Bu yöntem RPE hücre davranış güvenliği aşılan bir hücre dışı matriks üzerinde çalışmaya uygundur.

Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

Bu protokolün amacı, subakut oküler hipertansiyonu indükleyen limbal vasküler pleksusun 360° termik koterizasyonuna dayanan yeni bir glokomatöz nörodejenerasyon modelini karakterize etmektir.

Kemirgenlerde Cerrahi Olarak İndüklenen Glokom için Limbal Vasküler Pleksusun Tam Daire Koterizasyonu

Bu çalışmada akım sitometrisi ve izole perfüze edilmiş farelerin beyin koroid pleksusları üzerinde iki farklı geçit stratejisi kullanılmaktadır; Bu protokol, bu beyin yapısını dolduran ana bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlar.

Mikro Disseke Fare Koroid Pleksuslarından İmmün Hücrelerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Nörobilimde az çalışılmış bir doku olan koroid pleksus (SP), merkezi sinir sisteminin sağlığında ve hastalığında önemli bir rol oynar. Bu protokol, SP'yi izole etmek için bir mikrodiseksiyon tekniğini ve hücresel yapısının genel bir görünümünü elde etmek için taramalı elektron mikroskobunun kullanımını açıklar.

Fare Koroid Pleksusunun Mikrodiseksiyonu ve Tüm Montajlı Taramalı Elektron Mikroskobu Görselleştirmesi

Keşfedin koroid pleksus epitel hücrelerinin silier hareketini ex vivo analiz etme yöntemini. Fare embriyolarından doku izolasyonu ve DIC mikroskobisi kullanarak gelişim biyolojisinde silier motilite kontrolünü inceleyin.

Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem

Daha fazla video keşfet