Dalbavansin için Başvuru sıvı mikrodilüsyon yöntemi İn Vitro Duyarlılık Testi

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, dalbavansin için minimum inhibitör konsantrasyonu belirlemektir. Bunu yapmak için Dalbavancin'e özgü temel adımlara odaklanarak et suyu mikro seyreltme yöntemini kullanın. Dalbavansinin stok ve ara seyreltilmesi DMSO'da yapılır ve son seyreltme, polisorbat ile takviye edilmiş ayarlanmış Mueller Hinton suyu üzerinde katyon halinde yapılır.

Seyreltme, 96 oyuklu bir plakaya dağıtılır ve standart bir bakteri süspansiyonu ile aşılanır. Plaka daha sonra 16 ila 24 saat inkübe edilir ve bakteri üremesini engellemek için gereken minimum dalbavansin miktarını belirlemek için incelenir. Bu standartlaştırılmış yönteme bağlılık, hem klinik izolatlarla tutarlı sonuçlar sağlayacaktır hem de burada gösterildiği gibi, kalite kontrol izolatları Dalbavancin, Mayıs 2014'te FDA tarafından akut bakteriyel cilt ve cilt yapısı enfeksiyonlarının tedavisi için onaylanan yarı sentetik bir lipo glikopeptid antimikrobiyal ajandır.

Bu yöntem, ajanın plastiğe yapışmasını hafifletmek için polisorbat 80'de stok çözeltileri hazırlamak için DMSO'nun kullanımını içeren dassin için standartlaştırılmış et suyu, mikro seyreltme duyarlılık yöntemini açıklar Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi yararlıdır. Stok ve MIC plakası olarak, çözelti hazırlama adımları çoğu antimikrobiyal ajanla karşılaştırıldığında tipik değildir. Bu adımlar lipo Glikopeptid ajanlarına özgüdür ve tekrarlanabilir ve doğru MIC sonuçları elde etmek için izlenmesi önemlidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırma bilimcisi olan Gina Fisher olacak. Aşağıdaki prosedürü gerçekleştirirken biyogüvenlik seviyesi iki ile tutarlı uygun güvenlik önlemlerinin kullanılması gerektiğini lütfen unutmayın. Mililitre başına 800 mikrogramlık bir stok çözeltisi hazırlamak için uygun miktarda dalbavancin tartarak başlayın.

Steril bir cam veya plastik tüpe uygun miktarda NEAT DMSO ekleyin, ardından tozu tüpe aktarın ve girdaplayın. Önümüzdeki. Mililitre başına 800 mikrogram DALBAVANCIN stok çözeltisini kullanarak, bir ila dört sütunda gösterildiği gibi 100 x nihai MIC plaka konsantrasyonlarını hazırlayın. Bunlara ara konsantrasyonlar denir.

Hazırlanan toplam hacim, MIC panellerinin sayısına bağlı olacaktır. Son olarak,% 0.004 P 80 ile desteklenmiş, C-A-M-H-B olarak da bilinen katyona ayarlanmamış Mueller Hinten suyunda ara konsantrasyonları bir ila 100 oranında seyreltin. Elde edilen DALBAVANCIN ve P 80 çalışma konsantrasyonu, nihai konsantrasyonun iki katıdır.

Aşı ilavesi, steril uçlu çok kanallı bir pipet kullanılarak bir ila iki seyreltme ile sonuçlanacağından, her bir dalbavansin seyreltmesinden 50 mikrolitreyi 96 kuyu steril mikro seyreltme panelinin uygun kuyucuklarına dağıtın. MIC plaka formatı, plaka başına sekiz inokülerin test edilmesine izin verir. Paneller hemen kullanılmayacaksa, kapatmak için plastik film uygulayın, ardından plastik torbalara koyun ve ihtiyaç duyulana kadar en az eksi 60 santigrat derecede buz çözülmeyen bir dondurucuda saklayın.

Bu gösteride, taze hazırlanmış bir tabak aşılanacaktır. Aşıyı hazırlamak için, 18 ila 24 saatlik bir kan burgusundan veya başka bir seçici olmayan burgu plakasından iyi izole edilmiş birkaç koloni seçin. Burada kalite kontrol aria ve EPHI kallöz suşları kullanılmaktadır.

Her koloninin üst kısmına steril bir çubukla dokunun ve bir kısmını bir ila beş mililitre C-A-M-H-B veya salin içeren bir tüpe aktarın. Bulanıklık, hazırlandıktan sonraki 15 ila 30 dakika içinde 0,5 McFarland standardıyla eşleşene kadar aktarmaya devam edin, mililitre başına beş kez 10 ila beşinci CFU'luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak için aşılamayı C-A-M-H-B'de bir ila 100 oranında seyreltin. Kabul edilebilir aralık, mililitre başına iki ila sekiz kez 10 ila beşinci CFU'dur.

Hemen steril uçlu çok kanallı bir pipet kullanarak, 50 mikrolitre son aşılamayı buradaki MIC panel plakasının her bir uygun kuyucuğuna aktarın. İki izolatın her biri ile izolat başına toplam dört kopya için dört sıra aşılanır. Daha sonra, bir saflık kontrolü yapmak için, pozitif büyüme kontrolündeki çözeltinin bir ila 10 mikrolitresini, %5 koyun kanı içeren decay'in soya agarını deneyin gibi seçici olmayan bir agara aktarmak için bir pipet kullanın.

Çözeltiyi plakanın yüzeyine yaymak için steril bir halka kullanın. Plakayı 90 derece çevirin ve aşının eşit şekilde dağıldığından emin olmak için tekrar çizin. Plakayı örtün ve bir kenara koyun.

Koloni sayımına hazırlanırken, büyüme kontrol kuyusundaki 10 mikrolitre çözeltiyi 10 mililitre salin karışımına aktarmak için tek kanallı bir pipet kullanın ve ardından 100 mikrolitreyi seçici olmayan uygun bir tarım ortamına aktarın, örneğin deneyin Toay soya agar steril bir halka kullanarak% 5 koyun kanı ile, çözeltiyi tüm tarım yüzeyine yayın. Aşının eşit dağılımını sağlamak için bu işlemi farklı yönlerde iki kez tekrarlayın. Ardından, üst panelin bir kapakla sıkıca kapatıldığından emin olarak plastik bir kapta dört adede kadar MIC panelini istifleyin.

Ardından plastik kabın içine nemli bir kağıt havlu yerleştirin ve aşılamadan sonraki 30 dakika içinde kapakla güvenli bir şekilde kapatın. MIC panellerini, koloni sayım plakasını ve saflık kontrol plakasını bir ortam havası inkübatöründe 35 artı veya eksi iki santigrat derecede 16 ila 20 saat inkübe edin. Ertesi gün, çıplak gözle tespit edilen kuyucuklarda bakteri üremesini tamamen engelleyen en düşük konsantrasyon olarak minimum inhibitör konsantrasyonu okuyun.

Koloni sayım plakasındaki koloni sayısını belirleyin. Sayılan sayıyı seyreltme faktörü ile çarpın. Örneğin, 50 koloni çarpı 10.000'lik bir seyreltme faktörü, mililitre başına beş çarpı 10 ila beşinci CFU'ya eşittir.

Kabul edilebilir bir aralık 20 ila 80 kolonidir, bu da ml başına birimler oluşturan iki ila sekiz çarpı 10 ila beşinci koloniye eşittir. İnokulum konsantrasyonu, doğru sonuçlar elde etmek için duyarlılık testini kontrol etmek için önemli bir değişkendir. Son olarak, saflık plakasını kontrol edin.

Tüm koloniler inokulum olarak kullanılan kolonilere benziyorsa, o zaman saf olarak kabul edilebilir. Başka koloniler varsa, MIC panelinde bir kirletici madde bulunma potansiyeli vardır ve test tekrarlanmalıdır. DAL sonuçları, MIC sonuçları, burada gösterildiği gibi gri seyreltme yöntemi kullanılarak elde edilenlerle karşılaştırıldı.

Dal bevans için Agri MIC sonuçları tipik olarak et suyundan iki ila sekiz kat daha yüksektir. Mikro seyreltme, MIC sonuçları. Bu kontrast vankomisin sonuçları, et suyu ve ağrı yöntemleriyle elde edilir.

Bu nedenle, dalbavancin dalbavancin suyunun test edilmesi için ağrı seyreltmesi önerilmez. Mikro seyreltme MIC, kalite kontrol sonuçları burada gösterildiği gibi beklenen aralıklar içinde olmalıdır. SS kalite kontrol organizması, mililitre başına 0.06 mikrogramlık çok net bir modal MIC'ye sahip bir TCC 2 9 2 1 3, yöntem varyasyonunun iyi bir göstergesi olmuştur.

Elde edilen sonuçlar, kalite kontrol organizmaları için beklenen aralıkların dışındaysa veya aralığın alt veya üst ucuna doğru eğilim gösteriyorsa, yöntemin daha fazla doğrulanması garanti edilir. Kalite kontrol organizmaları, dalbavansin, bölgesel antimikrobiyal sürveyans programlarından elde edilen MIC verileri, burada gösterildiği gibi klinik laboratuvar ortamında beklenecek MIC sonuçları için bir temel sağlayabilir, Dal b Anson MIC, 2011-2013 yılları arasında Avrupa ve ABD'de toplanan izolatlar için sonuçlar, SIU'ların% 99.9'u ve streptokokların% 100'ü için mililitre başına 0.25 mikrogramdan azdı. Bu sürveyans verilerine dayanarak, mililitre başına 0.12 mikrogramdan daha yüksek stafilokoklar ve streptokoklar için dalbavansin MİK sonuçlarının nadir olduğu açıktır.

Daha yüksek sayılar görülürse, test tekrarlanmalı ve/veya doğrulama için bir referans laboratuvarına gönderilmelidir. DMSO'da stok seyreltmesinin hazırlanması ve son MIC kuyucuğunda% 0.002'lik bir konsantrasyonda et suyu seyreltmesine P 80 eklenmesi, doğru ve tekrarlanabilir dalbavancin MIC sonuçları elde etmek için kritik adımlardır Her zaman olduğu gibi, ancak özellikle bu bakteriyel direnç geliştirme alanında, doğru antimikrobiyal duyarlılık sonuçları klinisyenin uygun tedavi seçimi için kritik öneme sahiptir.