Name: Fareler Retina Pigment Epitel Gen Tedavisi için Viral Vektörler Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Öğrenin, farelerde retinal pigment epiteline viral vektörlerle gen tedavisi için subretinal enjeksiyon tekniğini. Bu yöntem, gen aktarımını kolaylaştırarak oftalmoloji araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Seul Ulusal Üniversitesi Araştırma Grant (800-20140542) tarafından desteklenen, NTG / EBTB Pioneer Araştırma Programı (2012-0009544) ve NRF / EBTB Bio-Sinyal Analizi Teknoloji İnovasyon Programı (2009-0090895), ve NRF / EBTB Hibe (2015M3A9E6028949).

Hayvanlar üzerinde deneyler tüm Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım Vizyon ve Oftalmoloji Tablosunda Araştırma Derneği göre yapılan ve kurallar ve yönetmelikler Seul Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Seul Ulusal öngördüğü edildi Üniversite Hastanesi Biyogüvenlik Komitesi. 1. Enjeksiyon Kit ve Viral Vektörler hazırlanması <ol><li> Etilen oksit gazı ile sterilize edilmiş bir 33 G, kör bir iğne ile donatılmış mikrolitre şırınga hazırlayın. Mikro tüp (yani, 1 x 10 6 TU / ml) &#39;de yeterli bir titre PBS içinde viral vektörleri ile seyreltilir. Şırınga herhangi ölü boşluğu kaldırmak için enjektörü viral vektörler ile birkaç kez yıkayın. </li></ol> Viral vektörler 2. Subretinal Enjeksiyon <ol><li> Tiletami karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile - (8 haftalık, yani, 6), yetişkin fareler anesteziKD ve zolazepam (1: 1, 2.25 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin hidroklorür (0.7 mg / kg vücut ağırlığı) ya da alternatif olarak uygun anestezi rejimi. </li><li> Fenilefrin% 0.5 göz damlası ile öğrenciler dilate ve% 0.5 tropikamid. </li><li> Viral vektörlerin 2 ul - 1.5 ile yüklenerek mikrolitre şırınga hazırlayın. </li><li> Göz kapağı açın ve uygun enjeksiyon için ekvator ortaya çıkarmak ve işletim mikroskop altında odaklanmak göz çıkıntı. Enjeksiyon sırasında oluşabilecek iğne enjeksiyonu veya deplasman bitirme kadar çıkıntı göz pozisyonunu koruyun. Sıkıca göz küresi tutun, yörünge jant dışında parmaklarını yerleştirin. </li><li> Kornea yüzeyine oftalmik viskoelastik bir çözelti damla uygulanır. </li><li> Retina görselleştirmek için kornea üstünde küçük bir yuvarlak kapak slayt yerleştirin. </li><li> Daha fazla subretinal enjeksiyon için steril 30 G 1/2 iğne kullanılarak limbusa hafif posterior küçük bir delik delmek. Fo delik aşağı olunr sağ göz ve rahatlık için sol göz için üstün. NOT: delik zamansal ya da nazal yapılır ise, enjeksiyondan sonra göz kapağında kapsamına zor. İlk ponksiyon hafifçe yapılan limbusun boyunca çalışacak ve kolayca tanınabilir limbal damarları önlemek için limbusa posteriorunda edilmelidir. İlk ponksiyon yapılırken iğne ile lensi çarpmamak için dikkatli olun. Lens ponksiyon önlemek için iğnenin tüm konik takmayın. </li><li> Önceden delinmiş delikten mikrolitre şırınga 33 G künt iğne yerleştirin ve hafif direnç hissedilir zaman noktaya kadar subretinal boşluğa iğne yaklaşım. NOT: subretinal enjeksiyon için, iğnenin en iyi yaklaşım açısı iris düzleminin karşı yaklaşık 45 derece, ve künt bir iğne peripapiller alana doğru posterior itti olmalıdır. Noktalı kare subretinal injectio için vitreus boşluğuna genelinde önerilen iğne yolu belirtilenŞekil 1 &#39;de: n. NOT: Onlar çok yumuşak olduğu gibi delici (veya geçen) retina katmanları zaman direnç hissettim olacak. Böylece, hafif direnç ilk duygu iğne zaten RPE dokundu ve iğnenin takılması durdurulması gerektiğini belirtir. İğne potansiyel subretinal alana konulmalıdır çünkü aşırı basınç skleral doku nüfuz için dikkatli olun. İğne aşırı güç tarafından skleral doku deler, bu direnç olmadan göz dışı yörünge alanlarda girer. (Bu adım önemlidir) </li></ol><img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig1.jpg" /> Subretinal Enjeksiyon Şekil 1. Şematik. H &amp; E işaretli subretinal enjeksiyon için bir iğne yolunun olan yapıları resmeden fare göz lekeli kesiti (noktalı kare). Büyütme: 40X, Ölçek çubuğu:<html> 500 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53030/53030fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="9"><li> İstenmeyen doku hasarını önlemek ve yavaşça iğneyi çekilme titreme olmadan subretinal boşluğa yavaşça viral vektörler (örneğin, 1 x 10 6 TU / ul) enjekte edilir. 2.4&#39;te tarif edildiği gibi enjeksiyon sırasında sıkıca gözün tutun. </li><li> Hiçbir retina kanaması olduğundan emin olmak için, işletim mikroskop altında enjekte edildikten sonra subretinal bleb oluşumunu gözlemleyin. </li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53030/53030fig2.jpg" /> Şekil 2. Retina Kanama olmadan Subretinal BELB Formasyonu. Işletim mikroskop altında subretinal enjeksiyondan sonra subretinal BELB mikroskopik görünümü retinal kanama olmadan başarılı bleb oluşumu göstermektedir.m / files / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <ol start="11"><li> Yavaşça kendini sızdırmazlık için enjeksiyon yerinde kapsayacak şekilde göz kapaklarını kapatın. Ev kafesine fareler dönün ve değerlendirme kadar canlı tutmak. NOT: Araştırmacılar prosedürlere alışması sonra, aşağıdaki adımları atlayarak hızlı prosedürlere tekrarlanabilir sonuçlar elde (2.5, 6, ve 10) olabilir </li></ol> Retina Pigment Epitel Gen Teslimat Etkinliğinin Değerlendirilmesi 3. <ol start="1"><li> CO2 odası içinde fareler kurban. Makas kullanılarak gözleri enükleasyon. </li><li> Birkaç gün için en az 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de% 4 paraformaldehit solüsyonunda gözleri düzeltildi. </li><li> Ince forseps ile kornea tut ve mikro-makas ile kornea delinme. Limbusun boyunca makaslama sonra kornea çıkarın. Forseps ile lensi çıkarın. </li><li> M siliyer cisim Trimretina dekolmanı izin ICRO-makas. Yavaşça RPE / koroid / sklera karmaşık bütün retinanın çekin. Düz montaj için 4 ila 8 yaprakları yapmak için optik sinir birkaç kez yakın merkeze çevresinden radyal RPE / koroid / sklera kompleksi kesin. </li><li> Aşağı RPE tarafı yapmak ve kas, konjonktiva ve optik sinir dahil skleral tarafında kalan tüm dokuları kesmek için RPE / koroid / sklera kompleksi çevirin. Kalan doku, karmaşık düzensiz hale getirir, çünkü bu adım, düz RPE / koroid / sklera kompleksi yapmak önemlidir. </li><li> (Ayrıntılı yöntemleri için referanslara bakın, isteğe bağlı) özel araştırma amaçlı birincil ve ikincil antikor ile kompleks inkübe edin. Cam slayt RPE / koroid / sklera kompleksleri Düz montaj ve emici bir sünger ile PBS emer. </li><li> Montaj çözümü 30 ul ekleyin ve kapağını kaydırarak yerleştirin. Floresein mikroskop altında vektör teslim etkinliği için örnek gözlemleyin. Örnekleri tutunDaha fazla gözlem için buzdolabı. </li></ol>

<ol><li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber%27s+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li>
<li>Jacobson, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations%3A+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).</li>
<li>Conlon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+potency+and+safety+studies+of+an+AAV2-mediated+gene+therapy+vector+for+the+treatment+of+MERTK+associated+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+gene+therapy+in+patients+with+choroideremia%3A+initial+findings+from+a+phase+1%2F2+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial.</a> Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).</li>
<li>Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+platforms+for+gene+therapy+of+inherited+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies.</a> Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).</li>
<li>Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+delivery+of+recombinant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Intraocular delivery of recombinant virus.</a> Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).</li>
<li>Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of therapeutic agents.</a> Retina. 29 (7), 875-912 (2009).</li>
<li>Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+detachment+model+in+rodents+by+subretinal+injection+of+sodium+hyaluronate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li>
<li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+transplantation+of+MACS+purified+photoreceptor+precursor+cells+into+the+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina.</a> J Vis Exp. (84), e50932(2014).</li>
<li>Sahel, J. A., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for blindness.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).</li>
<li>Allocca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adeno-associated+virus+serotypes+efficiently+transduce+murine+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors.</a> J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+transduction+of+ocular+cells+with+a+bovine+immunodeficiency+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector.</a> Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).</li>
<li>Rolling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapeutic+prospects+in+early+onset+of+severe+retinal+dystrophy%3A+restoration+of+vision+in+RPE65+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Mem+Acad+R+Med+Belg%22%5BJournal%5D)">Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).</li>
<li>Le Meur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+in+RPE65-deficient+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).</li>
<li>Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+and+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors and the retina.</a> Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).</li>
<li>Puche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+factors+associated+with+reticular+pseudodrusen+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration.</a> Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).</li>
<li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+for+neovascular+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration.</a> Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+amyloid+beta+alters+the+tight+junction+of+retinal+pigment+epithelium+in+5XFAD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice.</a> Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).</li>
<li>Shin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+cleavage+of+amyloid+beta+by+a+viral+protease+NIa+prevents+amyloid+beta-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity.</a> PLoS One. 9 (6), e98650(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu video makalede, biz RPE / koroid / sklera düz montaj temsilcisi sonuçları ile detaylı limbal-yaklaşım subretinal enjeksiyon tekniği nitelendirdi. Bu RPE viral vektörlerin retina altı enjeksiyon için kolay ve uygun bir tekniktir. Enjeksiyon sırasında kabarcık oluşumu doğrudan görselleştirme yeni başlayanlar için doğru bir teslimat için önemli bir adımdır. Visualized Experiments 8-10 Journal tanıtılan bazı subretinal enjeksiyon teknikleri vardır. Subretinal alan retina ve RPE arasındaki potansiyel boşluk, bu...

Oftalmolojide, gen terapisi monogenik miras retinopatilerin tedavi yöntemi olarak ortaya çıkmıştır. Leber konjenital amurosis 1,2, retinitis pigmentosa 3 ve Koroideremi 4 olmak üzere retina pigment epiteli (RPE) genlerin ilişkili kalıtsal retinopatiler vardır. gen tedavisi araştırma alanı preklinik çalışmalarda ve adeno virüsü enzimi yüksek yoğunluklu lipoproteinlerde (AAV), lentivirüs (LV) ve adenovirüs (Ad) gibi viral vektörler kullanılarak klinik çalışmalarda hem de genişliyor 5. Farklı viral vektörler retina farklı tropizm ihtiva. Güvenli ve etkili bir gen terapisi için viral vektörler, dikkatli bir şekilde hedef hücreler ve hedef genlerin uygun olarak seçilmelidir. etkili bir gen verici hedef hücrelere gen teslim yolu bu nedenle, dikkatli bir şekilde da seçilmelidir, da önemlidir. viral vektörlerin göz içi teslimat için en yaygın iki yöntemler subret edilirinal enjeksiyon ve intravitreal enjeksiyon 6. İkincisi, intravitreal enjeksiyon, yaygın diyabetik retinopati 7 ıslak yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD) ve maküla ödemi koroid neovaskülarizasyon tedavisi için ilaç verilmesi için kullanılır olmuştur. İntravitreal rota vitreus ve iç retina viral vektörlerin pozlama sağlar, ancak dış retinaya vektörlerin difüzyon sınırlıdır. Öte yandan, alt retinal yol lokalize bir kabarcık indükleyici, retina ve RPE arasındaki potansiyel boşluğa viral vektörlerin doğrudan dağıtım sağlar. Bu nedenle, alt retinal enjeksiyon anda fotoreseptör hücreleri ve RPE hedefleme için daha verimli bir yol olarak kabul edilir. Cerrahi yaklaşım açısından, plana insan hastalarda retina hasarı önlemek için intravitreal enjeksiyon için güvenli bir alan olarak seçilmiştir pars. Sadece farelere bu yaklaşımı değiştirerek, biz limbal yaklaşımla subretinally veya intravireally viral vektörlerin enjekte edebilir. Bu videodamakale, biz fareler RPE viral vektörlerin subretinal enjeksiyonu kolay ve uygun bir yöntem ortaya koymaktadır. 30 G 1/2 iğne ile limbusa posterior tekli delme sonra, 33 G iğne künt donanımlı mikrolitre şırınga limbal ponksiyon sitesi üzerinden subretinal boşluğa yerleştirilir. 1.5 viral vektörler - 2 ul hacminde, retina ve RPE subretinal kabarcıkları indükleyici arasındaki potansiyel boşluğa enjekte edilir. Bu prosedür, cerrahi mikroskop kullanılarak doğrudan görüş altında gerçekleştirilebilir. Tekrarlanan uygulama bile kabarcık oluşumu doğrudan görselleştirme olmadan tekrarlanabilir sonuçları garanti edecektir. Bu fareler RPE subretinal gen aktarımı için doğru ve zaman kazandıran deneyler gerçekleştirmek için araştırmacıların yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>CIMBız DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm İPUÇLARI</td><td>WPI</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>VANNAS Makas S/S, 105 mm</td><td>WPI</td><td>555583S</td><td></td></tr><tr><td>33 G Künt iğne</td><td>WPI</td><td>NF33BL-2</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil Şırınga, 10 mikrolitre;</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>RPE-KIT</td><td>WPI</td><td>RPE-KIT</td><td>Tek elle kolay enjeksiyon için</td></tr><tr><td>30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM İğne</td><td>BD</td><td>305107</td><td>Subretinal enjeksiyon için ilk delme</td></tr><tr><td>Mikroskop Kapak Camları (No. 1 3 mm çap)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720&nbsp; (CS-3R)</td><td></td></tr><tr><td>Leica ameliyat mikroskobu</td><td>Leica</td><td>LM M80</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>Thermo scientific</td><td>TMO. LV-Ctr</td><td>Vektörleri seyreltmek için kullanılır</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Vektörleri seyreltmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Troperin (Fenilefrin %0.5 - Tropikamid %0.5)</td><td>Hanmi</td><td></td><td>Dilatasyon için</td></tr><tr><td>Proparakain Hidroklorür Oftalmik Çözelti USP, %0.5 (Steril)</td><td>Bausch & </td><td>Topikal anestezi için</td>Lomb <td></td></tr><tr><td>Healon GV OVD</td><td>Abbott Medical Optics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoletil 50 (tiletamin hipoklorür ve zolazepam hipoklorür)</td> <td>Virbac</td><td></td><td>Genel anestezi için</td></tr><tr><td>Rompun enjeksiyonu (Xylazine HCl)</td><td>Bayer</td><td></td><td>Genel anestezi için</td></tr></tbody></table>

fareler retina pigment epitel gen tedavisi için viral vektörler limbal yaklaşım-subretinal enjeksiyon

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Göz, küçük ve kapalı bir organdır ve bu da onu gen terapisi için ideal bir hedef haline getirir. Son zamanlarda retinopatilerde gen tedavisinde retina ve retina pigment epiteline (RPE) non-viral ve viral gen iletimi kullanılarak çeşitli stratejiler uygulanmaktadır. Subretinal enjeksiyon, viral vektörleri doğrudan RPE hücrelerine iletmek için en iyi yaklaşımdır. Bir gen terapisinin klinik denemesinden önce, çeşitli retinopatilerin hayvan modellerinde tedavinin etkinliğini doğrulamak kaçınılmazdır. Bu nedenle, farelerde subretinal enjeksiyon, oküler gen tedavisi için temel bir teknik haline gelir. Bu protokolde, viral vektörlerin deneysel farelere subretinal enjeksiyonu için kolay ve tekrarlanabilir bir teknik sunuyoruz. Bu teknik, oftalmoloji kliniklerinde yaygın olarak kullanılan intravitreal enjeksiyondan modifiye edilmiştir. RPE/koroid/skleral kompleks düz montajın temsili sonuçları, bu tekniğin etkinliğinin anlaşılmasına ve gen transdüksiyonunun kapsamı için viral vektörlerin hacminin ve titresinin ayarlanmasına yardımcı olacaktır.

Bu protokol ile viral gen transdüksiyon üzerinde subretinal enjeksiyonunun etkinliğini değerlendirmek için, göstergesi GFP ve RFP hem ifade CMV promotör ile piyasada mevcut LV vektörleri kullanılır. Gözler araştırma amacına göre uygun süre sonra iki parçaya ayrıldı. Temsilcisi sonuçları için gözler 10 hafta ve subretinal enjeksiyondan sonra 20 hafta parçaya ayrıldı. Yukarıda tarif edilen yöntem kullanılarak, retina tamamen uzaklaştırıldıktan sonra, RPE / koroid / sklera kompleksinin düz montaj flöresanlı mikroskop altın...

Subretinal enjeksiyon, fare gözündeki retina pigment epiteline etkili gen iletimi için kullanılan cerrahi bir tekniktir. Burada, deneysel farelerde viral vektörlerin retina pigment epiteline subretinal enjeksiyonu için kolay ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Fareler Retina Pigment Epitel Gen Tedavisi için Viral Vektörler Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyon

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı bir farede hedef geni retinal pigment epiteline iletmektir. Bu işlem, önce göz kapağının açılması ve ekvator bölgesini açığa çıkarmak için göz küresinin dışarı çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, limbusun posteriorunda küçük bir delik açmaktır.Viral vektörleri küt uçlu bir iğne ile subretinal boşluğa enjekte edin ve subretinal bleb oluşumunu gözlemleyin. Son aşamada, enjekte edilen virüs tarafından iletilen floresan markörlerin retinal pigment epitelyumundaki ekspresyonunu göstermek için immünofloresan mikroskopi kullanılır. Bu, viral vektörlerin retinal pigmente subretinal enjeksiyonu için kolay ve etkili bir tekniktir.Subretinal enjeksiyon testlerini uygulamak zor olduğu için, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Yeni başlayanlar için: İlk olarak, etilen oksit gazı kullanılarak sterilize edilmiş 33 gauge küt uçlu iğneye sahip bir mikrolitre şırınga hazırlayın.Ardından, bir mikro santrifüj tüpünde, PBS içerisinde mikrolitre başına yaklaşık 1 milyon titer birimi olacak şekilde viral vektör seyreltisini hazırlayın. Şırıngayı doldururken, şırıngadaki tüm ölü boşlukları gidermek için onu çözeltiyle birkaç kez yıkayın. Viral vektör enjeksiyonu için 1,5 ila 2 µL hacminde çözeltiyi enjekte etmeye hazır hale getirin.Yetişkin fareyi, intraperitoneal yolla lent diazepam ve salin enjekte ederek anesteziye hazırlayın ve reflekslerin yokluğu ile hayvanın anestezi altında olduğunu doğrulayın. Anestezi onaylandıktan sonra, 0,5% fenilefrin ve 0,5% ide ile bir damla damlatarak pupillaları dilate edin. Şimdi bir operasyon mikroskobu altında, göz kapağını açın ve ekvatoru açığa çıkarmak için gözü dışarı doğru itin.Parmaklarınızı orbital rimin dışına yerleştirerek gözü bu pozisyonda tutun. Ardından, kornea yüzeyine oftalmik viskoelastik solüsyon uygulayın ve korneanın üzerine küçük yuvarlak bir lam yerleştirin. Böylece retina, sağ gözde limbusun hafifçe posteriorunda ve inferiorunda, sol gözde ise superiorunda görüntülenebilir.Geçici veya nazal olarak yerleştirilmiş küçük bir delik açmak için steril 30 gauge yarım iğne kullanın. Delikler, kapatılmaları zor olduğu için iyi seçenekler değildir. Delme işlemi sırasında limbal damara veya lensle temas etmeyin ve subretinal enjeksiyonlar için iğnenin tüm gövdesini yerleştirmeyin.Vektör enjeksiyon iğnesini, iris düzlemine 45 derecelik bir açıyla delikten içeri yerleştirin. İğneyi posterior yönde peripapiller alana doğru itin. Vitreus boşluğunu geçmek için belirlenen yolu takip edin.Hafif bir direnç hissedilene kadar iğneyi subretinal boşluğa yaklaştırın; bu direnç, RPE tabakasına ulaşıldığını gösterir. İğnenin potansiyel subretinal boşluğa yerleştirilmesi gerektiğinden, aşırı basınç uygulayarak skleral dokunun delinmemesine dikkat edin. Eğer iğne aşırı kuvvetle skleral dokuyu delerse, dirençle karşılaşmadan ekstraoküler orbital boşluğa girer. Şimdi viral vektörü subretinal boşluğa yavaşça enjekte edin.Doku hasarını önlemek için iğneyi çok sabit tutun; bu nokta oldukça önemlidir. Ardından iğneyi aynı derecede nazikçe geri çekin. Artık göz küresi serbest bırakılabilir.Vektör birikimine işaret eden subretinal kabarma görünür olmalıdır. Son olarak, enjeksiyon bölgesini kapatmak için göz kapağını nazikçe kapatın. Deliğin kendiliğinden kapanması gerçekleşecektir.Gen aktarımını değerlendirmek için, fareleri karbondioksit asfiksisi ile sakrifiye edin ve ötanazinin gerçekleştiğini onaylayın. Gözleri makas kullanarak enükle edin. Gözleri 4 °C'de %4 PFA içinde en az bir saat, ancak tercihen birkaç gün boyunca fikse edin.Korneayı pens ve mikro makas kullanarak kavrayın ve delin. Ardından, korneayı çıkardıktan sonra korneayı tamamen uzaklaştırmak için limbus boyunca kesin. Lensi çıkarmak için pens kullanın.Ardından, siliyer cismi kesin. Daha sonra, retina çıkarıldıktan sonra tüm retinayı RPE Koroid Sklera kompleksinden ayırarak çekin. Kompleksi, periferden optik sinir yakınındaki merkeze doğru radyal olarak kesin; böylece dört ila sekiz adet pedal benzeri şekil oluşturarak yapıyı montaj için düz hale getirin.Şimdi, kompleksi RPE tarafı aşağı gelecek şekilde ters çevirin ve kaslar, konjonktiva ve optik sinir dahil olmak üzere sklera tarafındaki kalan tüm dokuları kesin. Bu işlem, cam lam üzerinde daha düz bir RPE Kort sklera kompleksi düz montajı sağlar. Fazla PBS'yi emici bir süngerle çekin.Yaklaşık 30 µL mountlama medyumu uygulayın ve kompleksi lamelle kapatın. Görüntüleme yapılmadığı zamanlarda lamı 4 °C'de saklayın. Tanımlanan protokol kullanılarak, hem GFP hem de RFP eksprese eden CMV promotörlü, ticari olarak mevcut LV vektörleri enjekte edilmiştir.10 hafta sonra gözler enükle edildi ve RPE düz montaj lamları hazırlandı. GFP ve RFP sinyal yoğunlukları enjeksiyon bölgesindeki RPE hücreleri arasında farklılık gösterdi ve transduksiyon, enjeksiyon kanının oluştuğu alanla sınırlı kaldı. Büyütmenin dört DX'ten 400 x'e çıkarılması, I patolojisinin daha yüksek çözünürlükle değerlendirilmesini sağladı.Burada gösterilmemiş olsa da, transduksiyon yapılan hücreler enjeksiyondan 36 hafta sonra bile vektör eksprese etmiştir. Bir kez uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde beş dakika içinde tamamlanabilir.Bu prosedür uygulanırken, iğnenin geliştirilmesinden sonra subretinal boşluğa yaratıcı ve dikkatli bir şekilde yerleştirilmesinin önemli olduğu unutulmamalıdır. Bu teknik, oftalmoloji alanındaki araştırmacıların doğumsal monojenik kalıtsal patiler ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu tedavisi için gen terapisini keşfetmelerine zemin hazırlamıştır.

limbal-approach-subretinal-injection-viral-vectors-for-gene-therapy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu cerrahi teknik fare gözün subretinal boşluk içine gen terapisi vektörleri ve kök hücrelerinin enjeksiyonu göstermektedir.

Fare Göz içine Gen Terapisi Vektörler ve Kök Hücre Subretinal Enjeksiyon

Kaynak: Park, S. W., et al. Farelerde Gen Tedavisi için Viral Vektörlerin Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyonu Retinal Pigment Epiteli. J. Vis. Uzm. (2015)Video, bir fare modelinde viral vektörlerin retina pigment epiteline (RPE) subretinal enjeksiyonu için yöntemi açıklamaktadır. Anestezi ve göz hazırlığından hassas lentiviral vektör dağıtımına kadar prosedürü detaylandırarak RPE'de gen entegrasyonunu ve ekspresyonunu sağlar.

Bir Fare Modelinde Viral Vektörlerin Retina Pigment Epiteline Subretinal Enjeksiyonu

Burada, sıçanlarda ve farelerde bir RPE hücresi bolusunu subretinal olarak enjekte etmek için multimedya formatında topluluk tarafından kabul edilen bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, retinal dejenerasyonun hayvan modellerinde implantasyon üzerine aşılanmış RPE hücrelerinin kurtarma potansiyellerini, güvenlik profillerini ve hayatta kalma kapasitelerini belirlemek için kullanılabilir.

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

Subretinal enjeksiyonlar, proteinler ve viral vektörler gibi büyük terapötik ajanları fotoreseptörlere ve retina pigment epiteline iletmek için en yaygın tekniktir. Farelerde, minimum ikincil hasar ve hızlı iyileşme süreleri ile subretinal boşluğu başarılı bir şekilde hedefleyen alternatif bir yöntem burada açıklanmaktadır.

Subretinal Space erişim için bir alternatif ve Onaylı Enjeksiyon Yöntemi<i&gt; yoluyla</i&gt; Bir transkleral Posterior Yaklaşım

Burada biz kendi alansal kapsama değerlendirmek ve photoreceptor canlılık karakterize subretinal boşluğa gen terapisi ajanların teslim yardımcı olmak üzere yüksek çözünürlüklü spektral alanlı optik koherens tomografi (HR-SD-Ekim) kullanarak yeni bir yaklaşım göstermek.

Ultrahigh çözünürlük fare optik koherens tomografi göz içi enjeksiyon Retina gen terapisi araştırma yardımcı olmak için

Bu yazıda, subkonjonktival enjeksiyon, mikroenjeksiyon iğneleri ile birlikte infüzyon/geri çekilme şırınga pompası ve gaz geçirmez çıkarılabilir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi kullanılarak farelerde oküler dokular için geçerli bir vektör dağıtım yöntemi olarak gösterilmiştir. Bu enjeksiyon sistemi diğer göz içi uygulama yolları için de uyarlanabilir.

Küçük Hayvan Modellerinde Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Subkonjonktival Uygulaması

Koyun gözünde intravitreal enjeksiyonlar, retinaya viral aracılı gen tedavisi vermek amacıyla yapıldı.

Küçükbaş Gözde İntravitreal Enjeksiyonlar

Bu protokol, retina dejenerasyonu olan veya olmayan fare alıcılarında düşük cerrahi komplikasyon oranıyla subretinal hücresel greftleri güvenli ve hassas bir şekilde vermek için transpupiller görme kılavuzluğunda trans-skleral bir yaklaşım sunar.

Retinal Dejenerasyon Fare Modelinde Subretinal Greftlerin Transpupiller Kılavuzluğunda Transskleral Transplantasyonu

Kriyoprezervasyon sonrası hESC kaynaklı fotoreseptör progenitör hücrelerin hazırlanması ve bu hücrelerin rd10 farelerde retina altı verilmesi için ayrıntılı bir protokol tanımladık.

Rd10 Farelerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Fotoreseptör Progenitörlerinin Sub-Retinal Verilmesi

Subretinal enjeksiyonlar, fotoreseptör ve RPE hastalıkları için terapötiklerin klinik öncesi gelişimi için vazgeçilmez bir tekniktir. Farelerde intraoperatif başarı oranlarını artıran ve retina hasarını en aza indiren optimize edilmiş bir transskleral subretinal enjeksiyon tekniğini tanımladık.

Farede Optimize Edilmiş Minimal İnvaziv Transskleral Subretinal Enjeksiyon Tekniği

Öğrenin, farelerde retinal pigment epiteline viral vektörlerle gen tedavisi için subretinal enjeksiyon tekniğini. Bu yöntem, gen aktarımını kolaylaştırarak oftalmoloji araştırmalarına katkı sağlar.

Fareler Retina Pigment Epitel Gen Tedavisi için Viral Vektörler Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyon

Daha fazla video keşfet