Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme Microcystis aeruginosa) Akım Sitometri Kullanımı
29 Ocak 2016
Mikrobiyal popülasyonları genel davranışı dikte edebilir önemli hücre heterojenitesini içerir. Flow sitometri ile Moleküler prob analizi ancak uygulama türler arasında değişir, hücrelerin fizyolojik durumlarını belirlemek. Bu çalışma küçümseyen ya da yanlış pozitif sonuç kayıt olmadan, doğru bir siyanobakteryumdur nüfus içinde hücre ölümlerini belirlemek için bir protokol sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, akış sitometrisi ve moleküler problar kullanarak siyanobakteriyel fizyolojik durumu etkili bir şekilde analiz edebilen bir protokolün nasıl oluşturulacağını göstermektir. Bu protokol, mikrobiyal toplulukların hücre fizyolojisi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu prosedürün ana avantajı, optimize edilmiş bir floresan prob protokolünün, siyanobakterilerin fizyolojik durumlarını tek tek hücre düzeyinde gerçek zamanlı olarak ayırt edebilmesidir.
Bu prosedürü göstermek, Bournemouth Üniversitesi'nde sitometri laboratuvarında çalışan bir doktora öğrencisi olan David Hartnell olacaktır. Deneye başlamadan önce, numune enjeksiyon probuna boş bir hemoliz tüpü yerleştirin. Unlog'u (Tıkanıklığı Kaldır) tıklayın
Ardından akış sitometrisi temizleme işlemini başlatmak için tekrar yıkayın. Geri yıkamanın sonunda, numune enjeksiyon probuna veya SIP'ye iki mililitre ultra saf filtrelenmiş su içeren yeni bir hemoliz tüpü yükleyin ve zaman sınırını 10 ila 15 dakikaya ve sıvı hızını hızlı olarak ayarlayın. Ardından, yeni bir veri hücresi seçin ve arka plan gürültüsünü azaltmak için ilgili floresan ve ışık dağılımı eşiklerini ayarlayın.
Ardından çalıştır'ı tıklayın. Saniyedeki toplam olay üreticinin tavsiyesinden az değilse, iki mililitre dekontaminasyon solüsyonunu iki dakika boyunca hızlı bir şekilde çalıştırın. Ve geri yıkama ve ultra saf su yıkama adımlarını tekrarlayın.
Birincil bir M.aeruginosa monokültürü hazırlamak için, iki mililitre alg ortamı ile karıştırılmış 98 mililitre ultra saf filtrelenmiş suyu, 120 santigrat derecede 20 dakika boyunca 250 mililitrelik bir beherde otoklavlayın. Bir kültür yüksek kararlı durum yoğunluğunda olduğunda, girdaplama ile iki mililitre hücreyi ayırın. Ve sonra hücreleri numune enjeksiyon probunun altına aktarın.
Hücrelerin ışık mikroskobu ile eşit şekilde dağıldığını onaylayın. Ardından, ileri ışık saçılma verilerini kaydetmek için akış sitometresi yazılımında bir histogram grafiği seçin. Verileri x ekseninde bir günlük ölçeğinde görüntülemek için günlüğe kaydet'e tıklayın.
Ayrı bir çıktıda, M.aeruginosa hücrelerinin doğal floresansını kaydetmek için başka bir günlük ekseni histogramı ayarlayın. Ardından, fikosiyanin'i uyarabilen bir ışık kaynağı ve ortaya çıkan floresandan kaynaklanan emisyonları filtreleyebilen bir dedektör seçin. En yüksek çözünürlükte kayıt için, hedef organizmanın çekirdek boyutuna en yakın ayarları seçin.
Ve nispeten yavaş bir akış hızı ayarlayın. Verileri almadan önce, elektronik arka plan gürültüsü veya hücre numunesi kalıntılarının neden olduğu ışık saçılımı ve floresan sinyallerini kapatmak için bir eşik ayarlayın. Ardından yeni bir veri hücresi seçin.
Günlük ölçeğinde ileri ve yan dağılım parametreleriyle bir yoğunluk grafiği oluşturun ve çalıştır'a tıklayın. Şimdi, düşük seviyeli saçılma sinyallerini dışlamak ve yalnızca daha yüksek bağıl floresan fikosiyanin sinyallerini dahil etmek için ileri ışık saçılımı ve doğal floresan saçılma verilerini ileri yan yana saçılma verilerine uygulayın. Ardından, örnek tamamlanana kadar olayları toplayın ve ilk hücre sayısını belirlemek için verileri kullanın.
Moleküler prob hücresi alımını optimize etmek için, önceden hazırlanmış monokültürün yarısını ölü bir kontrol oluşturmak için uygun koşullara maruz bırakın. Kültürün ölümünü doğrulamak için numune mikro ortamındaki varyasyonları kontrol edin. Ve sonra koloni oluşumunu az önce gösterildiği gibi ayırın.
Ardından, yeşil ve turuncu nükleik asit problarından floresan kaydedebilen bir dedektörün yanında 488 nanometrelik bir lazer seçin. Ve fikosiyanin sinyallerini kendi dedektörleri aracılığıyla kaydetmek için 640 nanometre lazer. Yeni bir veri sayfasında, ileri ve yan saçılma parametreleriyle bir yoğunluk grafiği oluşturun.
Ardından, ilgili moleküler prob optik dedektör kanalını kullanarak bir histogram oluşturun. Fikosiyanin emisyonlarını tespit etmek için bir histogram ve ileri saçılma olayları için bir histogram, tümü bir günlük ölçeğinde. Siyanobakteri örneklerini farklı konsantrasyonlar ve inkübasyon süreleri kullanarak çalıştırın.
Yalnızca hedef organizmanın hücre boyutuyla ilgili olayları dahil etmek için ileri dağılım histogramında bir geçit oluşturun. Ve ilgili floresan prob kanalına uygulayın. Ardından, floresan prob kanalında, histogramdaki en yüksek tepe noktasına karşı başka bir kapsayıcı yazılım kapısı oluşturun.
Ve daha sonra karşılık gelen pozitif prob floresansını yoğunluk grafiğine geçirin. Floresan sinyallerinin sayısını, spesifik olmayan boyama üretmeyen hücre nükleik prob alımının en yüksek yüzdesinin bulunduğu ölü kontrol hücrelerinin sayısıyla karşılaştırın. İçsel veya spesifik olmayan hücre boyamadan kaynaklanan floresan girişim örtüşmesini test etmek için, yüzde 50 canlı ve yüzde 50 ölü karışık kültür verilerini seçin.
Ve floresan kapıları çıkarın. Phycocyanin kanal histogramına hedef organizmanın hücre boyutu için yalnızca ileri saçılma histogramını dahil etmek için kapılar uygulayın. En yüksek ve en düşük fikosiyanin zirvelerini kapılamak ve bunları sırasıyla canlı' ve ölü olarak etiketlemek.
Daha sonra kapıları canlı ve ölü fikosiyanin sinyallerine ayrı ayrı uygulayın. Ve her iki ortalama dalga boyunu da kaydedin. Protokol hassasiyetini belirlemek için, pozitif ölü moleküler prob floresansının ortalama dalga boylarını ve içsel spesifik olmayan canlı sinyali oranlayın.
Son olarak, spesifik olmayan lekelenme meydana gelmeden en yüksek miktarda ölü hücrenin boyandığı optimize edilmiş protokolü seçin. Bu grafiklerde, üstel fazdaki bir M.aeruginosa toplu kültürünün hücresel boyutu ve iç karmaşıklığı için temsili ön ve yan ışık saçılma çıkışları gösterilmektedir. Geçitleme, ileri ışık saçılma çıkışının belirli noktaları arasındaki verilerin rafine edilmesiyle gerçekleştirilebilir.
Phycocyanin, kırmızı bir ışık kaynağı tarafından sorgulandığında güçlü bir sinyal üretir ve bu, ilgilenilen popülasyonları daha fazla kapı yapmak için kullanılabilir. İleri ışık saçılımı ve floresan sinyallerden, veriler daha sonra orijinal çıktıdan, nihai hücre sayımları için M.aeruginosa numunesindeki spesifik verilere aktarılabilir. Canlı yüksek pigmentli ve ölü düşük pigmentli kontroller karıştırıldığında, otomatik floresanstaki azalan kayma belirginleşir.
Membran baskılanmış hücrelerde, nükleik asit probları, akış sitometrisi ile gözlemlenebilen ve ayrıca epifloresan mikroskobu ile doğrulanabilen ek bir sinyal üretir. Canlı ve ölü hücreler arasındaki floresan ayrımı, 0.05 ve 0.5 mikromolar konsantrasyonlar arasındaki zamanla artar, ancak her iki prob için bir ve 100 mikromolar konsantrasyonlar arasında azalır. Gerçekten de, yeşil nükleik asit probu için optimal konsantrasyon, 30 dakikalık bir inkübasyon süresi ile 0.5 mikromolar gibi görünmektedir.
Turuncu nükleik asit probu için optimal konsantrasyon, 10 dakikalık bir inkübasyon için bir mikromolardır. Bir kez ustalaştıktan sonra, her moleküler prob için, uygun şekilde gerçekleştirilirse optimizasyon bir günde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, probları uygun sıcaklık, pH ve ışık koşulları altında sabit bir ortamda tutmayı unutmamak önemlidir.
Geliştirilmesinden sonra bu teknik, mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların fitoplanktondaki topluluk heterojenliğini keşfetmelerinin yolunu açtı. Videoyu izledikten sonra, artık akış sitometrisi ve moleküler problar kullanarak hücresel fizyolojiyi değerlendirmek için en uygun protokolün nasıl geliştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Moleküler problar ve toksik organizmalarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun PPE'yi giymek ve COSHH materyallerini tam olarak anlamak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, akış sitometrisi ve moleküler problar kullanarak siyanobakterilerin fizyolojik durumlarını analiz etmek için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, mikrobiyal popülasyonlar içindeki hücre ölümlülüğünü doğru bir şekilde belirlemi ve hücre heterojenliği ile ilgili zorlukları ele almayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Hücre Biyolojisi
- Akış Sitometrisi
Arka Plan
- Mikrobiyal popülasyonlar önemli hücre heterojenliği sergiler.
- Akış sitometrisi fizyolojik durumları değerlendirebilir ancak türlere göre değişir.
- Hücre ölümlülüğünün doğru ölçümü, mikrobiyal toplulukları anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Optimize edilmiş floresan problar, bireysel hücre düzeyinde analizi geliştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Siyanobakteri fizyolojisini değerlendirmek için güvenilir bir protokol geliştirmek.
- Hücre ölümlülüğü tayininin doğruluğunu artırmak.
- Siyanobakterilerde fizyolojik durumların gerçek zamanlı analizini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre analizi için akış sitometrisi.
- Fizyolojik durumları ayırt etmek için moleküler problar.
- Doğru sonuçlar için protokol optimizasyonu.
- Bir sitometri laboratuvarında doktora öğrencisi tarafından gösterim.
Ana Sonuçlar
- Protokol, siyanobakterilerdeki fizyolojik durumları etkili bir şekilde ayırt eder.
- Hücre ölümlülüğünün doğru tayini sağlandı.
- Gerçek zamanlı analiz, mikrobiyal davranış hakkında içgörüler sağladı.
- Sonuçlar, siyanobakteri popülasyonlarının anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Sonuçlar
- Geliştirilen protokol, siyanobakteri fizyoloji analizini geliştirir.
- Önceki hücre ölümlülüğü ölçüm sınırlamalarını ele alır.
- Bu yöntem çeşitli mikrobiyal çalışmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of cellular viability in microbial systems supports early-stage target validation by enabling reliable phenotypic screening and mechanistic de-risking. Flow cytometry with optimized molecular probes provides quantitative, single-cell resolution data that improves predictive confidence in lead identification campaigns. This approach addresses heterogeneity challenges in discovery biology, facilitating data-driven go/no-go decisions and reducing late-stage biological risk in antimicrobial or anti-infective pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing viable from non-viable cells in microbial populations.
- Operational Value: Supports functional target validation through membrane integrity assessment using SYTOX Green and SYTOX Orange probes.
- Predictive Value: Optimized probe concentrations (0.5 µM green, 1.0 µM orange) minimize false negatives and non-specific staining, enhancing assay reliability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible fluorescence readouts for high-throughput compound screening in antimicrobial discovery.
- Quantitative Output: Enables precise measurement of probe uptake as a dependent variable for dose-response modeling.
- Scalability: Protocol optimization in Microcystis aeruginosa provides a transferable framework for other cyanobacterial or microbial systems.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports preclinical modeling of antimicrobial efficacy by quantifying compound-induced mortality in target pathogens.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase viability screening to preclinical validation through consistent, flow cytometry-based endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in lead optimization by providing real-time, single-cell physiological data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by correlating compound treatment with changes in cellular viability.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducibility through optimized probe incubation and concentration parameters.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence measurements enabling statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking membrane integrity readouts to compound mechanism of action.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cytometry platform applicable across microbial targets in anti-infective programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false viability readings through probe optimization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories via defined probe concentrations and incubation times.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of compounds lacking target-specific activity.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds with genuine antimicrobial effects versus assay artifacts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry operation and fluorescence compensation for multi-parameter detection.
- Dependent on access to flow cytometers with 488 nm laser compatibility and appropriate detection channels for SYTOX dyes.
- Necessitates cross-team protocol standardization to ensure consistent probe handling, storage, and application.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to Gram-positive or Gram-negative bacterial models.
- Includes practical limitations such as probe toxicity and the need for biosafety containment when working with toxic organisms like Microcystis aeruginosa.
