Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme

Bu prosedürün genel amacı, akış sitometrisi ve moleküler problar kullanarak siyanobakteriyel fizyolojik durumu etkili bir şekilde analiz edebilen bir protokolün nasıl oluşturulacağını göstermektir. Bu protokol, mikrobiyal toplulukların hücre fizyolojisine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedürün temel avantajı, optimize edilmiş bir floresan prob protokolünün, siyanobakterilerin fizyolojik durumlarını tekil hücre düzeyinde ve gerçek zamanlı olarak ayırt edebilmesidir.

Bu prosedürü, Bournemouth Üniversitesi sitometri laboratuvarında çalışan doktora öğrencisi David Hartnell uygulamalı olarak gösterecek. Deneye başlamadan önce, örnek enjeksiyon probunun üzerine boş bir hemoliz tüpü yerleştirin. Unclog düğmesine tıklayın.

Ardından, akış sitometrisi temizleme işlemini başlatmak için geri yıkama yapın. Geri yıkama işleminin sonunda, iki mililitre ultra saf filtrelenmiş su içeren yeni bir hemoliz tüpünü örnek enjeksiyon probuna (SIP) yerleştirin; süre sınırını 10 ila 15 dakika, akış hızını ise hızlı olarak ayarlayın. Daha sonra, yeni bir veri hücresi seçin ve arka plan gürültüsünü azaltmak için ilgili floresans ve ışık saçılım eşiklerini belirleyin.

Ardından çalıştır (run) düğmesine tıklayın. Saniye başına toplam olay sayısı üreticinin önerisinden az değilse, iki dakika boyunca hızlı modda iki mililitre dekontaminasyon çözeltisi çalıştırın. Ardından geri yıkama ve ultra saf suyla yıkama adımlarını tekrarlayın.

Birincil bir M.aeruginosa monokültürü hazırlamak için, 250 mililitrelik bir beher içinde iki mililitre algal ortam ile karıştırılmış 98 mililitre ultra saf filtrelenmiş suyu, 120 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlayın. Kültür yüksek kararlı durum yoğunluğuna ulaştığında, iki mililitre hücreyi vorteksleyerek ayrıştırın. Ardından hücreleri numune enjeksiyon probunun altına transfer edin.

Hücrelerin eşit şekilde dağıldığını ışık mikroskobu ile doğrulayın. Ardından, ileri ışık saçılım verilerini kaydetmek için akış sitometresi yazılımında bir histogram grafiği seçin. X eksenindeki verileri logaritmik ölçekte görüntülemek için log seçeneğine tıklayın.

Ayrı bir çıktıda, M.aeruginosa hücrelerinin doğal floresansını kaydetmek için başka bir logaritmik eksenli histogram ayarlayın. Ardından, fikosiyanini uyarabilecek bir ışık kaynağı ve ortaya çıkan floresanstan gelen emisyonları filtreleyebilecek bir dedektör seçin. En yüksek çözünürlükte kayıt yapmak için, hedef organizmanın çekirdek boyutuna en yakın ayarları seçin.

Ve nispeten yavaş bir akış hızı ayarlayın. Verileri toplamadan önce, elektronik arka plan gürültüsünün veya hücre örneği kalıntılarının neden olduğu ışık saçılımı ve floresan sinyallerini dışlamak için bir eşik değer belirleyerek kapılama (gate) yapın. Ardından yeni bir veri hücresi seçin.

Logaritmik ölçekte ileriye ve yan saçılma parametreleri ile bir yoğunluk grafiği oluşturun ve çalıştır'a tıklayın. Şimdi, düşük seviyeli saçılma sinyallerini dışlamak ve yalnızca daha yüksek bağıl floresan fikosiyanin sinyallerini dahil etmek için, ileriye yan saçılma verilerine ileriye ışık saçılımı ve doğal floresan kapısını uygulayın. Ardından, örnek bitene kadar olayları toplayın ve başlangıç hücre sayısını belirlemek için verileri kullanın.

Moleküler probun hücre alımını optimize etmek için, önceden hazırlanmış monokültürün yarısını ölü kontrol grubu oluşturmak üzere uygun koşullara maruz bırakın. Kültürün öldüğünü doğrulamak için örnek mikro çevresindeki varyasyonları kontrol edin. Ardından, az önce gösterildiği gibi koloni oluşumunu ayrıştırın.

Ardından, yeşil ve turuncu nükleik asit problarından gelen floresansı kaydedebilen bir detektörle birlikte 488 nanometre bir lazer seçin. Fizyosiyanin sinyallerini ilgili detektörleri aracılığıyla kaydetmek için ise 640 nanometre lazeri seçin. Yeni bir veri sayfasında, ileri ve yan saçılım parametrelerine sahip bir yoğunluk grafiği (density plot) oluşturun.

Ardından, ilgili moleküler prob optik detektör kanalını kullanarak bir histogram oluşturun. Fikosiyanin emisyonlarını tespit etmek için bir histogram ve ileri saçılım olayları için bir histogram oluşturun; tümü logaritmik ölçekte olsun. Siyanobakteri örneklerini farklı konsantrasyonlar ve inkübasyon süreleri kullanarak çalıştırın.

Hedef organizmanın hücre boyutuna sahip olayları dahil etmek için ileri saçılım (forward scatter) histogramında bir kapı (gate) oluşturun. Ardından bunu ilgili floresan prob kanalına uygulayın. Sonrasında, floresan prob kanalında, histogramdaki en yüksek pike karşı kapsayıcı bir yazılım kapısı daha oluşturun.

Ardından, ilgili pozitif prob floresansını yoğunluk grafiği üzerinde kapılayın. Floresans sinyallerinin sayısını, spesifik olmayan boyama oluşturmayan en yüksek hücre nükleik prob alım yüzdesine sahip olan ölü kontrol hücrelerinin sayısıyla karşılaştırın. İçsel veya spesifik olmayan hücre boyamasından kaynaklanan floresans girişim çakışmasını test etmek için, yüzde 50 canlı ve yüzde 50 ölü karışık kültür verilerini seçin.

Ardından floresan kapılarını kaldırın. Sadece hedef organizmanın hücre boyutuna uygun ileri saçılım histogramını içerecek şekilde kapıları fikosiyanin kanal histogramına uygulayın. En yüksek ve en düşük fikosiyanin piklerini kapılayarak bunları sırasıyla 'canlı' ve 'ölü' olarak etiketleyin.

Ardından, kapıları canlı ve ölü fikosiyanin sinyallerine ayrı ayrı uygulayın. Ve her iki ortalama dalga boyunu kaydedin. Protokol hassasiyetini belirlemek için, pozitif ölü moleküler prob floresanının ortalama dalga boyunun, intrinsik spesifik olmayan canlı sinyale oranını hesaplayın.

Son olarak, spesifik olmayan boyama meydana gelmeksizin en yüksek miktarda ölü hücrenin boyandığı optimize edilmiş protokolü seçin. Bu grafiklerde, eksponansiyel fazdaki bir M.aeruginosa parti kültürünün hücre boyutu ve iç kompleksitesi için temsilci ileri ve yan ışık saçılım çıktıları gösterilmiştir. Gating işlemi, ileri ışık saçılım çıktısının belirli noktaları arasındaki veriler rafine edilerek gerçekleştirilebilir.

Fikosiyanin, kırmızı bir ışık kaynağıyla sorgulandığında güçlü bir sinyal üretir ve bu durum, ilgi duyulan popülasyonların daha ileri düzeyde kapılanması (gate edilmesi) için kullanılabilir. İleri ışık saçılımı ve floresan sinyallerinden yararlanılarak, nihai hücre sayımları için orijinal çıktıdan M.aeruginosa örneğine ilişkin spesifik verilere yönelik kapılama yapılabilir. Canlı yüksek pigmentli ve ölü düşük pigmentli kontroller karıştırıldığında, otofloresanstaki azalma yönlü kayma belirginleşir.

Membranı hasarlı hücrelerde, nükleik asit probları akış sitometrisi ile gözlemlenebilen ve epifloresans mikroskobu ile daha sonra doğrulanabilen ek bir sinyal üretir. Canlı ve ölü hücreler arasındaki floresans ayrımı, her iki prob için de 0,05 ve 0,5 mikromolar konsantrasyonlar arasında zamanla artarken, bir ve 100 mikromolar konsantrasyonlar arasında azalmaktadır. Nitekim, yeşil nükleik asit probu için optimal konsantrasyonun, 30 dakikalık inkübasyon süresiyle birlikte 0,5 mikromolar olduğu görülmektedir.

Turuncu nükleik asit probu için optimal konsantrasyon, 10 dakikalık bir inkübasyon için bir micromolar'dır. Uzmanlaşıldığında, her bir moleküler prob için optimizasyon, uygun şekilde gerçekleştirilirse bir gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, probların uygun sıcaklık, pH ve ışık koşulları altında, stabil bir ortamda tutulmasının önemli olduğunu hatırlamak gerekir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların fitoplanktonlardaki topluluk heterojenliğini incelemelerinin yolunu açmıştır. Videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi ve moleküler problar kullanarak hücresel fizyolojiyi değerlendirmek için nasıl optimal bir protokol geliştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Moleküler problar ve toksik organizmalarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini; bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu donanım (KKD) kullanımı ve COSHH materyallerinin tam olarak anlaşılması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.