TiO kullanarak sulu bir ortamda Proteinler ve Hücreler photopatterning

Aşağıdaki deneyin genel amacı, titanyum dioksitin fotokatalitik aktivitesini kullanarak bir hücre kültürü iskelesinin yüzey modifikasyonunu gerçekleştirmektir. Bu işlem, bir cam lamel üzerine ince bir titanyum dioksit tabakası çöktürülerek ve ardından tüm yüzeyi hidrofobik hale getirmek için Octa dessaline ile kaplanarak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, substrat, serum albümin içeren hücre kültürü besiyerine daldırılarak bloke edilir.

Albumin yüzeye absorbe olur ve burayı hücre yapışmasına izin vermeyen bir hale getirir. Ardından, örnek kollajen içeren sulu bir çözeltiye aktarılır ve yüzeyi ışınlamak için odaklanmış bir UV ışığı kullanılır. Bu işlem, kollajen moleküllerinin foto-ışınlanmış bölgeye seçici olarak absorbe olmasını sağlar ve bu bölgeyi hücre yapışmasına uygun hale getirir.

Birden fazla protein veya hücre tipini desenlemek için bu işlem tekrarlanabilir. Bu videoda, PC 12 hücrelerinin yapışkan bölgesinin UV ışınlaması yoluyla nasıl seçici olarak modifiye edilebileceğini gösteriyoruz. Bu yöntem fikri ilk olarak, titanyum dioksit fotokatalizinin, ışık radyasyonu üzerine yüzeydeki organik kirleticileri temizleyen kendi kendini temizleyen cam pencereler şeklinde ticari olarak uygulandığını fark ettiğimizde ortaya çıkmış ve prosedürün uygulanabilirliği laboratuvarımdan bir lisansüstü öğrencisiyle birlikte yürütülerek kanıtlanmıştır.

Örneği doğru tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirmeyi kolaylaştırmak için öncelikle lamine camları elmas kalem ile numaralandırın. Ardından lamine camları önce akan çift distile su altında, sonra 10 dakika boyunca piranha çözeltisine daldırarak temizleyin. 10 dakika sonra, lamine camları sekiz kez çift distile su ile durulayın ve nitrojen akışı altında kurutun.

Ardından, bir radyo frekans püskürtme sistemine titanyum oksit hedef yerleştirin ve ardından temiz lamel camları poliamid bant kullanarak örnek tutucuya sabitleyin, örnek tutucuyu püskürtme odasına yerleştirin ve basınç 2.0 × 10⁻⁴ Pa değerine ulaşana kadar odayı tahliye edin. Sonra, odaya argon gazı verin ve panjur kapalıyken biriktirme basıncını 4.0 mTorr olarak ayarlayın. RF gücünü kademeli olarak 70 W değerine yükseltin.

Ardından, 120 ile 150 nanometre kalınlığında bir film elde etmek için panjuru açın ve 15 dakika boyunca sputter işlemi uygulayın. Bir cam beheri ve pensi 120 °C'de 30 dakika boyunca fırında kurutarak başlayın. Daha sonra, lamelleri bir plazma reaktörüne yerleştirin ve daha hidrofilik bir yüzey oluşturmak için titanyum dioksit yüzeyini 200 W gücünde, dakikada 100 standart santimetre küp oksijen akışıyla beş dakika boyunca oksijen plazması ile işleyin.

Ardından örnekleri çıkarın ve yüzeyin süper hidrofilik olduğunu doğrulamak için çift distile suya daldırın ve yüzeyi nitrojen akışı altında tamamen kurutun. Sonra, örnekleri, kurutulmuş beheri ve pensi nitrojen dolu bir eldiven torbasına taşıyın ve toluende çözünmüş 1 mM Octo desal trichlorethylene çözeltisi hazırlayın. Titanyum oksit üzerinde kendi kendine organize olan bir tek tabaka (self-assembled monolayer) oluşturmak için örneği oda sıcaklığında bir saat boyunca çözeltide bekletin.

Ardından, örneği sırasıyla toluen, aseton, etanol ve son olarak beşer dakika boyunca çift distile su içerisinde yıkayarak tüm fazör moleküllerini uzaklaştırın. Daha sonra örneği taze çift distile su ile dört kez durulayın ve yüzeyi azot akışı altında kurutun.

Kaplamalı lamel delegelerini beş dakika boyunca %70 etanol içinde bekleterek sterilize edin. Ardından örnekleri steril çift distile su ile iki kez durulayın. Sonrasında örneği 35 milimetrelik bir kaba yerleştirin ve iki mililitre PC 12 büyüme besiyeri ekleyin.

Bekleme süresince ortamdaki serum albüminin lamelların yüzeyine tutunması için örnekleri, 37 °C'de, CO2 tamponlu bir inkübatörde en az üç saat inkübe edin. Ters floresan mikroskobunu, önce ark lambasını açarak hazırlayın. Ardından UV filtre küpünü yerleştirin ve objektif lensi 20 x büyütme oranına sahip olanla değiştirin.

Işık yoğunluğunu bir UV yoğunluk ölçer ile ölçün ve santimetrekare başına 200 joule'lük bir doz için ışınlama süresini hesaplayın. Ardından, bir sahne mikrometri kullanın ve alan diyaframını ayarlayarak ışınlanacak bölgenin çapını 200 mikron olarak belirleyin. Üç saatlik inkübasyonun ardından, lamelleri örten medyumu 200 microliters 3.0 milligrams per milliliter Tip dört kolajen ile takviye edin.

Ardından 35 milimetrelik kabı mikroskop tablasına yerleştirin ve çizik izlerini kullanarak mikroskobun odağını örnek yüzeyine ayarlayın. Lamel üzerindeki bir alanı santimetrekare başına 200 joule dozunda UV ışığı ile ışınlayın. Daha sonra besiyerini, NGF içeren ancak Tip 4 kolajen içermeyen iki mililitre taze büyüme besiyeri ile değiştirin ve örneği tekrar inkübatöre yerleştirin.

Kültürlenmiş NGF diferansiye PC 12 hücrelerini 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın ve tüpü 150 ×g hızında dört dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından süpernatanı aspire edin ve bir mililitre büyüme ortamı ekleyin. Hücreleri, hemositometre kullanarak nazikçe pipetleme yaparak yeniden süspande edin.

Hücre yoğunluğunu sayın ve modifiye edilmiş lamel camları içeren 35 mm'lik bir kaba 3,0 × 10⁵ hücre ekleyin. XC2 modifiye yüzey üzerinde bir ila iki günlük kültürün ardından, kabı 37 °C'de, %5 CO2 içeren bir inkübatörde bir ila iki gün boyunca inkübe edin. Hücrelerin lamel camların yalnızca UV ışınlanmış bölgesine tutunduğunu ve burada büyüdüğünü onaylamak için bir mikroskop kullanın.

Ardından, mikroskop yüzey desenleme için ayarlanmışken, kültürlenmiş hücrelerin bulunduğu kaba, kolajenin nihai konsantrasyonu 100 µg/mL olacak şekilde 67 µL tip dört kolajen ekleyin. Kabı mikroskop tablasına yerleştirin ve ışınlama bölgesini mevcut hücre konumunun yanına konumlandırın. Lamelini 200 J/cm² dozunda UV ışığı ile ışınlayın.

Işınlamadan sonra, besiyerini kolajen içermeyen bir besiyeri ile değiştirin ve tek bir örneğin işlemini 30 dakika içinde tamamlamaya çalışarak örneği tekrar inkübatöre yerleştirin. Bu, sputter yöntemiyle biriktirilmiş titanyum dioksit filminin kesit taramalı elektron mikroskobu görüntüsüdür. Gözlemden yola çıkarak, filmin kalınlığının yaklaşık 150 nanometre olduğu tahmin edilmiştir.

Burada ayrıca, biriktirilen titanyum dioksit filminin düzlüğü dikkat çekmektedir. Atomik kuvvet mikroskobu ile yapılan daha ileri analizler, yüzeyin karekök ortalama pürüzlülüğünün yalnızca 0.2 nanometre olduğunu ortaya koymuştur. Tip dört kolajen ve çözelti, albüminlerin lazer tarafından yerinden edildiği UV ışınlanmış bölgeye öncelikli olarak absorbe olur.

Bu yaklaşımın çok yönlülüğünü göstermek için, fibrin gibi diğer proteinler de aynı teknik kullanılarak desenlenmiştir. Burada hücreler, lamelin XC iki desenli bölgesinde ve hemen yanlarında, noktalı çizgi ile tanımlanan alanda büyümektedir. Lamel yakın zamanda in situ iki şeklinde UV ışınlamasına maruz bırakılmış ve tip dört kolajen ile kaplanmıştır.

Sonraki beş gün boyunca hücreler, yeni kodlanmış bölgeyi kaplamak için çoğalır ve göç eder. Burada sunulan prosedür, kültür altındaki hücreleri rastgele manipüle etmek ve potansiyel olarak karmaşık ko-kültür sistemleri oluşturmak için birden fazla hücre tipini desenlemek amacıyla kullanılabilir.