Incelenmesi Protein Fonksiyonu ve Antikor Girişim ve üç boyutlu Rekonstrüksiyonunda tarafından değiştirilmiş Protein Ekspresyonu Rolü

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein fonksiyonlarını ve değişmiş protein ekspresyonunun rolünü verimli ve sıkı bir şekilde kontrol edilen bir şekilde incelemektir. Bu, hücre için mevcut olan fonksiyonel protein miktarını azaltmak için antikorlar uygulanarak elde edilir. Bunu başarmak için, antikorlar, hücresel zarlar boyunca bir geçişe aracılık eden Chariot adlı bir peptide bağlanır.

Daha sonra, tedavinin etkilerini değerlendirmek için ilgilenilen hücresel yapılar görüntülenir ve 3D olarak yeniden yapılandırılır. Sonuçlar, Chariot peptitlerinin, antikor etkileşimi ile nükleer proteinleri hedeflemek için özellikle uygun olduğunu ortaya koymaktadır. Bu tekniğin RNA interferansı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, hücreye taşınan antikorların hemen etkili olması ve araştırmacının antikor dozajlarını ayarlayarak girişim derecesini sıkı bir şekilde kontrol edebilmesidir.

Bu yöntem birçok hücre tipinde protein fonksiyonları hakkında fikir verebilse de, tedavilere çok duyarlı olan ancak Chariot çok iyi tolere eden birincil nöronal kültürlerdeki proteinleri hedeflemek için özellikle ilginçtir. Hazırlık olarak, liyofilize Chariot peptit tozunu steril suda mikrolitre başına iki mikrogram olarak yeniden süspanse edin. Tozu çözeltiye karıştırmak için tüpe dikkatlice dokunun.

Daha sonra küçük çalışma alikotları hazırlayın, her reaksiyon için sadece iki mikrolitre gerekir ve alikotları 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, memeli hücrelerini, yarım mililitre antibiyotik içeren 24 oyuklu bir plakaya tohumlayarak transfeksiyon için hazırlayın. Nöronları kullanırken, hücreleri yalnızca iki merkezi sırada ve düşük yoğunlukta tohumlayın.

Boş kuyular daha sonra faydalıdır. Hızlı ol. Kültürlenmiş nöronlar inkübatörden birkaç dakikadan fazla çıkmamalıdır.

Nöronlar istenen gelişim aşamasına gelene kadar, haftada iki kez ortamlarının yaklaşık dörtte biri ila yarısını değiştirin. Nöronal olmayan kültürler, hücreler% 50 birleşim noktasındayken kullanılmalıdır. Altı test ve altı kontrol numunesi için aşağıdaki prosedür gösterilmiştir.

Her kargo için, numune başına 50 mikrolitre 1X PBS'de 0,1 ila 2 mikrogramlık bir seyreltme hazırlayın. Ön bağlı primer ve sekonder antikorların makromoleküler kompleksleri de kargo olarak kullanılabilir. Çözeltiyi hafif bir girdapla karıştırın, ardından kısa bir santrifüjleme yapın.

Daha sonra, her reaksiyon için iki mikrolitre Chariot stok çözeltisini 50 mikrolitre PBS ile seyreltin. Chariot'un kendi kendine birleşmesini önlemek için her numune için ayrı tüpler kullanın. Şimdi, hazırlanan proteinleri Savaş Arabası dilüsyonlarında birleştirin.

Kombine proteinleri karıştırın ve döndürün. Chariot kargo komplekslerinin oluşumuna izin vermek için numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Optimal protein peptit miktarı, kargoya ve kullanılan hücre tipine bağlıdır.

Bu nedenle, bu miktar ampirik olarak belirlenmelidir. Önceden, hiçbir katkı maddesi içermeyen bazı büyüme ortamlarının yanı sıra 0,5 milimolar magnezyum klorür ve kalsiyum klorür içeren 1X PBS'yi 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Şimdi, başlamak için, hazırlanan Savaş Arabası komplekslerini 100 mikrolitre ortamla seyreltin.

Ortamı kaplanmış hücrelerden çıkarın ve yeniden kullanım için boş kuyucuklara aktarın. Daha sonra hücreleri 500 mikrolitre önceden ısıtılmış 1X PBS, kalsiyum, magnezyum klorür çözeltisi ile nazikçe yıkayın. Savaş Arabası komplekslerini taşıyan ortamı hücrelere uygulayın ve çözeltinin eşit dağılımını sağlamak için plakayı hafifçe sallayın.

Hücreleri hızlı bir şekilde inkübatöre geri koyun ve öncesinde bir saat bekleyin. Nöronlar için, bir saatlik inkübasyondan sonra, kaydedilen ortamı kuyulara aktarın. Diğer tüm hücreler için,% 10'luk bir son konsantrasyona serum ekleyinKültürlenmiş nöronlar, ortam sıcaklığındaki ve pH'daki değişiklikler gibi çok hassastır.

Bu nedenle, bu hücreler önceden ısıtılmış solüsyonlarla nazikçe yıkanmalı ve transfekte edilmeli ve mümkün olan en kısa sürede inkübatöre geri gönderilmelidir. Transfekte edilen kargoya ve hücre tipine bağlı olarak inkübasyona gerektiği kadar devam edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri her zamanki gibi sonraki analizler için işleyin.

Fiksasyon protokolleri ve canlı görüntüleme bu teknikle uyumludur. 63X lensli bir lazer tarama mikroskobu kullanarak, ağartmayı önlerken yeterli ayrıntıya sahip Z yığınları elde etmek için yaklaşık 0,25 ila 0,5 mikron mesafeden görüntüler alın. Kesin katman mesafesi, yeniden inşa edilecek yapının boyutuna bağlıdır ve ayrı ayrı belirlenmesi gerekir.

Görüntü yeniden yapılandırması için LSM dosyalarını Imaris'te açın. Bu yazılımla, Escape düğmesi Seç ve Gez arasında geçiş yapmak için kullanılır. Ayrıca, Control tuşu basılı tutularak birden fazla nesne seçilebilir.

Ekran Ayarını kullanarak her kanala gidin ve en parlak yapılar doygunluğa ulaşana kadar kontrastı ayarlayın. Bu ayar yüzey yapısını etkilemez, ancak görüntünün eşiklenmesine yardımcı olur. Yeniden oluşturulacak nesne farklı dosyalarda bulunuyorsa, ilgili dosyaları birleştirmek için Düzenle ve Dilim Ekle işlevini kullanın.

Ardından, Yeni Yüzeyler Ekle simgesine tıklayın ve Yalnızca bir İlgi Bölgesini Segmentlere Ayır'ı seçin. Şimdi, seçim kutusunun kenar boşluklarını ilgilenilen nesneye uyacak şekilde ayarlayın. Gerekli tüm yapılar kutunun içine gelene kadar dikdörtgen şeklin şeklini ve eğimini ayarlayın.

Seçimin her görüntüde tüm Z düzlemi boyunca ayarlanması gerekir. İstenmeyen nesneler daha sonra kaldırılabilir. Ardından, uygun bir kanal seçin.

Devam etmek için, ilgilenilen yapıyı yeniden oluşturmak için eşikleme aracını kullanın. Yüzey alanı detay seviyesi veya küre çapı, yeniden inşa edilen yapılarla eşleşecek şekilde ayarlanmalıdır. Sinyal özelliklerine bağlı olarak, mutlak yoğunluk veya yerel kontrast kullanılabilir.

Genel olarak, yerel kontrast dağınık sinyaller için daha iyi çalışır. Bu sinyalin özellikleri nedeniyle, çekirdeğin içindeki proteini yeniden yapılandırmak için yerel kontrast kullanılır. Her durumda, ayarların her bir sinyal veya ilgilenilen yapı için ayrı ayrı ayarlanması gerekir.

Ekranın altındaki yeşil oka tıklayarak yeniden yapılandırmayı tamamlayın. Ardından, Kurşun Kalem aracını kullanarak nesneyi daha fazla ayarlayın. Rekonstrüksiyonları orijinal sinyalle dikkatlice karşılaştırın ve Kesme aracının amacına doğru bir şekilde hizmet edebilmesi için görüntüleri gerektiği gibi eğerek yüzeyleri kesin ve çıkarın.

Şimdi, İstatistikler, Ayrıntılı istatistikler ve Ortalama Değerler'i seçerek her yüzeyin hacmini, alanını ve yoğunluklarını ölçün. İstenirse, ilgili yüzeyin Renk sekmesi seçilerek ve seçilen seçenek Taban'dan İstatistik Kodlu'ya değiştirilerek renk kodlu istatistikler üretilebilir. Anlık Görüntü Al aracı kullanılarak, resimler yayınlanmak üzere çekilebilir.

Aynı bölgedeki birkaç nesne yeniden oluşturulacaksa, bilgileri kaydetmek için Parametreleri Sakla işlevi kullanılabilir. HEK293 hücrelerinde eksprese edilen Simiate, Chariot peptitleri tarafından hücrelere taşınan Simiate antikorları tarafından spesifik olarak tespit edildi. Simiate antikor toplulukları, uygulamayı takiben çekirdeğin yanı sıra soma'ya da girer ve burada sarı oklarla işaretlendiği gibi spesifik olarak FLAG-Simiate ile birlikte lokalize olurlar.

Doza bağımlı bir şekilde, Simiate antikorları HEK293 hücrelerinde masif apoptozu indüklerken, kontrol antikorlarının hiçbir etkisi olmamıştır. Nöronal hücrelerin toksik etkilere karşı çok hassas olduğu göz önüne alındığında, teknik, sahte veya tedavi edilmemiş ve Savaş Arabası ile tedavi edilen hücreleri karşılaştırırken nöronların canlılığı üzerinde hiçbir etkisinin olmadığı birincil hipokampal kültürlere uygulandı. Aynı uygulama şemasını takiben, keçi anti-kobay Alexa568 antikor toplulukları, somata ve çekirdeklerde meydana geldikleri hücrelerin yaklaşık% 83'ünde çeşitli derecelerde görülmüştür.

Bu gözlemler, HEK293 hücrelerinden elde edilen sonuçlarla tutarlı olan bir 3D analiz ile daha da desteklendi. Bu nedenle, Chariot tekniği, ayrışmış birincil hipokampal nöronları transfekte etmek için başarıyla kullanılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç ila altı saat içinde yapılabilir.

Savaş Arabası'nın karmaşık oluşumu ve ilgilenilen protein yaklaşık 40 dakika sürer. Hücreleri bu komplekslerle transfekte etmek için, yükün boyutuna ve özelliklerine bağlı olarak 70 dakika ve ek olarak bir ila dört saat sürecektir. Bu prosedürü takiben, bir proteinin işlevini daha ayrıntılı olarak analiz etmek için canlı görüntüleme ve motilite deneyleri, analiz ve elektrofizyolojik kayıtlar gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.