Name: Incelenmesi Protein Fonksiyonu ve Antikor Girişim ve üç boyutlu Rekonstrüksiyonunda tarafından değiştirilmiş Protein Ekspresyonu Rolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Öğrenin, Chariot peptitleriyle antikor girişimi kullanarak primer hipokampal nöronlarda protein fonksiyonlarını ve değiştirilmiş protein ekspresyonunun rolünü incelemeyi. Bu yöntem, araştırmacılara protein seviyeleri üzerinde anında etki ve doz ayarıyla hassas kontrol imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

sunulan çalışma Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri tarafından finanse edilerek bölgelerinde desteklenmiştir / RD Kanada ortaklık programının Frajil X Araştırma Vakfı, RD, Üniversite Erlangen-Nürnberg Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung Jerome Lejeune Vakfı RD ve Deutsche Forschungsgemeinschaft gelen RD ve RE. Yazarlar pCMV5-FLAG vektör kullanılabilir hale getirmek için teknik hücre kültürü bakımı ile ilgili yardım yanı sıra Prof. Dr. M. Wegner için Ingrid Zenger&#39;i teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca, özellikle video çekimi de yararlı destek için Nadja Schroeder teşekkür etmek istiyorum.

1. Hazır Çözümler <ol><li> 2 ug / ml bir son konsantrasyona kadar steril H liyofilize aktif motifi toz 2 O yeniden süspanse edin. Karıştırma için dikkatlice dokunun. </li><li> (Örneğin, 12 ul, her biri 2 ul reaksiyon başına zorunludur) az miktar hazırlayın ve -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> Hücreler 2. Hazırlık <ol><li> Bu tür antibiyotikler de dahil olmak üzere, bir 24 yuvalı plaka 500 ul büyüme ortamı üzerinde HEK293 hücreleri veya birincil nöronlar gibi tohum memeli hücreleri. NOT: nöronlar kullanırken, düşük yoğunluklu hücreleri tohum ve 24 plaka sadece iki orta satır kullanın. Her iyi ve böylece inkübasyon (adım 4.2) sırasında orta liman boş muadili olacaktır. nöronlar ele aldığınızda her zaman hücreler bir kaç dakikadan fazla inkübatör dışında tutulur değil emin olun. </li><li> Hücreler uygulama kadar kültür, uygun koşullar altında hücrelerin (nemlendirilmiş% 5 CO2 ve 37 ° C). % 50konfluent. NOT: nöronlar kullanırken, kültür istenilen gelişimsel aşamaya kadar hücreler ulaştı ve uygulamayı değiştirecek. ortamda iki kez% 25-50 haftada. Orta (1 x B27, 5 mM L-glutamin ve 1 x penisilin ve streptomisin içeren; ref 16 karşılaştırın), Neuro temelli vasat. </li></ol> 3. Chariot Kompleks Oluşum <ol><li> reaksiyon başına PBS 50 ul sırasıyla özel hedef veya ilgili antikor, bunun yanısıra kontrol proteini veya kontrol antikoru, 0,1-2 ug seyreltin. NOT: Bu teknik aynı zamanda makromoleküler kompleksleri öncesi bağlı primer ve sekonder antikor (. Cp &#39;Temsilcisi Sonuçlar&#39;, Şekil 1) oluşan çalışır. Mix ve sıkma. </li><li> Her numune için, Chariot kendi aralarında birleşmelerini engellemek için ayrı bir tüp kullanarak PBS, 50 ul 2 ul Chariot stok solüsyonu seyreltin. Mix ve sıkma. </li><li> pipet ile Chariot seyreltme seyreltilmiş POI veya antikor (adım 3.1) aktarınting. Mix ve sıkma. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe karışımı (Chariot-PO kompleksleri oluşturacaktır). </li></ol> 4. Hücrelerin transfeksiyonu <ol><li> Chariot kompleksleri, önceden ısıtılmış bir büyüme ortamı 100 ul (37 ° C, katkı maddeleri) (aşama 3.4) ile seyreltilir. Ortamı çıkarın ve bir kez önceden ısıtılmış 1 x PBS kullanarak hücreleri yıkayın. NOT: nöronlar kullanırken, orta atmayın, bu yeniden yapılacaktır. 37 ° C&#39;de tutun. Yıkama için, PBS, 0.5 mM MgCI2 ve CaCl2 ihtiva eden kullanımı. Öneri: plakasını (adım 4.5) kuluçkaya ederken boş kuyularda ortamı tutmak. </li><li> hücrelere Chariot kompleksi çözeltisi (aşama 4.1) uygulayın ve çözeltinin eşit bir dağılımını sağlamak için yavaşça hücreler sallayın. 1 saat boyunca standart koşullar (adım 2.2) altında hücreleri büyür. % 10 oranında bir nihai konsantrasyona kadar serum ekleyin. nöronlar kullanıldığında, Adım 4.1 orta ekleyin. 1 ila 2 saat daha hücreleri büyütün. NOT:Optimal inkübasyon süresi büyüklüğü ve yük özelliklerine bağlıdır ve tecrübi olarak ayarlanması gerekebilir. Aşağıdaki öneriler bir rehber olarak hizmet edebilir: peptitler için, 1 saat 1-2 saat antikorları için, 2 saat tavsiye ve antikorlar ile nöronların transfeksiyon 4 saat için olan proteinler için, genellikle yeterli olur. </li><li> Her zamanki gibi analiz için işlem hücreleri. Lütfen dikkat: teknik sabitleme protokolleri yanı sıra canlı görüntüleme kullanarak deneyler ile uyumludur. </li></ol> 5. Görüntüleme <ol><li> bir lazer tarama mikroskobu kullanılarak, yaklaşık 0.25-0.5 mikron mesafe kullanarak hücreleri ve / veya ilgi hücre bölümlerinde z-yığınları alır. hassas tabaka mesafesi yeniden inşa edilmesi yapı büyüklüğüne bağlıdır ve ayrı ayrı tespit edilmesi gerekmektedir. </li></ol> 6. İmar <ol><li> Aşağıdaki adımlarda, o tıklayarak birden fazla nesneyi seçmek için, seçmek ve gezinmek, Cntr arasında geçiş yapmak için Esc altını kullanmakn onlara ve shift tuşu nesneleri (krş. 6.10 adım) kesmek için. </li><li> Imaris içinde LSM-dosyasını açın. </li><li> parlak yapıları doygunluk ulaşana kadar her kanal için görüntü Ayarı kullanarak, resim kontrast. Yüzey inşaat etkilemeyeceğini bu ayarlama, sadece görüntü eşikleme de deneyci yardımcı olmak için hizmet ettiğini unutmayınız. </li><li> Yeni Yüzeyler Ekle simgesini tıklayın. Bir sihirbaz açılacaktır. </li><li> Seçin: İlgi Segment sadece bir bölge. Bir sonraki adıma geçin. </li><li> ilgilendiğiniz nesne sığdırmak için seçim kutusunun kenar boşluklarını ayarlayın. Görüntü 3 boyutu vardır akılda ve seçimi de z düzlemde ayarlanması gerektiğini Lütfen ayı. Seçim kutusunun dikdörtgen şekli düzgün ilgi nesnesi eşleşmiyor gerekiyorsa, nesneyi açmak ve / veya gerekli tüm yapılar gömülü kadar kutuyu büyütmek. İstenmeyen nesneler daha sonra kaldırılmış olabilir (cp. 6.10 adım). İlerlemek. </li><li> Uygun ch seçinAnnel. Yüzölçümü Detay Seviyesi veya küre çapı yapıları yeniden düzenlenmesi eşleşecek şekilde ayarlanması gerekir. Sinyal özelliklerine bağlı olarak, Mutlak Yoğunluk veya Yerel Kontrast da kullanılabilir. Genellikle, Yerel Kontrast yaygın sinyalleri için daha iyi çalışır. Herhangi bir durumda, ayarlar, sırasıyla, ilgi konusu her bir sinyalin ya da yapı için ayrı ayrı ayarlanabilir olması gerekir. </li><li> Eşik aracını kullanarak, ilgi yapısını yeniden. </li><li> yeşil ok alt tıklayarak yeniden tamamlamak. </li><li> kesme ve gerektiği gibi yüzeylere kaldırmak için kalem aracını kullanarak daha nesne ayarlayın. Istenilen nesneyi kesmek için görüntüyü, bu nedenle, kuzey-güney yönünde kesilir yatırmak için mümkündür. </li><li> seçme İstatistik, Ayrıntılı İstatistiklere ve Ortalama Değerler her yüzey için hacim, alan ölçümleri ve yoğunluklarını alın. </li><li> Renk kodlu istatistikleri gözlemlemek için (İsteğe bağlı adım) (cp. Şekil 2E </strong&gt; ve F), ilgili yüzey rengi sekmesini seçin ve yerine &#39;Base&#39; ve &#39;İstatistik Kodlu&#39; işaretleyin. Çeşitli seçenekler görüntülenir. </li></ol>

<ol><li>Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSantoro%2C+MR+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22">Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease</a>. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).</li>
<li>Jiang, T. F., Chen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+two+lysosome+degradation+pathways+of+alpha-synuclein+in+Parkinson%27s+disease%3A+potential+therapeutic+targets%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets?</a> Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).</li>
<li>Howlett, D. R., Richardson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+APP+transgenic+mice%3A+a+model+of+Alzheimer%27s+disease+or+simply+overexpression+of+APP%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP?</a> Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).</li>
<li>Carlson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Modification+of+the+Phenotypes+Produced+by+Amyloid+Precursor+Protein+Overexpression+in+Transgenic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice.</a> Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).</li>
<li>Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+mRNA-secapping+regulator+implicated+in+X-linked+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation.</a> Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).</li>
<li>Fukami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+member+of+a+gene+family+on+Xp22.3%2C+VCX-A%2C+is+deleted+in+patients+with+X-linked+nonspecific+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation.</a> Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).</li>
<li>Van Esch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+VCX-A+due+to+NAHR+plays+a+major+role+in+the+occurrence+of+mental+retardation+in+patients+with+X-linked+ichthyosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis.</a> Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).</li>
<li>Sebat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+association+of+de+novo+copy+number+mutations+with+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Strong association of de novo copy number mutations with autism.</a> Science. 316, 445-449 (2007).</li>
<li>Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+edge%3A+a+link+between+gene+expression+levels+and+aggregation+rates+of+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins.</a> Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li>
<li>Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+therapeutics+and+applications+of+microRNAs+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment.</a> Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).</li>
<li>Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+RNA+interference-based+therapeutics+and+application+of+multi-target+small+interfering+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs.</a> Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).</li>
<li>DeVincenzo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise%2C+pitfalls+and+progress+of+RNA-interference-based+antiviral+therapy+for+respiratory+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses.</a> Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).</li>
<li>Fellmann, C., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+RNA+interference+rules+for+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable RNA interference rules for silencing.</a> Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).</li>
<li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).</li>
<li>Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Characterisation+of+Simiate%2C+a+Novel+Protein+Linked+to+the+Fragile+X+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome.</a> PLoS One. 8, e83007(2013).</li>
<li>Derlig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simiate+is+an+Actin+binding+protein+involved+in+filopodia+dynamics+and+arborisation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).</li>
<li>Loudet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-covalent+delivery+of+proteins+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells.</a> Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).</li>
<li>Nagel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+microspheres+as+protein+transduction+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Polymeric microspheres as protein transduction reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).</li>
<li>Selim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-osteoactivin+antibody+inhibits+osteoblast+differentiation+and+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Eukaryot+Gene+Expr%22%5BJournal%5D)">Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro.</a> Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).</li>
<li>Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Rho+GTPase+activity+alleviates+chondroitin+sulfate+proteoglycan-dependent+inhibition+of+neurite+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension.</a> J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).</li>
<li>Watanabe, S., Wakasugi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+function+of+human+neuroglobin+is+correlated+with+its+guanine+nucleotide+dissociation+inhibitor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).</li>
<li>Eguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+nuclear+localization+signal+for+nuclear+transport+of+DNA-encapsulating+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles.</a> J Control Release. 104, 507-519 (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, bir doz tahrik şekilde hücre işlevlerini kontrol protein sentezleme seviyeleri önemini incelemek için bir protokol mevcut. Açıklanan protokol, dolayısıyla hücresel seviyede protein fonksiyonunun ayrıntılı çalışmalar sağlayarak hipokampal nöronlar dahil olmak üzere çeşitli memeli hücre tipleri, protein ekspresyonunun bir ince ayar manipülasyon sağlar. RNA interferans özel hedefleri aşağı regüle etmek için bilinen bir strateji temsil eder, ancak, dezavantajları (cp. 14) sahi...

her canlı organizma kendi gelişimini komuta yanı sıra çevresel sinyallere tepki için protein ifade Sıkı denetim esastır. Bu nedenle, mekanizmaların çok sayıda hassas uygulama tarafından kodlanan her protein ifade düzeyini düzenleyen evrim sırasında icat edilmiştir. ömrünün herhangi bir zamanda herhangi bir ökaryotik hücre içinde mevcut olan 20.000 genler. Protein üretimi farklı aşamalarında yer alarak, düzenleyici mekanizmaların posttranslasyonel modifikasyonlar proteini, taşıma ve bozulma yönüne taşıma kromatin yapısının, transkripsiyonu ve RNA yönetim arasında değişir. Moleküler makine ve değiştirilmiş protein ekspresyon düzeyleri altta yatan de arızaları, kanser ya da zihinsel engelli gibi çeşitli hastalıklar ile ilişkili olduğunu, bu nedenle şaşırtıcı değildir. Nitekim, nöronal gelişim ve memeli beyin fonksiyonlarının olağanüstü karmaşıklığı bakarak, sensiProtein ifadesindeki değişiklikler bu sofistike sistemlerin bilirlik Alzheimer ve Frajil X Sendromu (FXS) gibi Parkinson hastalığı (AH ve PH) yanı sıra otizm spektrum bozukluğu (ASD) dahil olmak üzere birçok tanınmış entelektüel açıkları kendini gösterir. Ikinci hastalığı tek için düzenleyici protein, FMRP (Kırılgan X mental retardasyon Protein) 1-4 kaybına bağlı olan bir çok protein, geniş bir misexpression ile karakterize edilir. Nokta mutasyonları zihinsel engelli olan hastalarda tespit değil iken 5 kapatma mRNA değiştirerek mRNA stabilitesini ve çeviri yönetir Ayrıca, Değişken ücret etkileyen kromozomal yeniden düzenlenmeler bağlantılı x protein A (VCXA), bir protein, son zamanlarda, entelektüel açıkları ile ilişkilendirilmiştir şimdi olduğu gibi 6, 7, gözlenen ruhsal bozuklukları değişmiş VCXA ifadesi ve hedef prote düzensiz ifadesi kaynaklanan düşündürenins. Bu bulgulara, de novo ASD ile ilişkili genlerin kopya sayısı varyasyonları, böylece yüksek veya azalmış protein ekspresyon düzeyleri neden olabileceğini fikrini desteklemektedir, yeni gen duplikasyonlar ve silmeler ASD 8 için önemli bir risk faktörü olduğunun tespit edip araştıran bir çalışma doğrultusunda entelektüel açıkları. Dikkate değer olarak, son araştırmalar başka bir proteinin ifade seviyesi, tam hemen hiçbir güvenlik marjları 9 yüksek protein miktarlarının bir sonucu olarak, toplanmayı önlemek için ayarlanır ilişkin kanıtlar sağlamıştır. Nedenle, daha küçük artışlarla, AD ve PD 9 gibi hastalıkları indüklemek için yeterli olduğu önerilmiştir. Protein ekspresyon kontrol katkıda moleküler makine çeşitliliği bu bulgular ışığında karmaşık bir düzenleme planı desteklemesine rağmen, 5000&#39;den fazla memeli genlerinden 10 ekspresyon seviyesini araştıran bir çalışma göstermiştirdoğa daha cimri düzeni tercih: Proteinlerin hücresel bolluğu ağırlıklı böylece RNA kullanılabilirlik yönetimi esas ince ayar protein ifadesini hizmet ettiğini gösteren, çeviri 10 seviyesinde düzenlenir gösterilmiştir. ilgi proteinlerin dozunu incelenmesi (POI) bu nedenle sadece bir proteinin endojen fonksiyonlarının anlaşılmasında önemli değil, aynı zamanda birçok hastalığın araştırılması ve tedavilerin geliştirilmesine değil. Böylece, son on yıl POI dozajı işlemek için RNA girişimi kullanarak çeşitli stratejiler ilerleyişini gördük. RNA enterferans yaygın protein fonksiyonunu incelemek için kullanılır ve hatta kanser ya da göz hastalıkları tedavi etmek yanı sıra hastalarda 11-13 antiviral tedavileri sürdürmeye klinik çalışmalarda uygulanan olmasına rağmen, bazı zorluklar strateji imkansız hale olabilir ortaya çıkabilir. Örneğin, homoloji ile demonte tahrik tohum sırası compara olduğuble kısa, dolayısıyla teşvik dışı hedef etkileri. Yüksek verimli dizileri nadirdir ve zaman alıcı ve masraflı olabilir sağ dizisini tanımlayan, (14 gözden) seçenekler binlerce arasında bulunan gerekir, ancak o zamandan beri sonuçlar yine hayal kırıklığı olabilir. Alternatif bir strateji doğrudan antikorlar tarafından POI hedef etmektir. Burada, hücresel protein durumunu azaltmak için (Aktif Motif tarafından imal edilmiş), protein taşıyıcı Chariot kullanımını göstermektedir ve üç boyutlu rekonstrüksiyon istihdam knock-down aşağıdaki protein fonksiyonunu incelemek için. Chariot, kendisi 2.8 kDa peptidinin, aktif motifi memeli hücreleri 15 membranları boyunca Servisi peptidler, proteinler ve antikorlar için kullanılır. Chariot-POI kompleksleri, bunun üzerine hidrofobik etkileşimler, kullanan olmayan kovalent makromoleküler kompleksler oluşturarak İÇN ile peptid ilişkilendirir bir endosome-ind hücrelere içselleştirmiş olanependent şekilde. Önemli olarak, Chariot mekik proteinlerin hücre içi lokalizasyonu etkiler de sitotoksik etkilerini uygulamak için veya yük 15 biyolojik aktivitesini etkilediği de işaret etti.

<table><tbody><tr><td>Chariot</td><td>Active Motif</td><td>30025</td><td>mağazası -20 > C</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>21103-049</td><td>37 °C'ye kadar ısınma; C</td></tr><tr><td>1x B27</td><td>Life teknolojilerini</td><td></td> kullanmadan önce <td>17504044 -20 ° C'de saklayın; </td></tr><tr><td>CL-glutamin</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>25030-149</td><td>-20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Penisilin ve Streptomisin</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>-20 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Imaris yazılımı</td><td>Bitplane</td><td>n.a.pahalı</td><td>, ancak eşsiz</td></tr><tr><td>Lazer Tarama Mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

incelenmesi protein fonksiyonu ve antikor girişim ve üç boyutlu rekonstrüksiyonunda tarafından değiştirilmiş protein ekspresyonu rolü

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

protein ekspresyonunun bir sıkı yönetim canlı her organizmada gerekli değil, aynı zamanda hücresel modellerinde protein fonksiyonlarını araştırmak için önemli bir strateji değil sadece. Bu nedenle, son araştırmalar RNA ve antikor enterferans dahil memeli hücre hatları, hatta hayvan modellerinde, protein ifadesini hedef için farklı araçlar icat etti. İlk strateji son yirmi yılda çok dikkat toplamıştır ederken, hücresel membranlar boyunca ve hücre içine antikor kargoların bir translokasyon aracılık peptidler, çok daha az ilgi aldı. Bu yayında olarak, antikor müdahale deneyleri gerçekleştirmek için insan embriyonik böbrek hücrelerinde ve primer hipokampal nöronlar Chariot isimli bir peptit taşıyıcı kullanır ve daha fazla protein işlevi analiz üç boyutlu rekonstrüksiyon uygulanmasını göstermek için nasıl ayrıntılı protokol sağlar. Bulgularımız Chariot muhtemelen nükleer lokalizasyon sinyali, Particula için olduğunu göstermektedirrly soma ve çekirdeğinde bulunan proteinleri hedef için çok uygundur. Primer hipokampal kültürlere Chariot uygularken Enteresandır, reaktif şaşırtıcı derecede iyi ayrışmış nöronlar tarafından kabul edilmesi ortaya çıktı.

Aşağıdaki paragraflarda, POI fonksiyonel demonte gösteren örnek sonuçları Chariot reaktif ve antikor girişim sunulmaktadır kullanarak (Simiate, daha fazla ayrıntı için 16, 17 bakınız). Bulgular Simiate azalmış ekspresyon transkripsiyonel aktivite bozar, ve doz bağımlı bir şekilde, daha yüksek antikor miktarları (&gt; 1 ug antikoru) uygulanması durumunda% 99 üzerinde mortalite oranları ile sonuçlanan, apoptosisi teşvik göstermektedir (Bu keşifler, daha önce yayınlanmış 16). Bur...

Protein ekspresyonunu kontrol etmek sadece yaşayan her organizma için gerekli değildir, aynı zamanda hücresel modellerde protein fonksiyonlarını araştırmak için de önemli bir stratejidir. Sunulan protokol, primer hipokampal nöronlar dahil olmak üzere memeli hücrelerinde antikor girişiminin uygulanmasını gösterir ve protein fonksiyonunun incelenmesinde üç boyutlu rekonstrüksiyonların kullanımını gösterir.

Incelenmesi Protein Fonksiyonu ve Antikor Girişim ve üç boyutlu Rekonstrüksiyonunda tarafından değiştirilmiş Protein Ekspresyonu Rolü

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein fonksiyonlarını ve değişmiş protein ekspresyonunun rolünü verimli ve sıkı bir şekilde kontrol edilen bir yöntemle incelemektir. Bu, hücrenin erişebileceği fonksiyonel protein miktarını azaltmak için antikorlar uygulanarak gerçekleştirilir. Bunu başarmak için antikorlar, hücresel membranlar arasından geçişi sağlayan Chariot adlı bir peptide bağlanır.Ardından, tedavinin etkilerini değerlendirmek amacıyla ilgili hücresel yapıların görüntülemesi yapılır ve 3D rekonstrüksiyonları gerçekleştirilir. Sonuçlar, Chariot peptidlerinin antikor interferansı yoluyla nükleer proteinleri hedeflemek için özellikle uygun olduğunu ortaya koymaktadır. Bu tekniğin RNA interferansı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, hücreye taşınan antikorların anında etkili olması ve araştırmacının antikor dozajlarını ayarlayarak interferans derecesini kesin bir şekilde kontrol edebilmesidir.Bu yöntem birçok hücre tipinde protein fonksiyonları hakkında bilgi sağlayabilse de, özellikle tedavilere karşı çok hassas olan ancak Chariot'u çok iyi tolere eden primer nöronal kültürlerdeki proteinleri hedeflemek için oldukça ilgi çekicidir. Hazırlık aşamasında, liyofilize Chariot peptid tozunu steril su içinde mikrolitre başına iki mikrogram olacak şekilde yeniden süspande edin. Tozun çözeltiye karışması için tüpü dikkatlice vurun.Ardından, her reaksiyon için sadece iki mikrolitre gerekecek şekilde küçük çalışma alikotları hazırlayın ve alikotları 20 °C'de saklayın. Daha sonra, memeli hücreleri, antibiyotik içeren yarım mililitre medyum ile 24 kuyucuklu bir plakaya ekerek transfeksiyon için hazırlayın. Nöronlar kullanıldığında, hücreleri yalnızca orta iki sıraya ve düşük yoğunlukta ekin.Boş kuyucuklar daha sonra kullanışlı olacaktır. Hızlı hareket edin. Kültürlenmiş nöronlar inkübatör dışında birkaç dakikadan fazla tutulmamalıdır.Nöronlar istenen gelişim aşamasına gelene kadar, besiyerlerinin yaklaşık dörtte birini veya yarısını haftada iki kez değiştirin. Nöronal olmayan kültürler, hücreler %50 konfluense ulaştığında kullanılmalıdır. Aşağıdaki prosedür altı test ve altı kontrol örneği için gösterilmiştir.Her bir kargo için, örnek başına 50 µL 1X PBS içinde 0,1 ila 2 µg'lık bir dilüsyon hazırlayın. Önceden bağlanmış primer ve sekonder antikorların makromoleküler kompleksleri de kargo olarak kullanılabilir. Çözeltiyi nazikçe vortex ile karıştırın ve ardından kısa süreli bir santrifüj işlemine tabi tutun.Ardından, her reaksiyon için iki µL Chariot stok çözeltisini 50 µL PBS içinde seyreltin. Chariot'un kendi kendine ilişmesini önlemek için her örnek için ayrı tüpler kullanın. Şimdi, hazırlanan proteinleri Chariot seyreltileriyle birleştirin.Birleştirilen proteinleri karıştırın ve santrifüjleyin. Chariot kargo komplekslerinin oluşması için örneği oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Optimal protein peptid miktarı, kullanılan kargoya ve hücre tipine bağlıdır.Bu nedenle, bu miktar ampirik olarak belirlenmelidir. Önceden, katkısız bazı büyüme ortamını ve 0,5 millimolar magnezyum klorür ile kalsiyum klorür içeren 1X PBS'yi 37 °C'ye ısıtın. Şimdi, başlamak için, hazırlanan Chariot komplekslerini 100 µL ortam ile seyrelttirin.Plakadaki hücrelerin ortamını uzaklaştırın ve yeniden kullanmak üzere boş kuyucuklara aktarın. Ardından hücreleri, önceden ısıtılmış 500 µL 1X PBS, kalsiyum, magnezyum klorür solüsyonu ile nazikçe yıkayın. Chariot komplekslerini taşıyan ortamı hücrelere uygulayın ve solüsyonun eşit şekilde dağılmasını sağlamak için plağı nazikçe sallayın.Hücreleri hızla inkübatöre geri koyun ve devam etmeden önce bir saat bekleyin. Nöronlar için, bir saatlik inkübasyonun ardından, saklanan medyumu kuyucuklara aktarın. Diğer tüm hücreler için, serumu %10 nihai konsantrasyona gelecek şekilde ekleyin. Kültürlenmiş nöronlar, medyum sıcaklığı ve pH değişiklikleri gibi durumlara karşı çok hassastır.Bu nedenle, hücreler önceden ısıtılmış çözeltilerle nazikçe yıkanmalı ve transfekte edilmeli, ardından mümkün olan en kısa sürede inkübatöre geri konulmalıdır. İnkübasyona, transfekte edilen kargoya ve hücre tipine bağlı olarak gerektiği kadar devam edin. İnkübasyonun ardından hücreleri, sonraki analizler için her zamanki gibi işleyin.Fiksasyon protokolleri ve canlı görüntüleme yöntemlerinin her ikisi de bu teknikle uyumludur. Yeterli detayda Z-yığınları elde etmek ve aynı zamanda solmayı (bleaching) önlemek için, 63X objektifli bir lazer tarama mikroskobu kullanarak yaklaşık 0.25 ila 0.5 mikron aralıklarda görüntüler alın. Kesin katman mesafesi, yeniden oluşturulacak yapının boyutuna bağlıdır ve bireysel olarak belirlenmelidir.Görüntü rekonstrüksiyonu için LSM dosyalarını Imaris'te açın. Bu yazılımda, Seç ve Gezin modları arasında geçiş yapmak için Escape düğmesi kullanılır. Ayrıca, Control tuşuna basılı tutularak birden fazla nesne seçilebilir.Ekran Ayarı'nı (Display Adjustment) kullanarak her bir kanala girin ve en parlak yapılar doygunluğa ulaşana kadar kontrastı ayarlayın. Bu ayar yüzey oluşturmayı etkilemez ancak görüntünün eşik değerlemesine (thresholding) yardımcı olur. Yeniden yapılandırılacak nesne farklı dosyalar içinde yer alıyorsa, karşılık gelen dosyaları birleştirmek için Dilimleri Düzenle ve Ekle (Edit and Add Slices) işlevini kullanın.Ardından, Add New Surfaces simgesine tıklayın ve Segment only a Region of Interest seçeneğini belirleyin. Şimdi, seçim kutusunun kenarlarını ilgilenilen nesneye uyacak şekilde ayarlayın. Gerekli tüm yapılar kutu içerisinde yer alana kadar dikdörtgen şeklin boyutunu ve eğimini ayarlayın.Seçimin, Z-düzlemi boyunca her görüntüde ayarlanması gerekir. İstenmeyen nesneler daha sonra kaldırılabilir. Ardından, uygun bir kanal seçin.Devam etmek için, ilgilenilen yapının yeniden oluşturulmasında eşikleme aracını kullanın. Yüzey alanı detay seviyesi veya küre çapı, yeniden oluşturulan yapılarınla eşleşecek şekilde ayarlanmalıdır. Sinyal özelliklerine bağlı olarak, mutlak yoğunluk veya yerel kontrast kullanılabilir.Genel olarak, yaygın sinyaller için yerel kontrast daha iyi sonuç verir. Bu sinyalin özelliklerinden dolayı, çekirdek içindeki proteini yeniden yapılandırmak için yerel kontrast kullanılır. Her durumda, ayarların ilgilenilen her bir sinyal veya yapı için ayrı ayrı düzenlenmesi gerekir.Ekranın altındaki yeşil oka tıklayarak yeniden yapılandırmayı tamamlayın. Ardından, Kalem aracını kullanarak nesneyi daha fazla düzenleyin. Yeniden yapılandırmaları orijinal sinyalle dikkatlice karşılaştırın ve Kes aracının amacına uygun şekilde doğru çalışabilmesi için görüntüleri gerektiği gibi eğerek yüzeyleri kesin ve kaldırın.Şimdi, Statistics, Detailed statistics ve Average Values seçeneklerini belirleyerek her bir yüzeyin hacmini, alanını ve yoğunluklarını ölçün. İstenirse, ilgili yüzeyin Color sekmesi seçilip seçili seçenek Base'den Statistic Coded'a getirilerek renk kodlu istatistikler üretilebilir. Yayınlar için Take Snapshot aracı kullanılarak görseller alınabilir.Aynı bölge içindeki birkaç nesnenin yeniden yapılandırılması gerekiyorsa, bilgileri kaydetmek için Parametreleri Kaydet (Store Parameters) fonksiyonu kullanılabilir. HEK293 hücrelerinde eksprese edilen Simiate, Chariot peptitleri ile hücrelere taşınan Simiate antikorları tarafından spesifik olarak tespit edilmiştir. Simiate antikor düzenekleri, uygulama sonrası soma ile çekirdeğe girmiş ve burada sarı oklarla işaretlendiği gibi FLAG-Simiate ile spesifik olarak kolokalize olmuştur.Simiate antikorları, doz bağımlı bir şekilde HEK293 hücrelerinde masif apoptoz tetiklerken, kontrol antikorlarının herhangi bir etkisi gözlenmemiştir. Nöronal hücrelerin toksik etkilere karşı çok hassas olduğu göz önüne alınarak, teknik, primer hipokampal kültürlere uygulanmış ve mock (sahte) veya işlem görmemiş hücreler ile Chariot ile işlem görmüş hücreler karşılaştırıldığında nöronların canlılığı üzerinde herhangi bir etki saptanmamıştır. Aynı uygulama şeması takip edildiğinde, keçi anti-ginepig Alexa568 antikor düzenekleri hücrelerin yaklaşık %83'ünde görülmüş olup, bunlar hem somalarda hem de çekirdeklerde değişen oranlarda ortaya çıkmıştır.Bu gözlemler, HEK293 hücrelerinden elde edilen sonuçlarla tutarlı olan 3D bir analiz ile daha da desteklenmiştir. Bu nedenle, Chariot tekniği disosiye edilmiş primer hipokampal nöronları transfekte etmek için başarıyla kullanılabilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde üç ila altı saat içinde tamamlanabilir.Chariot ve ilgilenilen proteinin kompleks oluşturması yaklaşık 40 dakika sürer. Hücrelerin bu komplekslerle transfekte edilmesi 70 dakika sürer ve kargonun boyutuna ve özelliklerine bağlı olarak ek bir ila dört saat daha gerektirir. Bu prosedürün ardından, proteinin fonksiyonunu daha detaylı analiz etmek için canlı görüntüleme, hareketlilik analizleri ve elektrofizyolojik kayıtlar gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

studying-protein-function-role-altered-protein-expression-antibody

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Daha fazla protein yarısından elektron mikroskobu görüntüleme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon hem de zor küçük proteinler (moleküler kütle &lt;200 kDa) 'dir. Optimize negatif boyama, yüksek kontrast ve nispeten yüksek çözünürlük (~ 1 nm) farklı fizyolojik koşullar altında, küçük, asimetrik proteinlerin ya da komplekslerin görüntüleri elde etmek için güçlü ve yüksek verimli bir protokoldür.

Optimize Negatif Boyama: Elektron Mikroskobu ile Küçük ve Asimetrik Protein Yapısı incelenmesi için Yüksek verim Protokolü

Bio3D-web kullanılarak protein dizisi-yapı-dinamikleri ilişkilerinin çevrimiçi incelenmesi için bir protokol sunulmuştur.

Bio3D-web ile Protein Dizisi-yapı-dinamikleri İlişkilerinin İncelenmesi

Sunulan iki antikor tabanlı protein-protein etkileşimi araştırma tekniği vardır: ayirt ve immunoprecipitation. Bu teknikler proteinlerin hücresel sinyal yollar roman bileşenleri keşfi ve anlayış protein dinamikleri arasında fiziksel etkileşimleri çalışmak için uygundur.<br...

Protein-protein etkileşimlerinin Autophagy araştırma çalışma

Biz glikoproteinlerin biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonu için yaklaşımlar ile immünglobulin kat biolayer Interferometry, izotermal titrasyon Kalorimetre ve x-ışını kristalografisi tarafından mevcut.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Kütle spektrometresi (MS) yapısı incelenmesi ve makromoleküllerin derlemeler dinamikleri için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Burada, protein kompleksi oluşumu ve ligand sorgulamaya MS tabanlı yaklaşımlar entegre.

Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Burada, nasıl küçük açı X-Ray saçılma (SAXS) düşük çözünürlüklü zarflar makromoleküllerin yapıları temsil eden hakkında bilgi edinmek için kullanılması gereken mevcut. X-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans gibi yüksek çözünürlüklü yapısal teknikleri ile birlikte kullanıldığında, SAXS detaylı yorumlara çok etki alanlı proteinler ve makromoleküllerin kompleksleri çözüm sağlayabilir.

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

Yapısal olarak ilişkili proteinler sık sık farklı Biyolojik işlevleri uygulamak. Eşdeğer chimeric proteinleri oluşturmak için bu proteinler bölgelerinde alışverişi için onların fonksiyonel sapma sorumludur kritik protein bölgeleri tanımlamak için yenilikçi bir yaklaşım oluşturmaktadır.

Fonksiyonel Protein bölgeleri Chimeric Protein inşaat aracılığıyla tanımlaması

Bu protokol, insan sağlığında önemli bir role sahip olan iki model proteinin yapısını ve dinamiklerini araştırmak için kullanılan yöntemleri açıklamaktadır. Bu teknik, protein etki alanları arası hareketlerle ilgili zaman ve uzunluk ölçeklerindeki dinamiklere erişmek için tezgah üstü biyofiziksel karakterizasyonu nötron spin eko spektroskopisi ile birleştirir.

Nötron Spin Yankı Spektroskopisi ile Protein Dinamiğinin İncelenmesi

Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.

Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

Burada, kimyasal problar ve kütle spektrometrisi kullanarak doğal hücrelerden ve dokulardan hastalığa özgü protein-protein etkileşimlerinin yakalanmasını ve tanımlanmasını sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Ortaya çıkan etkileşim veri kümeleri, dinamik ağ işlev bozukluklarını ve hastalıkla bağlantılı yol değişikliklerini ortaya çıkarmak için özel bir web tabanlı platform aracılığıyla analiz edilir.

Hastalıkta İşlevsel Olmayan Protein-Protein Etkileşimlerinin Haritalanması

Öğrenin, Chariot peptitleriyle antikor girişimi kullanarak primer hipokampal nöronlarda protein fonksiyonlarını ve değiştirilmiş protein ekspresyonunun rolünü incelemeyi. Bu yöntem, araştırmacılara protein seviyeleri üzerinde anında etki ve doz ayarıyla hassas kontrol imkanı sunar.

Incelenmesi Protein Fonksiyonu ve Antikor Girişim ve üç boyutlu Rekonstrüksiyonunda tarafından değiştirilmiş Protein Ekspresyonu Rolü (Video) | JoVE Journal

Incelenmesi Protein Fonksiyonu ve Antikor Girişim ve üç boyutlu Rekonstrüksiyonunda tarafından değiştirilmiş Protein Ekspresyonu Rolü

Daha fazla video keşfet